全 文 ：收稿日期:2008-01-20
基金项目:国家“863”计划资助项目(2007AA10Z170)
作者简介:吴宏梅(1980-),女,博士,研究方向:细胞与分子生物学;E-mail:hongmeiwu80@gmail.com
通讯作者:关伟军,男,教授,博导,Tel:010-62815992;E-mail:wjguan86@caas.net.cn
马月辉,男,研究员,博导,Tel:010-62813463;E-mail:Yuehui.ma@263.com
细菌人工染色体(BacterialArtificialChromosome,
BAC)文库是基因组文库的一种,是在大肠杆菌 F
(factor)因子的基础上发展而来的。由于其具有插
入片段大、容易回收、拷贝数低、稳定性好、嵌合体
少、转化效率高[1]、操作简便且可对克隆在 BAC的
DNA进行直接测序[2~4]等优点,已被广泛地应用到
人、动植物及微生物的基因组学研究方面,并在模
式物种的全基因组测序中发挥着重要作用,成为基
因组学研究的一个非常重要的工具。
BAC文库经历了 10多年的发展,技术日趋完
善[5]。目前,从人类到动物如猪、马、牛、绵羊、山羊、
狗和鸡,植物和微生物的 BAC基因组文库都已被
构建或正在构建中[6~9]。所有这些文库的建立,为今
后的基因组学的研究提供了一个强有力的技术平
台和资源。
决定文库质量的关键有 2个:一是载体的质
量;二是大片段 DNA的质量[10]。为了解决这些问
题,科学家们一直不懈的努力着。Zhang等发展了
细菌人工染色体文库的构建方法分析
吴宏梅 1 刘长青 1,2 刘帅 1,3 包阿东 1,3 陆涛峰 1 关伟军 1 马月辉 1
(1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100094;2中国海洋大学生命与技术学部,青岛 266003;
3内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特 010018)
摘 要: 细菌人工染色体是一种承载大片段 DNA的新型载体系统,它具有插入片断大、嵌合率低、遗传稳定性
好、易于操作等优点。在高等生物基因组文库的构建和基因功能的分析等方面有广泛应用。BAC文库的构建是基因组较
大的真核生物基因组学研究的重要基础。介绍了近年来细菌人工染色体文库构建方法上的研究进展,对其中载体的制备
和高分子量DNA的制备这两个关键环节作了较深入的探讨。
关键词: 细菌人工染色体 基因组文库 构建方法 载体制备 大片段基因DNA制备
ResearchinConstructionMethodofBacterialArtificial
ChromosomeLibrary
WuHongmei1 LiuChangqing1,2 LiuShuai1,3 BaoAdong1,3 LuTaofeng1 GuanWeijun1
MaYuehui1
(1InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing100094;2DivisionofLifeScienceand
Technology,OceanUniversityofChina,Qingdao266003;3ColegeofAnimalScienceandMedicine,AgriculturalUniversity
ofInnerMongolia,Hohhot010018)
Abstract: Thebacterialartificialchromosome (BAC)isanewlydevelopedvectorsystem withseveraladvantages,
includinglargecapacity,stableheritageandeasyhandling.Itisutilizedextensivelyinlibrariesconstruction,genome
researchandanalysisofgenefunction.TheconstructionofgenomicBAC Libraryistheimportantbasisingenomics
