全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-11-15
基金项目:本研究受国家自然科学基金(项目编号:50773032)资助
作者简介:李静(1983-),山东菏泽人,在读硕士生,研究方向为生物功能材料的制备及应用
通讯作者:朱平,电话:13475323366,E-mail:pzhu99@163.com
前言
作为一种新型材料,细菌纤维素(也称生物纤维素)是近年来生物材料领域研究开发的热点之一。早在
1886年英国科学家 A.J.Brown就发现了细菌纤维素,并对其作了首次报道[1],他在静置条件下培养木醋杆
菌时,发现培养基的气-液表面形成了一层白色的凝胶状薄膜,经过化学分析,确定其成分是纤维素。为了
与其他来源的纤维素相区别,将其称之为细菌纤维素(BacterialCelulose,简称 BC)。然而其后很长一段时
间细菌纤维素的研究都没有取得较大进展。近些年来研究发现细菌纤维素不仅具有合成速度快、产率高等
特点,而且具有许多植物纤维素无法比拟的优良性能,如高纯度、高强度、超细性、强持水能力和透水透气
性等,在医疗、食品、造纸、声音振动膜等领域有着广阔的应用前景。因此研究和开发出低附加值的细菌纤
维素产品将会产生巨大的经济效益和社会效益。但是长期以来,合成细菌纤维素所需的碳源、氮源一般是
是葡萄糖、果糖、蛋白胨、酵母粉等物质,成本较高,因而限制了它的生产和应用。
西瓜是一年生蔓性草本植物,是夏天的主要水果。西瓜汁的主要成分是水分,除此之外还含有大量的
糖类、蛋白质以及各种微量元素和氨基酸,这些都是合成细菌纤维素必不可少的物质。夏季市场上的西瓜
供应丰富,价格低廉,有时甚至大批量的坏掉,若能利用其合成细菌纤维素,将会产生巨大的经济效益。利
用市售西瓜榨汁作为种子及发酵培养基来合成细菌纤维素,取得了满意的结果。
利用西瓜汁合成细菌纤维素的研究
李静 1 朱平 1,2
(1青岛大学“纤维新材料与现代纺织”省部共建国家重点实验室培育基地,青岛 266071;
2绍兴文理学院纺织服装学院,绍兴 312000)
摘 要: 利用木醋杆菌为实验菌种,通过选择不同的种龄、接种量、发酵培养基液面积/液体积、初始pH值、培养
温度和时间,对西瓜汁合成细菌纤维素的发酵条件进行研究,得到了最佳培养条件,并利用扫描电镜、红外光谱、元素分析
等手段对合成细菌纤维素的微结构进行了观察分析。
关键词: 细菌纤维素 木醋杆菌 西瓜汁 发酵培养基
StudyontheProductionofBacterialCelulosewith
WatermelonJuice
LiJing1 ZhuPing1,2
(1LaboratoryofFiberMaterialsandModernTextile,theGrowingBaseforStateKeyLaboratory,QingdaoUniversity,
Qingdao266071;2ColegeofTextileandGarment,ShaoxingUniversity,Shaoxing312000)
Abstract: Bychoosingdiferentinoculum age,inoculum size,surfacearea/volumeratio,initialpH,fermentation
temperatureandtime,theproductionconditionsofbacterialcelulosebyacetobacterxylinum withwatermelonjuicewere
studied,sotheoptimum fermentedconditionwasgoten.Thenthescanningelectronmicroscopy,IR spectra,element
analysisweretestedtoanalysethemicrostructureofbacterialcelulose.
