全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·综述与专论·
收稿日期：2008-11-13
基金项目：“十一五”奶业国家科技支撑计划（2006BAD12B08，2006BAD04A10）
作者简介：赵圣国（1984-），硕士研究生，研究方向：瘤胃微生物及酶学
通讯作者：王加启，研究员，博士生导师，主要从事反刍动物营养和牛奶质量改良研究；E-mail：wang-jia-qi@263.net
脲酶（urease），又称尿素酶或酰胺水解酶，编号
为 EC 3.5.1.5，是人类首次获得晶体的镍离子金属
酶。它能催化尿素水解，产生二氧化碳和氨，其催化
反应速度是常规化学催化的 1014 倍。 在自然界中，
很多生物体都能合成脲酶，如细菌、植物和真菌。脲
酶有助于植物和微生物体利用内源性和外源性尿
素作为氮源 ， 并能将分解产生的氨合成机体蛋白
质 [1]。 脲酶能够参与植物系统氮转运通路和毒素的
伤害 [2]；参与反刍动物尿素再循环系统 ；还能引起
人类和动物的胃肠道感染疾病的发生，如幽门螺杆
菌脲酶导致胃炎，能引起尿路感染并诱导产生尿结
石 [3]。 因此，很多研究是针对如何寻找脲酶抑制剂，
来抑制脲酶活性，保护机体感染或提高机体对氮的
利用率。
同样脲酶蛋白自身的用途也非常广泛，尤其是
近年来固定化脲酶技术大发展，极大的拓宽了脲酶
的应用范围。目前脲酶蛋白广泛应用于医学生化检
测、工业制造和环境保护中。 现就脲酶蛋白在化学
和临床分析、环境保护、生物医药工程、食品饮品和
太空飞船水循环中的应用作一综述。
1 固定化脲酶
游离脲酶由于活力不易保持、难于重复利用和
脲酶在生物工程中的应用
赵圣国 1，2 王加启 1 刘开朗 1 李旦 1 于萍 1 卜登攀 1
魏宏阳 1 周凌云 1 李发弟 2
（1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室，北京 100193；
2甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070）
摘 要： 脲酶是一种高效的尿素分解催化剂，化学反应速度是常规化学催化的 1014倍，广泛应用于工业、农业和医
药行业。论述脲酶在生物工程中的应用，内容包括检测血、尿、酒饮料、天然水和环境污水中尿素；检测肌酐和精氨酸；消除
肾衰竭病人体内多余尿素，消除酒饮料和废水中尿素；回收太空飞船上的废水和控制多级酶促反应中的 pH。
关键词： 脲酶 固定化 尿素 pH 稳定 生物反应器
Application of Urease in Bioengeering
Zhao Shengguo1，2 Wang Jiaqi1 Liu Kailang1 Li Dan1 Yu Ping1 Bu Dengpan1
Wei Hongyang1 Zhou Lingyun1 Li Fadi2
（1State Key Laboratory of Animal Nutrition，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing
100193；2Animal Science and Technology College of Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）
Abstract： Urease is a highly efficient catalyst for the hydrolysis of urea，the reaction rate of which is
approximately 1014 times than that of the noncatalyzed reaction. It has been used in agriculture，industry and medicine
areas. In this work the applications in bioengeering was reviewed，including urea content analysis in blood，urine，alcoholic
beverages，natural water and environmental wastewaters；determination of creatinine，arginine；urea removal from artificial
kidney dialyzates，alcohol beverages and fertilizer wastewaters；wastewater reclamation for life support systems in space and
pH control or shift for multi-enzyme reaction system.
