全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-04-21
基金项目:上海市科委资助项目(05ZR14028)
作者简介:罗海兰(1983-),女,在读硕士,研究方向:生物化学与分子生物学;E-mail:kxluo2006@163.com
通讯作者:金坚,Tel:0510-85860236,E-mail:Jinjian31@126.com
蛋白质转导结构域(proteintransductiondomain,PTD)是一类能介导其它大分子进入多种细胞系中的小
分子多肽,富含带碱性氨基酸,TAT是 1988年 Green[1]和 Frankel[2]在 HIV病毒中发现的,具有蛋白质转导功
能的蛋白质,而且研究发现它的转导功能来源于 N端的 11个氨基酸,其序列为 YGRKKRRQRRR。蛋白质
转导结构域(PTD)能使原本不能进入细胞膜或体内的其他生理屏障的蛋白药物安全、有效地到达治疗靶
点,蛋白质转导技术作为基因治疗的一个新方法,有着比传统的方法更安全的优点,使它成为近年来研究
的热点,但在糖尿病治疗方面的报道不多。MafA是最近发现的仅在胰岛 β细胞中表达的转录因子,它作用
于胰岛素基因启动子区的 RIPE3b元件上,在启动胰岛素基因的表达上起着关键性作用。将 TAT蛋白与转
TAT-MafA融合蛋白诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素
罗海兰 1 毋慧玲 2 路君 2 卢大儒 2 沈坤堂 3 金坚 1
(1江南大学生物工程学院,无锡 214122;2复旦大学遗传工程国家重点实验室,上海 200433;
3复旦大学附属中山医院,上海 200032)
摘 要: 借助蛋白质转导技术,利用胰岛β 细胞转录因子MafA诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素,为糖尿病的
治疗提供新的方法。将TAT基因与MafA基因一起插入p32a(+)载体中,构建TAT-MafA融合蛋白原核表达载体,转化
BL21获得表达菌株,经IPTG诱导和Ni柱亲和层析纯化TAT-MafA融合蛋白,用1μM浓度的该融合蛋白孵育IEC-6
细胞12h和24h后,分别进行进胞检测和胰岛素表达检测。实验结果表明,细胞免疫荧光和 Western-blot方法检测到经
TAT-MafA融合蛋白作用12h后的IEC-6细胞中有该蛋白,并经细胞免疫荧光和RT-PCR的方法检测出TAT-MafA作
用24h后的IEC-6细胞中有胰岛素的表达。因此,TAT-MafA融合蛋白可以高效进入小肠细胞系IEC-6细胞,并且进胞后
仍保持MafA原有的生物学活性,能启动胰岛素基因的表达,诱导IEC-6成为胰岛素表达细胞。
关键词: 蛋白质转导 TAT MafA 小肠上皮细胞 胰岛素
TAT-MafAInducingIntestinalEpithelialCelsIEC-6intoInsulin
PositiveCels
LuoHailan1,2 WuHuiling2 LuJun2 LuDaru2 ShenKuntang3 JinJian1
(1SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122;2InstituteofGenetics,FudanUniversity,Shanghai200433;
3ZhongshanHospitalofFudanUniversity,Shanghai200032)
Abstract: Theaim wastousetranscriptionfactorMafA toinduceintestinalepithelialcelsIEC-6intoinsulin
positivecelsbyprotein transduction technology.Prokaryoticexpresion vectorsofTAT-MafA fusion protein was
constructedbyinsertinggenesencodeTATandMafAintop32a(+)vector,andthefusionproteinwasobtained,after
incubatingIEC-6with1μM TAT-MafAfor12hand24h.Theinternalizationoftheproteinwasinvestigatedbyusing
immunostainingandwesternblotanalysis,andinsulinexpresionofIEC-6wasdetectedbyusingimmunostainingand
RT-PCR,respectively.asresults,TAT-MafAinIEC-6wasdctectedafterincubationfor12handinsulinwasdetectedin
theIEC-6afterincubationfor24h.Thus,TAT-MafAcanbetransducedintoIEC-6andbiologicalactivitiescouldbe
retained,toinduceIEC-6intoinsulinpositivecels.