Keywords: Bacterialcelulose Acetobacterxylinum Watermelonjuice Fermentationmedium
2008年第2期
1 材料与方法
1.1 实验材料及仪器
1.1.1 菌种 木醋杆菌(AcetobacterXylinum1.1812,中科院微生物研究所)。
1.1.2 市售西瓜 去皮榨汁。
1.1.3 斜面菌种培养基 葡萄糖 100g,酵母粉 10g,碳酸钙 20g,琼脂 15g,蒸馏水 1000ml,pH6.8;种子及
发酵。
1.1.4 培养基 西瓜汁。
Nicolet5700傅立叶变换红外光谱仪(美国热电公司),JSM-6390LV扫描电子显微镜(JEOL公司),Vario
ELⅢ型元素分析仪(德国 elementar公司),ZSD-1160全自动新型生化培养箱(上海智诚分析仪器制造有限
公司),ZHWY-2102C双层小容量全温度恒温振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司),KYQS-280×260小
型压力蒸汽灭菌器(淄博康元卫生器材有限公司),LCT-1DC-A净化工作台(济南绿洁空气净化设备厂),
可调万用电炉(龙口市电炉制造厂),BS110S精密电子天平(北京赛多利斯天平有限公司),TGL-16G高速
离心机(上海安亭科学仪器厂),101A-2型电热鼓风干燥箱(上海市实验仪器总厂)。
1.2 培养方法
取一环活化好的斜面种子接入种子培养基,30℃振荡培养 24h,摇床转速为 150r/min。以 8%的接种量
接入发酵培养基,接种时充分振荡,以释放出菌体,30℃恒温静止培养 7d。
1.3 细菌纤维素的提取及处理方法
静止培养 7d后,取出细菌纤维素膜,蒸馏水多次冲洗,除去膜表面杂质。再将膜浸入 0.1mol/L的
NaOH溶液中,80℃保温 60min,除去残存的菌体和培养基。然后用去离子水反复冲洗,此时膜呈乳白色半
透明状,pH精密试纸轻压膜测 pH值至中性,60～80℃干燥至恒重。
1.4 实验设计方法
分别选择不同的种龄、接种量、发酵培养基液面积/液体积、pH值、培养温度和时间,比较各培养条件
对细菌纤维素产量的影响,选择出最佳培养条件。
1.5 细菌纤维素产量及含水率测定
将处理过的纤维素凝胶膜在离心机上 4000r/min时离心 40min,所得膜定义为细菌纤维素湿膜;将膜
于 60~80℃干燥至恒重,注意保持膜平整,所得膜定义为细菌纤维素干膜;细菌纤维素膜含水率(%)=,湿膜
重—干膜生湿膜重%精密电子天平称量细菌纤维素重量[1]。
1.6 定性观察细菌纤维素
将培养 7d的发酵薄膜自然平展于载玻片上,晾干。参考植物叶片组织定性观察纤维素的方法,在膜上
滴 66.7%的硫酸,再滴加碘液进行染色,用肉眼和显微镜观察显色情况[2]。
1.7 扫描电镜
利用扫描电子显微镜观察合成细菌纤维素的微结构。
1.8 红外光谱分析
利用傅立叶变换红外光谱仪测定合成细菌纤维素干膜的红外吸收光谱。
1.9 元素分析
利用元素分析仪测定合成细菌纤维素大分子中 C、H、O元素的含量。
2 结果与讨论
2.1 培养条件对细菌纤维素产量的影响
2.1.1 种龄对细菌纤维素产量的影响 分别取振荡培养 8h、12h、24h、36h、48h、60h和 72h的种子液接入
西瓜汁发酵培养基,比较种龄大小对细菌纤维素产量的影响,结果见图 1。
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图 3 培养基液表面积/液体积对细菌纤维素产量的影响
由图 1可知,种龄在 24h以前纤维素产量随其增加而快速增加,但 24h后随种龄增加细菌纤维素产量