researchofeukaryote.TheprogresofconstructionmethodsingenomicBAC Librarywerereviewedinpresentarticle
anditfocusedontwokeypointsofthepreparationofvectorsandhigh-molecularDNA
Keywords: Bacterialartificialchromosome DNALibrary ConstructionmethodsVectorpreparation
High-molecularDNA
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法·
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
一 整 套 的 建 库 技 术 并 不 断 加 以 改 进 和 提 高 ;
Kazutoyo,etal对 BAC文库构建中的关键环节进行
了创新[11],特别是在载体制备、大片段的回收及连
接液的浓缩等方面提出了自己的解决方案;Boulos
Chalhoub等对提高 BAC克隆质量和效率的几个方
面进行了研究[12],改进的方法使插入片段更大更均
一,且克隆效率提高了 5~6倍。DAVIDP等对 BAC
DNA的提取方法进行了研究和改进[13],提高了 BAC
DNA的产量和质量。虽然BAC文库发展至今,技术
日趋完善,但是构建 BAC文库仍然是一件十分费时
费力且涉及多种分子生物学技术的工作。所以任何
技术上的改进都是非常有益的 (BoulosChalhoub)。
因此,本文着重介绍关于 BAC文库构建方法上的
一些关键技术的研究与改进。
BAC文库的构建主要包括载体 (vector)的制
备、高纯度大分子量基因组 DNA(Highmolecular
weightDNA,HMWDNA)的制备、大片段 DNA的选
择 (large-sizeDNAselection),外源片段与载体的连
接(ligation)、感受态细胞的转化(transformation)及
克隆的挑取(picking)等步骤 。因为构建过程涉及
的步骤较多,难度也较大,所以其中的任何一个环
节发生错误都有可能导致整个实验前功尽弃[14]。
1 载体的制备
BAC文库构建目前较常用的载体是由第一代
载体 pBAC108L改进而成的 pBeloBAC11,其基本结
构为质粒 F因子,大小为 7.5kb,可以插入 300kb左
右的 DNA片段。它有 4个基本功能区:parA、parB、
OriS和 RepE,确保了质粒和拷贝的稳定:parA和
parB确保分裂和质粒的稳定性,parB同时可排斥
其他 F因子;OriS保证了复制的单向性;RepE编码
的蛋白质 E确保复制从 OriS开始和拷贝的控制;
此外还有一个氯霉素抗性位点和一个 lacZ基因,
通过 lacZ的 α互补所造成的菌落兰白色来筛选白
色重组子,使得重组子的筛选更趋于直观、简便。在
近几年的基因组文库和基因的图位克隆研究中,已
从 pBeloBAC11衍生出十几种 BAC系列载体 ,它们
极大地促进了基因组文库、物理图谱的构建和基因
的图位克隆以及基因组织结构分析和遗传转化的
研 究 。 其他已经应用于 BAC构建的载体还有
pBACe3.6,pCUGZBAC1,V41(htpp:/hbz.tamu.edu)等。
载体的制备一般要经过单克隆菌的培养、质粒
的提取、纯化、酶切和脱磷等步骤。这诸多因素直接
影响着 BAC载体的质量[15]。载体制备的好坏,关系
到文库中空白载体的比例和文库的质量。载体的纯
度越高,获得阳性克隆的概率越高,文库的质量也
越好。
1.1 质粒的提取
质粒的提取一般用碱裂解(alkalinelysis)法进
行,但是 BAC质粒是单拷贝质粒,而且片段较大,
采用一般的质粒提取方法,不能获得高质量的
DNA。需要加以改进。DAVIDP对 ZhangHB发展
的 BAC质粒提取方法中的一些关键性环节进行了
改进[13],采用 SLS代替 SDS,因为有钾盐的存在,可