Keywords: Proteintransduction TAT MafA IntestinalepithelialcelsInsulin
2008年第5期
录因子 MafA融合,研究该融合蛋白对小肠细胞 IEC-6的进胞以及进胞后对启动胰岛素表达的作用,为蛋
白质转导技术应用于糖尿病治疗提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌株和质粒 大肠杆菌 DH5α,BL21,质粒 pET-32a(+)均由本实验室保藏.
1.1.2试剂及材料 限制性内切酶,T4连接酶,DNA分子量标准和 DNA回收试剂盒均为 NewEngland
Biolabs公司产品;IPTG为 Genview公司产品;Ni-NTAHis·Band为 QIAGEN公司产品;目的蛋白分析采用复
日科技有限公司凝胶成像分析系统;培养基 DMEM、胰酶、青霉素/链霉素双抗为 GIBCO公司产品,胎牛血
清为兰州民海生物工程有限公司产品。其它试剂均为国产分析纯试剂。
1.1.3 DNA片段的合成及测序 DNA片段的合成及测序由英俊生物公司完成,引物由赛百盛生物科技有
限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 TAT-MafA表达载体的构建 将人工合成上游 5-GGTACCAAGCTTGGCTACGGCCGCAAGAAACGCCG
CCAGCGCCGCCGCGGCGCCATGG-3和下游 5-CCATGGCGCCGCGGCGGCGCTGGCGGCGTTTCTTGCGGCCG
TAGCCAAGCTTGGTACC-3引物退火后用 KpnI和 NocI双酶切,用胶回收小片段酶切产物,将 pET-32a载体
也用限制性内切酶 KpnI和 NcoI双酶切,胶回收酶切产物,按载体片段摩尔比 1:3的比例 T4连接酶 16℃
连接过夜。转化大肠杆菌感受态 DH5α,酶切鉴定阳性克隆,经测序正确的质粒命名为 p-TAT。取小鼠尾巴
1cm,加入 1ml的细胞裂解液 55℃过夜,用份氯仿法抽提 DNA。以 DNA为模板,扩增出 MafA基因,引物序
列为:上游 5CGGGATCCATGGCCGCGGAGCTGGCGATG3下游 5ACGCGTCGACTCACAGAAAGAAGTCGGGTG
C3,用限制性内切酶 BamHI和 SalI双酶切 PCR产物和 T-easy载体,连接同上,挑取阳性克隆,经酶切鉴定
(图 1A),送英俊公司测序,测序正确后的质粒命名为 T-easy-MafA。再用限制性内切酶 BamHI和 SalI双酶
切 T-easy-MafA和 p-TAT,胶回收酶切的 MafA片段和 p-TAT载体,连接过程同上,挑取阳性克隆,PCR鉴定
正确后的质粒命名为 p-TAT-MafA(图 1B)。
1.2.2 基因工程菌的诱导表达 将 p32aTAT-MafA质粒转化感受态大肠杆菌 BL21,获得的表达菌株种子
液后,以 1:100稀释接种于 LB液体培养基中,37℃培养 4h,使其达到对数生长期,OD600值约为 0.8时,加
入 1mM的 IPTG。在 25℃培养诱导蛋白表达 16h。
1.2.3 融合蛋白 TAT-MafA的纯化 诱导的菌液 5000r/min离心,用 3.6ml的 1×Ni-NTA结合缓冲液重悬。
并同时加入 PMSF1mmol/l,DNase5ug/ml和溶菌酶 1mg/ml,冰水浴 60min后超声破碎(破碎 10s,间隔 15s,
超声 20次,输出功率 200~300W)。将超声后的液体在 4℃条件下 12000r/min离心 30min,取制上清 4ml与
1mlNi-NTAHis·Band混合,轻柔混匀(旋转混合器,200r/min),4℃混合 60~120min。将裂解液-Ni-NTAHis·
Band混合物加入空色谱柱中,待流出液放出后,以 2×4ml含 10mmol/l咪唑的 1×Ni-NTA漂洗缓冲液漂洗,
再以 2ml含 150mmol/l咪唑的 1×Ni-NTA漂洗缓冲液进行洗脱,收集穿透峰。用于 SDS-PAGE电泳分析或后
续试验。
