全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０６􀆰 ００７
收稿日期：２０１４－１１－０６
基金项目：国家杰出青年基金（２１０２５６２５）；国家重点基础研究发展计划（９７３ 计划） （２０１３ＣＢ７３３６０２）；国家高技术研究发展计划（８６３ 计划）
（２０１２ＡＡ０２１２０３）；国家科技支撑计划（２０１２ＢＡＩ４４Ｇ０１）；国家自然科学基金面上基金（ ２１３７６１１８）；国家自然科学基金青年基金
（２１１０６０７０）；长江学者和创新发展计划（ＰＣＳＩＲＴ）；江苏省自然科学基金（ＳＢＫ２０１５０２０７）
作者简介：程　 浩（１９８８—），男，河南南阳人，硕士研究生，研究方向：生物化工；应汉杰（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｉｎｇｈａｎｊｉｅ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
氨基化细菌纤维素载体的制备及其固定 β 半乳糖苷酶
程　 浩， 陈　 勇， 应汉杰
（南京工业大学 生物与制药工程学院， 江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：利用二氯亚砜和乙二胺对细菌纤维素薄膜进行氯化和氨基化制备氨基化细菌纤维素薄膜，并以该薄膜作
为载体固定 β 半乳糖苷酶，研究载体的结构性质和固定化酶的制备条件及相关酶学性质。 通过元素分析、红外光
谱和 Ｘ线光电子能谱等分析方法来表征载体性质。 结果显示，有大量氨基接入细菌纤维素表面。 最佳的固定化酶
的条件：戊二醛添加量 ４ ｇ ／ Ｌ，固定化时间 ３ ｈ，酶添加量 ３ ｍｇ ／ ｍＬ，ｐＨ７􀆰 ０和交联时间 ９０ ｍｉｎ，此条件下，最高酶活回
收率为 ７８􀆰 ４％，吸附酶量为 ６３􀆰 １ ｍｇ ／ ｇ。 与游离酶相比，固定化酶的最适温度为 ４０ ℃，比游离酶高 １０ ℃，最适 ｐＨ
提高 ０􀆰 ５，有向碱性方向移动的趋势，重复使用 ７次后剩余 ７７􀆰 ８％的相对酶活力。
关键词：氨基化； 细菌纤维素； 固定化；β 半乳糖苷酶
中图分类号：Ｑ８１４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－００３６－０７
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗｉｔｈ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ ａｓ
ｃａｒｒｉｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
ＣＨＥＮＧ Ｈａｏ，ＣＨＥＮ Ｙｏｎｇ，ＹＩＮＧ Ｈａｎｊｉｅ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｄｕｃｔ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ． Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｉｎｆｒａｒｅｄ
ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ Ｘ⁃ｒａｙ ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｂｕｎｄａｎｔ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ
ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｗｅｒｅ ７８􀆰 ４％ ａｎｄ ６３􀆰 １ ｍｇ ／ ｇ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ： ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ４ ｇ ／ Ｌ， ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ４ ｈ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ３ ｍｇ ／ ｍＬ，ｐＨ ７􀆰 ０ ａｎｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｔｉｍｅ ９０ ｍｉｎ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｒｅｅ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，
ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ３０ ｔｏ ４０ ℃，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ０􀆰 ５． Ｉｎ
ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｒｅｍａｉｎｅｄ ７７􀆰 ８％ ｏｆ ｉｔｓ ｏｒｉｇｉｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｉｔｓ ７ｔｈ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｕｓｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｍｉｎａｔｉｏｎ；ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
　 　 细菌纤维素（ＢＣ）和植物纤维素有相似的基本
结构，都是由 Ｄ 葡萄糖以 β １，４ 糖苷键组成的无
分支结构的高分子，具有很多优良性能，其持水性、
结晶度、机械性能和纯度均非常高，独特的纳米纤
维网络使其有良好的生物亲和性［１－２］，但其难溶解、
难加工且官能团单一导致的其他功能不足等弱点，
限制了其进一步应用。
笔者尝试利用 ＢＣ 表面含有的丰富羟基，通过
化学修饰在 ＢＣ 薄膜表面引入氨基，以期获得性能
更加优良的纤维素，为拓宽细菌纤维素的应用奠定
基础。 β 半乳糖苷酶能催化乳糖水解生成葡萄糖
和半乳糖，主要用于生产低乳糖以解决普遍存在的
乳糖不耐症问题［３－５］。
笔者用修饰后的载体用戊二醛作交联剂，采用
化学交联法固定 β 半乳糖苷酶以利于酶的回收利
用，降低使用成本。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料、试剂与仪器
β 半乳糖苷酶（３ ０１５ Ｕ／ ｇ，生化试剂），诺维信
（中国）生物技术有限公司；邻硝基苯 β Ｄ 吡喃半
乳糖苷（ｏＮＰＧ）、戊二醛（５０％），国药集团化学试剂有
限公司；ＮａＯＨ、无水乙醇、氨水，西陇化工股份有限公
司；无水 Ｎａ２ＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ、二
甲基甲酰胺（ＤＭＦ）、氯化亚砜、乙二胺、丙酮，上海凌峰
化学试剂有限公司。 所用试剂均为分析纯。
往复式水浴恒温培养振荡器，上海智城分析仪
器制造有限公司；ＵＮＩＣＯ７２００ 型可见分光光度计，
尤尼柯（上海）仪器有限公司；Ａｖａｔａｒ ３８０ 型傅里叶
变换红外光谱仪，美国 Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｉｃｏｌｅｔ 公司；Ｖａｒｉｏ
ＭＩＣＲＯ ｃｕｂｅ 元素分析仪，德国 Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ 公司；
ＸＰＳＳＣＡＬＡＢＭＫＨ型 Ｘ 线光电子能谱仪（ＸＰＳ），美
国 ＶＧ公司。
１􀆰 ２　 氨基化细菌纤维素的制备和表征
１􀆰 ２􀆰 １　 细菌纤维素的培养与处理
在无菌条件下用接种环从平板中刮取一环保
藏的木醋杆菌，接种于 ５０ ｍＬ 种子培养基中，在 ３０