以更好的保存质粒。此外,将加入 SolutionⅡ后在冰
上的孵育时间调整为 4min,因为研究发现加入
SolutionⅡ后放置的时间超过 4min会降低超螺旋的
比例或引起基因组 DNA的污染,从而大大降低质
粒 DNA的产量。最后,采用醋酸钾来清洗 BAC
DNA,并用酚:氯仿进行抽提。这些改进提高了
BACDNA的产量和质量,提取的 DNA适合多种应
用,而且可以不使用试剂盒进行进一步纯化。
王省芬等人也对ZhangHB的方法进行了改进[16],
在加入 SolutionII并颠倒混匀后,放置于冰上 40
min,这样可以使菌体 DNA和蛋白质很好地沉淀下
来,而不会产生丝状物;加入异丙醇沉淀质粒 DNA
时,可以在超低温冰箱中放置 10min,使得质粒DNA
充分沉淀,以上两步的改进,可以更有效的提高质
粒 DNA的质量和纯度。
1.2 质粒的纯化
质粒的纯化一般有 2种方法:CsCl-EB密度梯
度离心(CsCl-ethidiumbromidedensitycentrifugation)纯
化和 DNA纯化试剂盒纯化。实践证明两种方法均
是行之有效的,但各有利弊。陈凡国等人 2002年对
两种方法进行了比较[17],研究发现在其他条件一致
的情况下,CsCl密度梯度离心纯化质粒得到的文库
插入片段大、插入片段的整齐度好(80%以上集中
在 100kb左右)空载率较低。但是该方法非常耗时、
而且需昂贵的高速离心机设备,另外由于使用了EB
作为指示剂,增加了实验的危险性。而DNA纯化试剂
盒纯化质粒载体快速、方便、不需要昂贵的设备。
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BoulosChalhoub等人研究发现采用两次 CsCl梯度离
心法取代一次梯度离心进行纯化,能得到很纯的载体
DNA.而且尽量简化载体制备的步骤可以减少载体的
损伤,提高克隆效率[12]。
1.3 质粒的酶切
载体完全消化所需最少酶用量及最佳的作用
时间非常重要。Osoegawa等的研究结果[18]表明,如
果酶用量过大可能导致非特异性酶切或产生星号
活性。这种非特异性酶切虽然在整个酶切反应体系
中发生的几率很小,但结果却会产生很高比例的假
阳性,从而导致整个文库的空载率过高。
1.4 质粒的脱磷
对酶切后的载体进行脱磷是制备载体过程中
至关重要的一步。确定最佳酶脱磷时间很重要,
BoulosChalhoub研究发现最佳酶脱磷时间不仅与
酶的用量有关还与酶的批次有关[12]。脱磷时既要确
保载体不受损伤,又要保证载体充分脱磷酸。脱磷
不足载体易产生自连,导致与外源 DNA的连接能
力下降,蓝斑比例升高;如果脱磷酶用量过大,又会
对载体产生损伤,同样也导致与外源 DNA的连接
能力下降,虽然白斑比例很高,但空载率也相应提
高。目前,人们使用的脱磷酶种类很多,常用的有
CIAP[10]、SPA[12]等。采用 CIAP和 SPA脱磷酶操作比
较繁琐,在酶切和脱磷结束后都要用等体积饱和
酚/氯仿进行抽提,同时也易导致载体产量降低。
而采用 EpicentreTechnologies公司的 HK脱磷酶则
操作简便,因为其配套的缓冲液为通用缓冲液,酶
切时可用它替代内切酶中的酶切缓冲液,从而在酶
切和脱磷后均可省略饱和酚/氯仿抽提,但是价格
比较昂贵。
1.5 载体的检测和回收
载体 DNA经过酶切和脱磷处理后,虽然大部
分已经是脱磷完全的线性载体 DNA,但仍有极少
量脱磷不完全的成分。在与外源 DNA连接时,不完
全脱磷的载体会优先相互连接形成连环体或环状
DNA,而丧失了与外源 DNA连接的能力,导致连
接效率降低。为了更好的检测和提高载体去磷酸化
的效果,可采用脱磷后载体自连的方法,由于线性
载体与连环体或环状 DNA在琼脂糖凝胶电泳中泳
动速率不同,因此,通过凝胶回收进一步纯化线性
载体 DNA的方法,可有效地克服上述问题,从而提
高连接效率。检验载体的质量则是把新制备的载体
与相应酶切的 λDNA连接,之后电转化涂于含 LB
平板培养基上,培养过夜后,检查蓝白斑比例,之
后通过 PFGE电泳检测含有插入片段的白斑的比
例,计算空载率,好的载体空载率应很低[19]。通过上