Key words： Urease Immobilization Urea pH stability Bioreactor
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
难于长期贮存等缺点，其应用受到一定的限制。 而
固定化酶可作为一个良好的反应系统，使自然的酶
结合于不溶性的包埋载体材料上，使脲酶稳定性得
到加强，且可重复利用。 固定化过程具有影响酶活
性、米氏常数、最适温度、热稳定性、贮存稳定性、最
适 pH、pH 稳定性和抑制剂的作用。 固定脲酶的方
法主要有物理吸附法、交联法、包埋法和共价键合
法。物理吸附法获得的固定化酶由于重复使用次数
不高，其应用受到限制 ；而交联法或共价键合法使
酶有较好的稳定性，保持了酶的催化活性。 目前已
经有多种材料用于微生物脲酶的固定化，包括 PET
膜、氨基多糖、包醛氧淀粉、纤维素、褐藻酸钙盐、磁
性壳聚糖微球、聚苯胺、聚醚矾膜和明胶等 [4]。
邓迎迎等 [5]以甲壳素为原料制备出壳聚糖载体，
并对脲酶进行固定化。 该固定化酶的最适温度为
65℃，最适 pH 值为 6.6，米氏常数为 0.009 mol/L，较
游离酶均有较大改善。 周建琴等 [6]用戊二醛将伴刀
豆球蛋白和壳聚糖载体交联，并利用伴刀豆球蛋白
与脲酶糖链的特异性结合作用，实现脲酶的定向固
定化。定向固定化脲酶的最适 pH5.0～6.0、最适温度
77℃、米氏常数 Km 11.76 mmol/L，与游离酶相比有
更宽的 pH 适用范围 ，最适温度提高 ，与底物的亲
和力较大，且有较好的操作稳定性 。 彭虹旎等 [7]以
氨基多糖为载体材料，采用三聚磷酸钠固定的方法
制成氨基多糖微球，并以此氨基多糖微球为载体用
戊二醛交联法进行脲酶固定化研究。光滑表面微球
载体与多孔微球载体对脲酶的固定化效率分别是
51．5％和 68％；用 1．5 cm×15 cm 柱进行尿素转化时
间 12 min，光滑表面微球载体固定化脲酶和多孔微
球载体固定化脲酶对尿素溶液 （300 mg ／ L）转化率
分别为 91.8％和 99.99％。
2 检测生化指标
2.1 测定肌酐含量
肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，其在血中的
含量能反映肾脏的正常与否。脲酶可用于测定人体
肌酐的含量， 间接电导法测定肌酐含量的反应如
下：
生物传感器的酶层板中含有 3 种酶 ： 肌酸酐
酶、肌酸酶和脲酶。肌酸酐酶能将肌酐转变肌酸，再
将肌酸转变成尿素，并利用脲酶将尿素转变成氨离
子，最后利用成氨敏感电极检测氨量，通过检测氨
量来检测肌酐的含量。 该测定方法的肌酐范围是
1~50 mM，反应仅需 60 s[8]。 Pandey 等 [9]将肌酸酐酶
和肌酸酶用溶剂凝胶连接起来，用对甲基苯磺酸甲
酯将脲酶固定在多聚离子 pH 电极上，检测肌酐的
下限为 100 μM。 Karaku鬤 等 [10]将脲酶和肌酸酶固定
在聚氯乙烯氨膜电极上检测肌酐 ， 其线性范围为
1.0×10-5～1.0×10-3 M， 电极反应时间是 60 s，2 个月
后稳定性下降了 40%~45%。
2.2 测定精氨酸含量
精氨酸是生糖氨基酸 ， 对于人体营养非常重
要。 精氨酸作为药品能用于内分泌疾病的治疗，精
氨酸酶也能将精氨酸分解成尿素，常应用于生物加
工和食品行业。
L-精氨酸酶能将 L-精氨酸催化为 L-鸟氨酸和
尿素。尿素被转化成氨后，用比色法测定氨的含量。
Alonso 等 [11]再将精氨酸酶和脲酶固定在环氧酯上，
然后装入 50 mm×3 mm 玻璃柱内，检测精氨酸。 这
一酶反应器能稳定工作 6 个月，使用 800 次后酶仍
能保持 80%的活性。L-精氨酸的浓度下限为 8 mM，
在 7.5~38 mM 之间保持线性关系，相对标准偏差为
1.8%。Ramón 等 [12]利用脲酶测定葡萄汁和酒中的 L-
精氨酸含量，酒中 L-精氨酸回收率在 98.3%~104.4%
之间，变异系数在 0.4%~1.47%之间 。 葡萄汁中 L-
精氨酸回收率在 100~101.3 之间，变异系数为 0.6%。
这一方法经济廉价，每个反应大约$ 0.43，反应时间
短，优于比色分析方法。
2.3 测定尿素含量
在医药、环境和生物产业中 ，尿素浓度的测定
具有重要的意义。由于人体血液中尿素的测定在临
床医学上有重要的实用价值（血液中尿素的浓度高
低可判断肾脏功能是否正常）， 所以脲酶电极是近
年热点研究的一类酶电极。尿素水解产生的氨和二
氧化碳能引起反应液 pH、离子组成和温度的变化。
根据酶促反应来测定这些变化形成了许多种测定
尿素浓度的检测方法。但是，溶液中的酶并不稳定，
需要足够多的数量来维持，目前常利用固定化脲酶
肌酐+H2O
肌酸酐酶
肌酸+H+
肌酸+H2O
肌酸酶
肌氨酸+尿素+H+
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技术。 固定化脲酶技术包括电位分析方法（氨或二
氧化碳敏电极、氨离子电极、pH 电极和场效应晶体
管），电流计法、电导滴定法、光学法 、热量法、声学