℃、静置条件下培养 ３ ｄ后，将上层细菌纤维素膜破
碎后，按照体积分数为 ７％ 的比例于无菌条件下将
种子液接入到装液量为 ２００ ｍＬ 发酵培养基的 ５００
ｍＬ三角瓶中。 ３０ ℃下静置培养 １４ ｄ 后，收集得到
凝胶片层状细菌纤维素膜。 纯水浸泡 ２ ｄ 后再用
０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ溶液将膜片多次煮沸以除去膜片
中的菌体和残留培养基，最后用纯水重复冲洗至中
性。 经 １２１ ℃、１５ ｍｉｎ高压灭菌后于 ４ ℃保存备用。
１􀆰 ２􀆰 ２　 氨基化细菌纤维素的制备
将膜在－８０ ℃预冷过夜后于－５６ ℃真空环境下
冷冻干燥。 取小片薄膜，作为样品。 将 ５ ｇ 冻干后
的细菌纤维素薄膜在 ３００ ｍＬ ＤＭＦ中于 ７８􀆰 ９ ℃、磁
力搅拌过夜后，慢速逐滴加入 ８ ｍＬ氯化亚砜。 待氯
化亚砜加完后于同样温度下继续反应 ４ ｈ，得到氯化
纤维素（ＢＣ Ｃｌ）。 用稀释的氨水和纯水反复冲洗
氯化纤维素，再用大量纯水冲洗至中性。 将过滤得
到的氯化纤维素在－８０ ℃下预冷，并于－５６ ℃真空
环境下冷冻干燥，得到氯化纤维素膜片。 取 １ ｇ 氯
化纤维素薄片置于 １０ ｍＬ ＤＭＦ内，于磁力搅拌下加
入 ８ ｍＬ乙二胺，持续回流 ３ ｈ。 反应结束后用大量
无水丙酮冲洗膜片，得到氨基化纤维素 （ ＢＣ
ｅｎ） ［６］。 室温条件下真空干燥 ２４ ｈ后保存备用。
１􀆰 ２􀆰 ３　 氨基化细菌纤维素的表征
１）元素分析 　 将修饰前后的细菌纤维素薄膜
研磨成粉，于 １２０ ℃烘干过夜后，进行元素分析
测定。
２）傅里叶变换红外光谱（ＦＴ ＩＲ）分析 　 将修
饰前后的细菌纤维素膜片冻干后研成粉末，与 ＫＢｒ
以 １ ∶ １００比例混合后充分研细，用压片机压片，再
放入红外光谱仪中进行测定，仪器分辨率为 ０􀆰 ４
ｃｍ－１，扫描速度为 ０􀆰 ２ ｃｍ－１ ／ ｓ，波数扫描范围 ４００ ～
４ ０００ ｃｍ－１。
３）Ｘ线光电子能谱（ＸＰＳ）分析　 用于测定样品
表面元素电子的结合能以确定元素价态。 将少量
的粉末样黏附在导电胶上进行测试。 采集全谱时
通能 １４０，步长 ０􀆰 ８，扫描 １ 次；采集窄谱时通能 ５５，
步长 ０􀆰 ５，扫描 ４次。
１􀆰 ３　 酶的固定化及固定化酶基本性能测定
１􀆰 ３􀆰 １　 氨基化纤维素载体固定 β Ｄ 半乳糖苷酶
将一定量的氨基化纤维素置于锥形瓶中，加入
ｐＨ ７􀆰 ０磷酸缓冲液浸泡 ２ ｈ 后，抽滤得到溶胀后的
氨基化纤维素。 向溶胀后的氨基化纤维素加入 ５
ｍＬ一定浓度的 β Ｄ 半乳糖苷酶溶液（先取 ０􀆰 １
ｍＬ经过稀释若干倍后测定原酶溶液活力），再加入
２ ｍＬ 一定浓度的戊二醛溶液后室温振荡 ３ ｈ，制得
固定化酶。 吸取上清液 ０􀆰 １ ｍＬ，并稀释后测定残余
酶活力。 用与原酶液相应 ｐＨ 的磷酸缓冲液重复洗
涤固定化酶，测定固定化酶活力。
１􀆰 ３􀆰 ２　 酶活力的测定
１）游离 β Ｄ 半乳糖苷酶活力的测定［７］ 　 向
１０ ｍＬ离心管内加入 ３ ｍＬ 质量浓度为 ４ ｇ ／ Ｌ 用磷
酸缓冲液配置的 ｏＮＰＧ溶液，３０ ℃水浴 ７ ｍｉｎ后，再
加入稀释的酶液 １ ｍＬ，摇匀后于同样温度下水浴反
７３　 第 ６期 程　 浩等：氨基化细菌纤维素载体的制备及其固定 β 半乳糖苷酶
应 １０ ｍｉｎ，然后再加入 １ ｍｏｌ ／ Ｌ的 Ｎａ２ＣＯ３溶液 ２ ｍＬ
终止反应，摇匀后测定 ４２０ ｎｍ处的 Ａ４２０。
酶活力定义：在测定条件下（３０ ℃、ｐＨ ７􀆰 ０、反应
时间 １０ ｍｉｎ），每分钟催化生成 １ μｍｏｌ ｏＮＰ 所需的酶
量为一个酶活力单位。 乳糖酶活力计算见式（１）。
乳糖酶活力单位 ＝
Ａ４２０
０􀆰 ７８３ ３ｔｍ
（１）
式中：Ａ４２０为吸光度；０􀆰 ７８３ ３为换算系数，亦即 ｏＮＰ
浓度为 １ μｍｏｌ ／ Ｌ时的 Ａ４２０值；ｔ为反应时间，ｍｉｎ； ｍ
为反应液中酶的质量，ｇ。
２）固定化 β Ｄ 半乳糖苷酶活力的测定［８］ 　