述方法和步骤,提高了载体的纯度和质量,保证其
符合建库要求。制备好的载体应分装成小份与甘油
混合储于-80℃的冰箱中,避免了反复冻融对载体
所造成的损伤,也避免了载体连接效率的降低。载
体一般不宜储存时间过长。
2 HMW DNA的制备
2.1 HMW DNA的提取
高分子量基因组 DNA的制备是构建 BAC文
库的另一关键难题。要构建高覆盖率和高质量的
BAC文库,首先要得到尽可能完整的大片段 DNA,
通过琼脂糖包埋块处理的方法可以保护核 DNA免
受降解,尽可能的减少裂解处理过程中对样品的药
物和机械损伤。一般有两种低熔点琼脂糖包埋核
DNA的方法,一种是将核 DNA包埋在低熔点琼脂
糖中形成栓塞(plugs),另一种是将核 DNA包埋在
低 熔 点 琼 脂 糖 和 矿 物 油 混 合 物 中 形 成 微 粒
(microbead)。第一种方法在制备方法、保护核 DNA
及操作上具有明显的优点,所以通常采用这种方
法。
在高分子量 DNA的制备过程中,必须要保证
将细胞核包埋在琼脂糖凝胶块中的质量,即细胞核
的质量和浓度、琼脂糖凝胶的浓度等[10]。若细胞核
在包埋之前破裂或细胞核浓度太低、琼脂糖浓度过
高等,都会造成失败。为防止细胞核的破裂,用于
建库的组织样必须始终在液氮中研磨而且不能碾
磨过细,细胞的悬浮要动作轻柔。研磨的时间及用
清洗缓冲液 (washbufer)清洗的次数同样十分重
要。包埋在琼脂糖凝胶栓里的细胞数目大约为(5~
7)×107ml-1,细胞浓度过高会影响酶切效果,甚至
造成无法酶切。反之,会使连接效率降低。包埋细
胞的琼脂糖浓度太高,也会影响酶切效果,反之,
凝胶栓很难成型,不易操作。
2.2 HMW DNA的部分酶切与分离
大片段的核基因组 DNA需要经过消化成为一
吴宏梅等:细菌人工染色体文库的构建方法分析 85
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
定长度的片段,为了使琼脂糖酶能充分扩散到凝胶
栓内,一方面需要把酶和凝胶栓在冰上共同孵育1h,
另一方面需增加酶和凝胶栓接触的表面积。一般可
将一块凝胶栓分成若干份,各取其中一小部分进
行酶切条件的优化,效果明显优于对整块凝胶栓
进行酶切,而且节约了试验样品,使样品能最大限
度用于 DNA的回收。大片段的操作除酶切外全部
在 4℃以下进行,这样可有效防止 DNA的物理损伤
和降解。
DNA的分离一般有一次尺度选择和二次尺度
选择(尺度选择即脉冲电泳),陈凡国等对两种选择
方法进行了比较[17],研究发现在其它条件相同的情
况下,二次尺度选择法得到的 DNA连接(100~150kb
为例)转化效率较高,转化后插入的片段整齐度好,
空载率低,但是得到的大片段 DNA浓度较低,浪费
严重;一次尺度选择法克服了二次尺度选择法的缺
点,但转化后插入的片段较小,空载率很低。为了获
得纯度高、含量多的大片段、减少大片段的降解,
同时又尽可能的去除小片段,人们采用了许多新方
法。Kazutoyo等首先提出了三步选择法,在部分酶
切前,对大片段 DNA进行适当的脉冲电泳,以便除
去小片段。这样可大大提高大片段的含量 [11]。
BoulosChalhoub也采用了三步选择法,与两步选择
法相比,可以使平均插入片段增加 70kb,并提高转
化效率[12]。
脉冲电泳用的缓冲液通常是 TAE,因为 TBE
中的硼酸根离子会抑制随后的连接反应[3]。但是因
为 TBE溶液缓冲能力强,能得到较理想的分辨率,
所以,还是很多人采用 TBE缓冲液。为了降低 TBE
中的硼酸根离子对连接反应的影响。贾玉艳等在回
收 DNA后,用 0.5×TE溶液置换掉 0.5×TBE溶液来
除去硼酸根离子[20]。BoulosChalhoub等人用 0.25×
TBE替代 0.5×TBE,结果获得了更大、更均一的
BAC插入片段,使转化效率提高了 2~3倍[12]。
3 连接、转化
DNA片段的大小对连接有较大的影响,,连接效
率随DNA片段的增大呈下降的趋势。影响连接的因
素还有酶、缓冲液、无菌水的pH值等。Kazutoyo等的
试验证明,运用 30%的 PEG8000浓缩连接体系,