却逐渐减少,这是由于细菌生长过程中存在一个对数生长期,在此之前生长繁殖速度较快,到对数生长期
时细菌生长繁殖速度达到最大值,因此可以最高效地合成细菌纤维素,此后细菌生长繁殖越过稳定期进入
死亡期,合成速度也逐渐下降[3]。因此种龄在 24h时纤维素的产量最高,为 2.86g/L,说明种龄为 24h最适合
发酵。
2.1.2接种量对细菌纤维素产量的影响 分别以 2%、4%、6%、8%、10%、12%和 20%的接种量将种子液接
入西瓜汁发酵培养基,根据纤维素产量确定适当的接种量,结果见图 2。
从图 2可以看出,当接种量在 8%以下时,随着接种量的增加,细菌纤维素的产量增加较快,但超过
10%以后,产量有所下降。这是由于接种量少,纤维素的合成效率低,在相同培养时间内纤维素产量就会偏
低,对生产纤维素不利;但是接种量过多,超过一定值后常导致底物前期消耗过快,不利于后期产物积累,
同时由于菌体的快速繁殖,会导致溶解氧浓度降低,细菌活力降低,从而影响到纤维素的产量[4]。因此确定
合成细菌纤维素的最适接种量为 8%,此时细菌纤维素的产量为 2.92g/L。
2.1.3发酵培养基液面积/液体积对细菌纤维素产量的影响 培养基的通气量是影响纤维素产量的一个
很重要的因素,通气量主要取决于培养基表面积与体积的比值,实验过程中分别在相同容积的容器中装入
不同体积的发酵培养基,比较培养基液面积与液体积之比对纤维素产量的影响,结果见图 3。
由图3可知最佳的发酵培养基液面积与体积比值为 1.0cm-1。表面积与体积的比值越大,氧气溶入发酵
液的速度也会越大,即溶氧量越大。但表面积越大,越不容易成膜,在相同时间内产量不高,只有通过延长
培养时间来达到较高的产量。
2.1.4初始 pH值对细菌纤维素产量的影响 发酵过程中,发酵液的 pH值并不是恒定的,而是随发酵过
程而不断变化,因此实验过程中只是确定发酵液的初始 pH值,pH选择范围在 3.0～9.0之间。用 0.1mol/L
的氢氧化钠和 1%的醋酸调节,pH值大小用酸度计测定,比较结果见图 4。
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图 7 细菌纤维素的形态
pH值通过影响细胞膜和线粒体内外两侧的氧化还原电位,进而影响离子通透、物质运输、线粒体中氧
的传递和能量代谢等,引起各种酶活力的改变,同时影响菌体对底物的利用速度和细胞结构,从而影响菌
体的生长和产物的合成[5]。由图 4可知木醋杆菌利用西瓜汁合成细菌纤维素的适宜 pH范围是 5.5～6.0。
2.1.5 培养温度对细菌纤维素产量的影响 每种细菌都有一个适宜生长温度,根据木醋杆菌的一般培养
温度实验过程中选择在 23℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃和 38℃下恒温静置培养发酵培养基,比较不同温
度对细菌纤维素产量的影响,其结果见图 5。
温度主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响微生物的生命活动。一方面,随
着温度的升高,细胞内酶的反应速度加快,代谢和生长也相应加快[6];另一方面,随着温度的进一步增高,
生物活性物质(如核酸、蛋白质等)发生变性,细胞功能下降,甚至死亡,所以每种微生物都有其适宜的生长
和发酵温度。由图 5可知木醋杆菌在西瓜汁培养基中的最佳培养温度为 30℃,此时细菌纤维素产量最高,
为 2.98g/L。
2.1.6 培养时间对细菌纤维素产量的影响 在上述确定的最适培养条件下,将木醋杆菌在西瓜汁发酵培