向 １０ ｍＬ离心管内加入 ３ ｍＬ 质量浓度为 ４ ｇ ／ Ｌ 用
磷酸缓冲液配置的 ｏＮＰＧ溶液，３０ ℃水浴 ７ ｍｉｎ后，
再放入大约 ０􀆰 ０１ ｇ的氨基化纤维素薄膜固定化酶，
摇匀后于同样温度下水浴反应 １０ ｍｉｎ 后，再加入 １
ｍｏｌ ／ Ｌ的 Ｎａ２ＣＯ３溶液 ２ ｍＬ 终止反应，摇匀后测定
４２０ ｎｍ处的 Ａ４２０。 乳糖酶活力单位的计算同上。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 氨基化细菌纤维素膜载体的表征
２􀆰 １􀆰 １　 元素分析结果
图 ２　 细菌纤维素氯化产物的光电子能谱
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｘ⁃ｒａｙ ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
氨基化细菌纤维素的实际测定结果：Ｃ、Ｈ和 Ｎ含
量分别为 ４１􀆰 ６２％、５􀆰 ６９％和 ７􀆰 １２％。 而以单个葡萄糖
环为参与反应单元和化学修饰反应完全，则计算得到
理论值为 Ｃ ４７􀆰 ９５％、Ｈ ７􀆰 ８４％、Ｎ １３􀆰 ７２％。 氮元素的实
测量小于完全取代值，氨基化程度大约为 ５２％。
２􀆰 １􀆰 ２　 ＦＴ ＩＲ分析结果
图 １为细菌纤维素及其衍生物的红外图谱。 由
图 １可知：３ ２００～３ ５００ ｃｍ－１处为纤维素分子上—ＯＨ
伸缩振动产生的宽而且强的峰；２ ９００ ｃｍ－１处为亚甲
基、次甲基的 Ｃ—Ｈ伸缩振动吸收峰；１ ６４０ ｃｍ－１左右
处为羟基 Ｏ—Ｈ 的弯曲振动吸收峰；１ ４３１ ｃｍ－１处为
亚甲基、次甲基的 Ｃ—Ｈ 弯曲振动吸收峰；１ ０００ ～
１ ２００ ｃｍ－１处为 Ｃ—Ｏ伸缩振动吸收峰；１ １１４ ｃｍ－１处
为 Ｃ—Ｃ骨架振动吸收峰。 这些特征峰都说明实验
所得细菌纤维素成分为纯纤维素。 与二氯亚砜反应
后的细菌纤维素膜，在 ７０９和 ７５２ ｃｍ－１处出现了 Ｃ—
Ｃｌ键的伸缩振动峰，且 Ｏ—Ｈ的变形振动峰消失，而
其他峰值基本没有变化，这说明了在纤维素 Ｃ ６上
的伯羟基被 Ｃｌ原子所取代而发生了氯代反应［９］。 细
菌纤维素的氯化产物接着氨基化之后，在 ３ ３００ ｃｍ－１
附近又出现宽的强峰，但是峰位明显向低波数移动，
表明有胺基的形成［１０－１１］。 由于纤维素及其取代产物
中大量氢键的存在，此外由于氨基化产物中既有伯胺
基也有仲胺基，使得高波数的振动峰较宽，不容易给
出更多结构信息。
图 １　 细菌纤维素、氯化细菌纤维素和氨基化
细菌纤维素的红外图谱
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｔｈｅ ＢＣ，ＢＣ⁃Ｃｌ，ａｎｄ ＢＣ⁃ｅｎ
２􀆰 １􀆰 ３　 ＸＰＳ分析结果
图 ２ 为细菌纤维素氯化物的光电子能谱和数
据。 从图 ２中可知：细菌纤维素的氯化结果除了碳
原子的 １ｓ轨道电子结合能在 ２８１ ｅＶ 和 ２８２ ｅＶ［１２］
及氧原子的 ｌｓ轨道电子结合能在 ５３２ ｅＶ 处应该有
８３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
相应的峰外，氯原子的 ２ｐ 轨道电子结合能在大约
１９４ ｅＶ处有较强的峰，证明了修饰后细菌纤维素上
氯原子的存在。
乙二胺修饰的细菌纤维素的光电子能谱如图 ３
所示。 由图 ３可知：比较弱的 Ｃｌ（２ｐ）能级峰可见，
在胺化修饰后的产物中仍然有少量的氯没有反应，
这表明氨基化不完全。 由于出现较强的 Ｎ（１ｓ）能级
峰，表明大部分的氯代物都发生了氨基化反应［１３］，
得到了预期结构的纤维素修饰产物。
图 ３　 氨基化细菌纤维素的光电子能谱
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｘ⁃ｒａｙ ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ａｍｉｎａｔｉｏｎ
ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
２􀆰 ２　 氨基化细菌纤维素载体固定 β Ｄ 半乳糖苷
酶的条件优化
２􀆰 ２􀆰 １　 固定化时间的确定
在其他条件（酶添加量、ｐＨ、戊二醛含量和交联
时间）保持一致时，０􀆰 ０１ ｇ 氨基化细菌纤维素薄膜，
室温振荡下分别固定 １、２、３、４、５、６ 和 ７ ｈ 后，测定
固定化酶活力回收率，考察不同固定化时间对固定
化酶活力的影响，结果见图 ４。
图 ４　 固定化时间对固定化酶活力和吸附酶量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ
ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
由图 ４可知：氨基化细菌纤维素固定化 ３ ｈ 时，
固定化酶活力回收率达到最大，为 ６７􀆰 ８％，随固定
化时间的延长，固定化酶活力呈下降趋势。 主要是
由于随固定化时间的延长，酶与载体共价耦联的作
用位点增多，破坏了酶的高级结构，而且当载体偶
联的酶量逐渐增大时，载体网络上的酶分子之间较
为拥挤，在酶促反应过程中，底物不易与酶充分接
触，故使固定化酶整体的活力呈现下降的趋势［１４］。
２􀆰 ２􀆰 ２　 戊二醛用量的确定
在其他条件（酶添加量、ｐＨ 和交联时间）保持
一致时，向 ０􀆰 ０１ ｇ 氨基化细菌纤维素薄膜中分别加
入 ０、２、４、６、８、１０ 和 １２ ｇ ／ Ｌ（以反应总体积计）的戊
二醛，室温振荡条件下，分别固定 ３ ｈ 后测定固定化
酶活力回收率，考察不同戊二醛含量对固定化酶活
力和吸附酶量的影响，结果见图 ５。
图 ５　 戊二醛用量对固定化酶活力和吸附酶量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
由图 ５ 可以发现：固定化酶活力随戊二醛浓度
增加而增大，在戊二醛质量浓度为 ４ ｇ ／ Ｌ 时，酶活力
回收率最大。 低浓度的戊二醛有助于酶通过 Ｓｃｈｉｆｆ
９３　 第 ６期 程　 浩等：氨基化细菌纤维素载体的制备及其固定 β 半乳糖苷酶
反应与载体上的氨基交联在一起，但交联又不充
分；在浓度较高时，戊二醛的毒性会使半乳糖苷酶
部分失活，并且戊二醛会造成空间位阻而妨碍固定
化酶与底物相结合，致使固定化酶活力回收率降低。
２􀆰 ２􀆰 ３　 酶添加量的确定
保持其他条件（戊二醛 ４ ｇ ／ Ｌ 、ｐＨ和交联时间）
一致，向 ０􀆰 ０１ ｇ氨基化细菌纤维素薄膜内加入 ５ ｍＬ
酶液 （质量浓度分别为 １、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７ 和 ８
ｍｇ ／ ｍＬ），室温振荡条件下固定 ３ ｈ 后测定固定化酶
活力，考察不同浓度酶添加量对固定化酶活力的影
响，结果见图 ６。
图 ６　 酶添加量对固定化酶活力和吸附酶量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ａｎｄ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
由图 ６可知：当酶的浓度较低（不足）时，固定化
酶活力回收率与酶浓度的增加呈正相关。 酶添加量
高于 ３ ｍｇ ／ ｍＬ 时，固定化酶活力回收率与酶浓度的
增加呈负相关。 这是由于氨基化载体的活性基团有
限，酶液超过一定浓度后，载体上的结合位点已被饱
和，因而酶添加量增加，而酶活回收率反而下降［１５］。
２􀆰 ２􀆰 ４　 ｐＨ的确定
保持其他条件一致，向 ０􀆰 ０１ ｇ 氨基化细菌纤维
素薄膜内加入 ３ ｍｇ ／ ｍＬ的酶液 ５ ｍＬ，室温振荡下固
定 ３ ｈ 后加入 ｐＨ 分别为 ４􀆰 ０、５􀆰 ０、６􀆰 ０、７􀆰 ０、８􀆰 ０ 和
９􀆰 ０的 ４ ｇ ／ ｍＬ戊二醛各 ２ ｍＬ，室温交联 ６０ ｍｉｎ 后
测定固定化酶活力和吸附酶量，结果见图 ７。
由图 ７可以看出：环境的 ｐＨ 对氨基化细菌纤
维素薄膜固定化β Ｄ 半乳糖苷酶的效率有显著影
响。 固定化酶载量和固定化酶活力回收率随着环