可得到较高的转化效率[11]。陈凡国参考 Kazutoyo的
方法对连接液进行了浓缩实验,通过转化检验效
果,与不浓缩相比,转化效率提高了 5~10倍[17]。王
省芬也对连接产物进行了浓缩[16],但在时间上作了
调整,先用超纯水透析 2h,然后用 30%PEG透析
30min,可以达到脱盐和浓缩的目的。此外,经浓缩
的连接液应尽快用于转化,因为它与不浓缩的大片
段 DNA相比更容易降解和聚集。
电激转化的效率即每次转化产生的重组子数
量,是对构建文库的每个环节进行优化的最终目
标。在电激转化过程中,温度、电穿孔参数(电压梯
度、电阻)、宿主细胞(遗传背景、生长条件)、脉冲后
处理等因素均会影响电激转化效率。低温、低电场
强度、低电阻条件下操作有利于提高转化效率。
此外还应注意的是 DH10B是重组缺陷型的 BAC
宿主菌,电激后应立即转移到 SOC培养液中,否
则时间过长会导致转化效率大大降低。
4 BAC文库的鉴定
一个文库构建完成后,需要对文库进行评价和
鉴定,评价一个 BAC文库质量高低的标准是文库
中克隆的数量、插入片段大小、空载率、对基因组的
覆盖率、细胞器 DNA的含量及假阳性克隆的含量。
文库的质量决定了文库作用的大小。一个好的 BAC
文库应该具有大的插入片段、高的基因组覆盖率、
小的细胞质 DNA的污染及小的空载率[10]。
不同的研究目的,对文库中片段大小的要求也
不同。如用来进行大规模测序,会要求插入片段越
长越好;如克隆一个不大的基因,则片段较小有利
于转化工作。库容也可以根据研究的需要有所差
异,如用于克隆基因和测序,则对文库的覆盖率要
求高[19]:如克隆着丝粒等的重复序列,那库容量则
可大大缩小。此外,核基因组文库 DNA若混杂细胞
器 DNA的污染,不仅会降低实际库容量,还可能
会误导染色体步查走向错误方向。一般采用脉冲电
泳纯化法制备高纯度大分子量 DNA,可以从根本
上避免细胞器 DNA的污染。另外,可以线粒体基因
为探针与 BAC克隆进行菌落原位杂交,检验 BAC
克隆有无细胞器 DNA的污染。
5 前景与展望
BAC能容纳大片段 DNA,而且具有遗传特性
稳定、易于操作等优点,随着对 BAC研究的深入,
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家蚕核型多角体病毒ORF75基因的克隆和表达
河南农业大学植保学院尹新明、安世恒、江志伟、胡鹏等博士、教授根据GenBank序列 L33180设计引物用
PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒bombyxmorinueleopolyhedrovirus,BmNPVORF75基因的 DNA片段,
将其连接至PMD18-T载体上,获得了该基因的成熟蛋白阅读框序列,用设计的酶切位点将目的基因从克隆载体
上切下,表达质粒PGEX-4T-2经BamHL/XhoI双酶切,与目的片段连接,得到重阻表达质粒PGEX/Bm75。将重组
表达质粒PGEX/Bm75转化入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE分析表明产生57kDa左右
的特异蛋白质条带。他们对表达产物进行Westernblotling分析,结果表明:pGEX/Bm75IBTG诱导产生的57kDa
蛋白条带与抗体发生了很强的交叉反应,使融合蛋白获得了表达。这一研究,证明了杆状病毒大多具有宿主特异
性,即一种病毒一般只感染一种或几种近缘种昆虫,同时对病毒复制机制和病毒基因功能有了深入了解,也为病
毒与宿主间的互作找到了侵染机制,明确了资源昆虫为抗病育种打下基础。 (秦春圃)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
·信息交流·
BAC将更多地用于高等动植物的复杂系统里来研
究基因的表达与调控,在后基因组时代基因组学的
研究中发挥更重要的作用,这对于后基因计划、生
物物种改造,基因治疗等领域具有重要意义和广阔
的应用前景。
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