1.2.4 小肠细胞系 IEC-6的培养 IEC-6细胞用低糖 DMEM完全培养基培养(DMEM(低糖)+10%胎牛血
清+100"/ml青霉素+100"/ml链霉素),传代时用吸管吸去培养基,用预温 PBS少许轻洗 3遍,弃去 PBS后,
加少许 0.25%胰酶,室温放置数分钟,至显微镜下观察至细胞变圆,弃去胰酶,加少量新鲜培养基终止消
化,轻轻吹打,使细胞团分散,成单个细胞后加入培养基分瓶传代。
1.2.5 TAT-MafA进胞活性研究细胞免疫荧光 将 IEC-6细胞铺在六孔板中,加入 1mmol/l的纯化好的
TAT-MafA融合蛋白,孵育 12h后,用 PBS洗 3次,4%多聚甲醛固定,PBS清洗后经封闭液封闭,加 Histag抗
体(1:1000)4℃过夜,PBS清洗后加带罗丹明标记的二抗,1h后用 DAPI染核,然后到荧光显微镜下观察。
罗海兰等:TAT-MafA融合蛋白诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素 141
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
图 2 TAT-MafA和 TAT蛋白的纯化图 1 A:T-easy-MafA载体的双酶切电泳图
B:PCR鉴定 p-TAT-MafA电泳图
Western-blot将 IEC-6细胞铺在六孔板中,加入 1mmol/l的纯化好的 TAT-MafA融合蛋白,孵育 12h后,
经细胞裂解液裂解,离心取上清,于 10%SDS-PAGE电泳分离后转膜,加入 Histag抗体(1:2000),常温过
夜,TBST清洗后将膜与 HRP标记的二抗反应 50min,TBST清洗后 ECL试剂盒显色。
1.2.6 TAT-MafA进胞后生物学活性研究逆转录聚合酶链(RT-PCR)反应 1mmol/l的纯化好的 TAT-MafA
融合蛋白加入 1铺好的 IEC-6细胞培养液中,与 IEC-6细胞孵育 24h,抽提总 RNA,经反转,得到 cDNA。进
行 RT-PCR检测,Insulin上游引物 5-CAGCACCTTTGTGGTTCTCA-3,下游引物 5-CAGTGCCAAGGTCTGAAG
GT-3产物大小为 167bp。Βactin上游引物 5-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3,5-AGCCATGCCAAATGTCTC
AT-3,产物大小为 349bp。
细胞免疫荧光将 1mmol/l的纯化好的 TAT-MafA融合蛋白加入一铺好的 IEC-6细胞培养液中,与 IEC-
6细胞孵育 24h后用 PBS洗 3次,4%多聚甲醛固定,PBS清洗后经封闭液封闭,加 insulin抗体(1:500)4℃
过夜,PBS清洗后加带罗丹明标记的二抗,1h后用 DAPI染核,然后到荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 TAT-MafA表达载体的构建、鉴定
2.2 TAT-MafA 的纯化
将含 TAT-MafA质粒的基因工程菌经 IPTG诱导表达 16h,经 Ni柱纯化后,SDS-PAGE分析,凝胶成像
分析系统表明,在分子量 60kD左右出现目标蛋白条带(图 2)。
2.3 TAT-MafA的进胞效果
大鼠肠上皮细胞系 IEC-6以 4×105细胞/孔将接种至 6孔板中,孵箱内培养 24h。加入 1μM纯化后的
TAT-MafA融合蛋白,另设空白对照组,在蛋白加入后 12h去除
培养液,用 PBS冲洗,然后用 4%多聚甲醛固定,进行细胞免疫
荧光实验,再用 0.1%DAPI染核。将处理后的 IEC-6细胞放置在
荧光倒置显微镜下观察(图 3)。从图中可以看出,在未加入蛋
白的对照组中,荧光显微镜下没有观察到细胞中有红色荧光。
而在加入 TAT-MafA融合蛋白的 IEC-6细胞中可以看到有红色
荧光聚集在细胞内。
大鼠肠上皮细胞系 IEC-6以 4×106细胞/孔将接种至 6孔
板中,孵箱内培养 24h。加入 1μM纯化后的 TAT-MafA融合蛋
白,另设空白对照组,在蛋白加入后 12h去除培养液,用 PBS冲