养基中静态培养,分别培养 1、3、4、5、6、7、8和 10d后取出测纤维素干膜重量,比较培养时间对细菌纤维素
产量的影响,结果见图 6。
由图 6可知,随着发酵过程的进行,前 5d细菌纤维素产量上升较快,到第 7d时达到最大值 3.04g/L,
以后随着发酵时间的延长细菌纤维素的产量基本不再增加,因此发酵培养 7d即可提取纤维素。
2.2 细菌纤维素的含水率测定
在优化的培养条件下利用木醋杆菌在西瓜汁中合成细菌纤维素,每升发酵培养基中细菌纤维素湿膜
产量为 27.64g,干膜产量为 3.04g,根据公式计算其含水率为 89%。
细菌纤维素具有非常高的含水率,首先是由于纤维素大分子中含有大量羟基,水是纤维素的强润涨
剂,其分子可以渗透到纤维素非晶区内,造成纤维素链间氢键的断裂,并与纤维素分子形成新的氢键;其次
细菌纤维素是经木醋杆菌细胞壁分泌到液体培养基中大量聚集在一起形成的,以这种形式形成的膜会包
裹大量的水分[7];此外,细菌纤维素本身具有纳米级结构,纤维素膜未被干燥时,膜组织间隙的内表面积很
大,可以吸收大量的水分。
2.3 细菌纤维素的形态观察
图 7是静置条件下培养的细菌纤维素膜,其中左图为
三角烧瓶中静止培养的未经处理的细菌纤维素膜,其浮在
液界面上,上表面像皮革一样,另一面则是较柔软的凝胶
膜,膜表面附着西瓜汁中的带色物质,较容易洗去;右图为
蒸馏水清洗且碱处理后的纤维素膜,厚且质地柔韧,较透
明,合成过程中有分层现象,烘干后为薄膜。
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2.4 定性观察细菌纤维素
肉眼观察到染色后细菌纤维素膜呈蓝黑色,显微镜观察可看到凝胶膜被染成深蓝色物质并且无规则
的一层一层分布,由此初步判定木醋杆菌所产凝胶膜的主要成分是纤维素。
2.5 扫描电镜观察
由扫描电镜照片可以看出,西瓜汁合成的细菌纤维素具有超微细网状结构,由高密度微纤维相互缠绕
形成。微纤维直径不足 100nm,为纳米级尺寸,而一般的棉花纤维直径在 10μm~100μm,超细人造纤维直径
在 1μm左右,因此细菌纤维素微纤维比其他纤维细得多,具有超细结构。
2.6 红外光谱分析
由图9可以看出,利用西瓜汁合成的细菌纤维素的红外光谱中含有几个较为明显的吸收峰,其中3350cm-1
处的强吸收峰为O-H的伸缩振动吸收峰,说明分子中含有大量-OH,2925cm-1处的吸收峰是大分子中C-H键的
伸缩振动吸收峰,1652cm-1处的吸收峰是由纤维素4′端的半缩醛基引起的,1336cm-1处的吸收谱带为C-H键
的弯曲振动产生的,1063cm-1处的较强吸收峰是C-O键的伸缩振动吸收峰。
利用红外光谱测出发酵产物中可能存在的有机基团有:-OH,-CH2,-CH,C-O等,这与标准纤维素的结构相
符合,因而证实此化合物是纤维素。
2.7 元素分析
利用元素分析仪测得西瓜汁合成细菌纤维素大分子中 C含量为 44.40%,H含量为 6.82%,O含量为
44.71%,符合纤维素大分子中元素构成,进一步证实合成物质为纤维素。
3 结论
3.1 通过实验确定木醋杆菌利用西瓜汁合成细菌纤维素的最佳工艺条件为:种龄 24h、接种量 8%、发酵培
养基液面积与体积比 1.0cm-1、初始 pH5.5～6.0、培养温度 30℃、培养时间 7d,此条件下纤维素干膜产量为
3.04g/L。
3.2 利用扫描电镜、红外光谱、元素分析等手段对合成的细菌纤维素进行分析测试,结果表明合成物质具
有超细微结构,并且证实其为纤维素。
参考 文献
1 贾士儒,欧竑宇.纤维素科学与技术,2002,10(3):25~30.
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