境 ｐＨ的升高而增大； 当 ｐＨ 达到 ７􀆰 ０ 时，氨基化细
菌纤维素薄膜具有最大的酶活力回收率（７５􀆰 ３％）
和吸附酶量（５８􀆰 ４ ｍｇ ／ ｇ）；随着 ｐＨ 继续增加，固定
化酶活力和酶载量呈下降的趋势。 引起此种现象
的原因可能是在制备固定化酶的过程中，不同 ｐＨ
图 ７　 ｐＨ对固定化酶活力和吸附酶量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｍｏｕｎｔ
ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
环境与酶分子直接接触，极端 ｐＨ 使酶分子变形的
可能性大大增加。 另外，戊二醛在作为交联剂的同
时又是酶分子的变性剂，在一定程度上使酶分子发
生构象变化而引起失活。
２􀆰 ２􀆰 ５　 交联时间的确定
保持其他条件一致，向 ０􀆰 ０１ ｇ 氨基化细菌纤维
素薄膜内加入 ３ ｍｇ ／ ｍＬ的酶液 ５ ｍＬ，室温振荡下固
定 ３ ｈ后加入 ４ ｇ ／ ｍＬ 戊二醛各 ２ ｍＬ，室温交联不同
时间（３０、６０、９０、１２０、１５０ 和 １８０ ｍｉｎ），测定固定化
酶活力和吸附酶量，结果见图 ８。
图 ８　 交联时间对固定化酶活力和吸附酶量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ
ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
由图 ８可知：用氨基化细菌纤维素薄膜固定 β
Ｄ 半乳糖苷酶，当交联时间由 ３０ ｍｉｎ 增加到 ９０
ｍｉｎ时，酶活力回收率（７３􀆰 １％）和吸附酶量（６０􀆰 ３
ｍｇ ／ ｇ）都达到最大值；其后，再延长交联时间至 １８０
ｍｉｎ，固定化酶活力回收率下降至 ３１􀆰 ６％，而吸附酶
量也有一定幅度的下降。 可能原因是，对于氨基化
细菌纤维素固定酶，适当延长交联时间有助于酶分
子与戊二醛充分接触从而增加吸附酶量和固定化
酶活力回收率。 然而，继续延长交联时间，戊二醛
对酶分子的变性作用更加明显。
０４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
２􀆰 ２􀆰 ６　 最佳组合的活力回收率和吸附酶量
在以上得出的各个最优条件（即固定化时间为
３ ｈ，戊二醛质量浓度 ４ ｇ ／ ｍＬ，酶液用量为 ３ ｍｇ ／ ｍＬ，
ｐＨ ７􀆰 ０ 和 交联时间为 ９０ ｍｉｎ）下，用氨基化细菌纤
维素薄膜固定 β Ｄ 半乳糖苷酶，所得固定化酶活
力回收率和吸附酶量分别为 ７８􀆰 ４％ 和 ６３􀆰 １ ｍｇ ／ ｇ。
韩平治等［１６］用阳离子修饰的 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ １００将部
分纯化的赤豆 β 半乳糖苷酶通过吸附和共价交联
法固定化，得到的固定化酶活力回收率为 ６５％；潘
晓亚等［１７］选择明胶为载体，用戊二醛作为交联剂固
定化乳糖酶，其酶活力回收率达到 ７８􀆰 １２％，可以重
复回收使用。 Ｔａｎｒｉｓｅｖｅｎ等［１８］使用藻酸盐和明胶形
成的纤维作为固定化材料，利用戊二醛作交联剂固
定 β 半乳糖苷酶，获得的固定化酶的相对酶活力为
５６％，且酶活力可以保持 ３５ ｄ，该固定化酶具有潜在
的工业应用价值。 Ｎｅｒｉ等［１９］使用聚硅氧烷 聚乙烯
醇磁性复合材料（ｍＰＯＳ⁃ＰＶＡ）作为固定化载体，得
到的固定化 β 半乳糖苷酶在 ２５ ℃下重复使用 ２０
次或在 ３５ ℃存放 ２４ ｈ 后只保留其 ５０％原始酶活
力，固定化效果欠佳。 Ｔｏｓｈｉｂａ 等［２０］利用免疫亲和
性载体（免疫球蛋白 Ｇ 纤维素）固定 β 半乳糖苷
酶时发现，固定化酶在 ６０ ℃下保存 ４ ｈ 后只保留其
７２％的原始酶活力，重复使用 １０ 次后固定化酶活力
剩余了 ４６％。 由此可以看出，用氨基化细菌纤维素
固定 β 半乳糖苷酶，在提高酶活力回收率上有了一
定程度的提高。
２􀆰 ３　 固定化酶和游离酶酶学性质研究
２􀆰 ３􀆰 １　 温度对酶促反应的影响