洗,用细胞裂解也裂解细胞膜后,离心取上清,Western-blot分
析结果(图 4)。未加蛋白的组没有目的蛋白条带,而加入 TAT-
MafA蛋白的组有目的蛋白条带,以上结果表明 TAT-MafA蛋白可以高效进入小肠上皮细胞系 IEC-6中。
图 3 TAT-MafA蛋白进 IEC-6细胞的
免疫荧光图
A:1μMTAT-MafA孵育 12h后同一视野下经罗丹
明染色、DAPI染色和白光下的 IEC-6细胞
B:未经TAT-MafA孵育的同一视野下经罗丹明染色、
DAPI染色和白光下的 IEC-6细胞
142
2008年第5期
2.4 TAT-MafA进胞后的生物学活性
大鼠肠上皮细胞系 IEC-6以 4×106细胞/孔将接种至 6孔
板中,孵箱内培养 24h。加入 1μM纯化后的 TAT-MafA融合蛋
白,另设空白对照组,在蛋白加入后 24h去除培养液,抽 RNA,
反转录成 cDNA后进行 RT-PCR检验(图 5),与阴性对照组相
比,TAT-MafA处理后的 IEC-6在 150bp左右出现与阳性对照
大小一样的条带。
大鼠肠上皮细胞系 IEC-6以 4×105细胞/孔将接种至 6孔板中,孵箱内培养 24h。加入 1μM纯化后的
TAT-MafA融合蛋白,另设空白对照组,在蛋白加入后 24h去除培养液,用 PBS冲洗,然后用 4%多聚甲醛固
定,进行细胞免疫荧光实验,再用 0.1%DAPI染核。将处理后的 STC-1细胞放置在荧光倒置显微镜下观察。
观察结果(图 6)。与空白组相比,加入 TAT-MafA蛋白的组有胰岛素表达。
图 4 TAT-MafA进入 IEC-6细胞的 Western-
blot检验,采用 Histag抗体
图 5 胰岛素表达的 RT-PCR检测
TAT:经 TAT蛋
白 质 处 理 组 ;
TAT-MafA: 经
TAT-MafA蛋白
质处理组;阳性
对照:正常大鼠
胰 腺 cDNA 的
PCR结果
图 6 胰岛素表达的细胞免疫荧光图
3 讨论
糖尿病是全球最常见的代谢疾病之一,其主要表现形式是高血糖,1型糖尿病中由于自身免疫系统对
胰岛 β细胞进行攻击,导致 β细胞受到严重破坏,从而引起调节血糖的主要激素胰岛素分泌不足,出现高
血糖症状。传统的注射胰岛素的治疗方法存在抗药性性和方便性等问题,以 Edmonton方案为基础的胰岛
移植又受到有限的胰岛来源的制约,在这种情况下,细胞治疗作为一种新的有着诱人前景的糖尿病治疗方
法引起了人们的广泛关注。目前国内外已有许多研究利用病毒载体介导胰腺发育相关基因,如 Pdx1、Ngn3
和 NeuroD/beta2等在体内、体外诱导各种干细胞向胰岛素分泌细胞分化来达到治疗糖尿病的目的[3,4]。然
而,又病毒载体存在潜在的免疫原性、病毒毒性、致突变性等缺点,限制了病毒载体的进一步应用。蛋白质
转导技术作为一个新的基因治疗方法有着更安全的优点,使它成为近年来研究的热点。这项技术已广泛用
于局部缺血,炎症,癌症等疾病治疗的研究中[5],但在糖尿病治疗方面的报道不多。
本试验中,将含大量碱性氨基酸的具有蛋白质转导功能的 TAT蛋白与启动胰岛素表达的关键转录因
子 MafA融合,构建了 pET-32a-TAT-MafA原核表达载体,经 IPTG诱导表达并纯化出带六聚组氨酸的融合
蛋白,将该蛋白与 IEC-6细胞孵育 12h后,用抗 Histag的一抗和带若丹明标记的二抗进行细胞免疫荧光试
验,结果显示纯化出的 TAT-MafA蛋白能高效的进入 IEC-6细胞。western-blot结果进一步证明了该蛋白质
的进胞活性。
MafA是最新发现的一个胰腺发育相关转录因子,是胰腺 β细胞所特有的转录因子属于转录因子 Maf
家族。据报道,它是结合到胰岛素基因启动子区的 C1/RIPE3b保守元件[6]。有试验表明,MafA基因敲除的小
罗海兰等:TAT-MafA融合蛋白诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素 143
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第129页)
4 高风云,张辉,斯钦巴特尔.华北农学报,2007,22(1):129~131.