分别将游离酶和固定化酶置于不同温度（２０、
２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５和 ６０ ℃）下测定酶活力，以
最高酶活为 １００％，计算相对酶活，结果如图 ９所示。
图 ９　 反应温度对游离酶和固定化酶活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
由图 ９可知：酶经过固定化，其最适反应温度由
３０ ℃提高到 ４０ ℃左右。 说明可以通过适当提高温
度增大酶促反应速率以缩短反应时间。 细菌纤维
素膜经过溶胀能够使酶分子进入纤维束之间，这些
纤维束能够有效保护酶分子免受过高温度而引起
的变性失活。 另外戊二醛的固定可能使酶分子的
结构刚性增强，增加了其抗热性能。
２􀆰 ３􀆰 ２　 ｐＨ对酶促反应的影响
按照测定游离酶和固定化酶的方法，分别在不
同 ｐＨ（５􀆰 ０、５􀆰 ５、６􀆰 ０、６􀆰 ５、７􀆰 ０、７􀆰 ５、８􀆰 ０、８􀆰 ５ 和 ９􀆰 ０）
条件下测定游离酶和固定化酶活力，以最高酶活为
１００％，计算相对酶活，结果如图 １０所示。
图 １０　 ｐＨ对游离酶和固定化酶活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 １０　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｎｄ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
由图 １０可知：游离酶的最适 ｐＨ 为 ６􀆰 ５，固定化
酶的最适 ｐＨ 为 ７􀆰 ０，而且在偏碱性环境下固定化酶
活力更高。 与氨基相比，薄膜表面还有更多数量带负
电的羟基，能够吸引溶液中的氢离子到周围，致使固
定化酶内部微环境的 ｐＨ比周围反应液的 ｐＨ稍低一
些，形成了适合酶催化反应的酸性环境，因此固定化
半乳糖苷酶的最适反应 ｐＨ向碱性方向移动。
２􀆰 ３􀆰 ３　 固定化 β 半乳糖苷酶的操作稳定性
图 １１　 固定化酶的重复使用性
Ｆｉｇ􀆰 １１　 Ｒｅｕｓａｂｉｌｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
按照测定固定化酶的方法，利用同一份固定化
酶进行重复批次酶促反应，结果如图 １１所示。 由图
１４　 第 ６期 程　 浩等：氨基化细菌纤维素载体的制备及其固定 β 半乳糖苷酶
１１可以看出，在使用 ７ 次之后相对酶活力剩余为
７７􀆰 ８％，重复使用性较好。
３　 结论
经过 ＤＭＦ活化、二氯亚砜和乙二胺修饰制备出
氨基化细菌纤维素薄膜，并以该薄膜为载体固定 β
半乳糖苷酶，通过对固定化条件进行探讨，得到戊
二醛添加量 ４ ｇ ／ Ｌ，固定化时间 ３ ｈ，酶添加量 ３
ｍｇ ／ ｍＬ，ｐＨ为 ７􀆰 ０ 和交联时间为 ９０ ｍｉｎ 时，有最高
酶活力回收率（７８􀆰 ４％）和吸附酶量（６３􀆰 １ ｍｇ ／ ｇ）。
该固定化酶的最适温度为 ４０ ℃，比游离酶高 １０ ℃，
相比游离酶，固定化情况下的最适 ｐＨ 提高了 ０􀆰 ５，
有向碱性方向移动的趋势，重复使用 ７ 次后还有
７７􀆰 ８％ 的相对酶活力。 氨基化细菌纤维素膜可以
作为固定化 β 半乳糖苷酶的良好载体，但在工业应
用方面有待进一步研究。
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ｐｏｌｙｓｉｌｏｘａｎｅ⁃ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ （ｍＰＯＳ⁃ＰＶＡ） ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ
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２００９，４３：３０７⁃３１４．
（责任编辑　 荀志金）
２４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