5 石锐,郭长虹.生物技术,1998,5:41~48.
6 FuYB.CropScience,2005,5:1084~1091.
7 邓欣,陈信波,龙松华.中国麻业,2007,29(4):184~188,238.
8 ZietkiewiczE,RafalskiA,LabudaD.Genomics,1994,20(2):176~183.
9 LiG,QuirosCF.TheorApplGenet,2001,103:455~461.
10 FeriolM,PicoB.TheorApplGenet,2003,107:271~282.
(上接第117页)
4 ZwelduT,LuddersP.JApplBot,1998,72:25~27.
5 GeorgeEF,PlantPropagationbyTissueCulture,Parts1&2.Edington,Wilts,ExegeticsLtd,1996,131~134.
6 ManteS,HB,Tepper.PlantCelTissueandOrganCulture,1983,2:151~159.
7 HalperinW,WetheralDF.Nature,1965,205:519~520.
8 ReinertJ,GoschG.Naturwissenschaften,1976,63:534~535.
9 侯学文,郭勇.广西植物,1998,18(2):168~172.
10 MadhulathaP,AnbalaganM,JayachandranS,SakthivelN.PlantCelTissOrgCult,2004,76:189~191.
11 李哲,黄敬雯,黄霞,等.中山大学学报(自然科学版),2005,44(2):91~93.
鼠将患年龄依赖性的糖尿病,说明 MafA基因在胰岛素的表达中起着重要的作用[7]。
用细胞免疫荧光的方法检测到在 TAT-MafA孵育 24h的 IEC-6细胞中有胰岛素的表达,RT-PCR检测
进一步证明了这一点。这说明 TAT介导的 MafA融合蛋白不但可以高效进入 IEC-6细胞,而且进胞后仍然
保持 MafA原有的生物学活性,启动胰岛素基因的表达。
肠组织是体内干细胞最多的组织之一,它与胰腺在发育上有着共同的来源,都来源于内胚层[8],除此之
外,小肠细胞和胰腺内分泌细胞在分化上的相似性预示着小肠细胞有着被诱导成为胰岛素分泌细胞的可
能。IEC-6是大鼠上皮细胞,具有干细胞特性,国外已有报道将腺病毒载体介导转录因子 PDX-1或 MafA等
作用于 IEC-6细胞,能诱导该细胞成为胰岛素分泌细胞[9,10]。利用蛋白质转导的方法将小肠细胞 IEC-6诱
导成胰岛素表达细胞,为以肠组织作为靶器官,利用蛋白质转导的方法治疗糖尿病提供了理论依据。
参考 文献
1 GreenM,LoewensteinPM.Cel,1988,55:1179～1188.
2 FrankelAD.PaboCO.Cel,1988,55:1189～1193.
3 HideakiK,YoshihisaN,etal.Diabetes,2005,54:1009～1022.
4 KojimaH,NakamuraT,FujitaYetal.Diabetes,2002,51:1398～1408.
5 SchwarzeSR,DowdySF.TrendsPharmacolSci,2000,21:45～48.
6 MartinO,JonathanR,etal.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2002,99:6737～6742.
7 ZhaoL,GuoM,etal.JournalofBiologicalChemistry,2005,280:11887～11894.
8 SlackJMW.Development,1995,121:1569～1580.
9 ShigeruY,YoshitakaKajimoto,etal.Diabetes,2002,51:2505～2513.
10 MatsuokaT,KanetoH,etal.MolecularEndocrinology,2007,21:2764～2774.
144