法、比色法和离子对高效液相色谱法 [13]。 商业化脲
酶生物传感器能用于测定血清、 尿液、 天然水、废
水、食品和酒中尿素浓度。
Boubriaka 等 [14]在离子敏感场效应晶体管上面
覆盖一层牛血清白蛋白薄膜后将脲酶固定在上面，
用于测定血清中的尿素浓度 ， 尿素浓度在小于 2
mM 时具有良好的线性关系，与传统化学的脲酶-吲
哚苯法一致。 Suye 等 [15]利用荧光素钠作为荧光染料
来反映 pH 的改变。 在 λex=490 nm 和 λex=514 nm 下
测定荧光强度，当尿素浓度在 0.25～3 mM 时，能呈
现很好的线性关系，相关系数为 0.996；当利用光导
纤维探针来测量荧光强度时， 当尿素浓度在 0.10～
1.75 mM 时呈现线性关系。
3 控制尿素含量
3.1 消除肾衰竭病人体内多余的尿素
尿素是氮代谢过程的主要废物，消除肾衰竭病
人体内尿素非常重要。 由于尿素没有很好的吸收
剂，最有效的方法是利用脲酶来消除。 1964 年人们
就开始利用脲酶消除尿素，在体外人工细胞中利用
脲酶成功地将尿素转变成了氨，但是，血氨浓度高
于 10-4 M 时易引起人体氨中毒。 因此，应用该方法
必须有去除氨的配套措施。 1973 年，Patzer 等 [16]在人
工细胞上将脲酶微囊化处理，再利用化学吸收剂去
除氨。 根据这一原理生产出了人工肾脏。
目前利用的氨吸收剂的吸收能力有限，除了利
用气体膜除氨外，而且尿素去除膜反应器结合固定
化电透析也有报道。另一种方法是利用多重酶体系
将尿素和氨转变成必须氨基酸。微囊多重酶体系包
括脲酶、 谷氨酸脱氢酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，它
能将尿素转变成谷氨酸，但谷氨酸脱氢酶和 6-磷酸
葡萄糖脱氢酶能使 NADPH 循环再生， 而且谷氨酸
能形成丙氨酸。 多重酶体系也用于肝衰竭病人，尿
素能被有效的转变成 L-缬氨酸 、L-亮氨酸和 L-异
亮氨酸 [17]。
口服疗法治疗尿毒症的原理是通过口服制剂
吸附人体肠道中的尿素，因为由肝脏产生的尿素有
20％将随血流扩散到人体肠道中去，此法可间接降
低血液中的尿素浓度。处于研究中的口服吸附剂有
多种，其中最具创新和有明显效果的是加拿大麦吉
尔大学的研究，他们将脲酶基因工程菌包埋在 APA
微囊内 ，口服治疗肾衰竭鼠模型 ，获得成功 [18]。 但
是，重组菌的安全性值得担忧。 Chow[19]等利用藻酸
盐-多聚赖氨酸-藻酸盐高分子膜包被能分泌脲酶
的徳氏乳杆菌，制成微囊，尿毒症患者口服 24 h 内
能有效的降低血中尿素和氮的浓度。
3.2 回收利用太空飞船上的废水
在孤立的太空飞船上，水的循环再利用非常重
要，利用脲酶净化水是很有意义的 [20]。 Schussel[21]等
建立和评价了利用固定化脲酶生物反应器持续消
除封闭环境中的尿素。该生物反应器均包括了 5 个
床层。 从里到外，第一个床由两个离子交换系统组
成，目的是去除碘，防止对第二床层中脲酶活性的
影响， 第二床层中脲酶将尿素水解成氨和二氧化
碳，后面的两个床层用于去除产生的离子，如 NH4+
和 HCO3-。 最后一层床位是用无菌碘来对流过的水
杀菌。 200 cm3 的固定化脲酶生物反应器能持续运
行 220 d。该生物反应器已经通过太空飞船废水（卫
生水和尿液）的检测验证。
3.3 清除酒饮料中的尿素
酒精饮料中含有致癌性化学物质氨基甲酸乙
酯 （Ethylcarba-mate），它是由尿素和乙醇经化学反
应形成的。 因此，去除酒饮料中的尿素对于控制产
品质量是非常重要的。 早在 1977 年，就有人利用脲
酶去除酒中的尿素。 但是，刀豆脲酶的最适 pH 为
7.0，米酒和白酒中 pH4.4 和 3.2，所以脲酶加入后
活性必然会很低 [22]。
随后，人们陆续从乳酸菌和其它微生物中发现
了酸性脲酶。 吴伟祥等 [23]利用筛选的肠杆菌属一株
菌 9043 C12 产生的脲酶， 在 25℃，pH 5.0 条件下，
在含乙醇 16%或 20%（v/v）、 尿素 30 mg/L 的模拟
酒中添加 10 U/L 脲酶， 可使尿素去除率在 36 h 内
达 90%以上。 在美国和日本，脲酶已经应用于工业
化生产中，但直接添加脲酶有很多缺憾，如价格贵，
处理时间长（7~30 d），不能连续处理和脲酶必须被
巴氏灭活。所以，工业大规模处理中，通常用固定在
壳聚糖衍生物上的脲酶处理酒饮料。 Marco 等 [24]证
明用此方法在低温 （5~15℃） 高流速条件下运行
赵圣国等：脲酶在生物工程中的应用 39
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
150 多天后，米酒中尿素的浓度能下降到 3 ppm。
3.4 处理含尿素的工业废水
在工业废水中含有大量的尿素和氨，废水氨氮
含量能达到 125 mg/L， 尿素含量能达到 750 mg/L。
现代尿素处理系统是对废水进行高温（190~290℃）
和高压（10~20 kg/cm2）处理 [25]。 但是，热处理水解尿
素技术有很多缺陷，因利用脲酶水解尿素是很好的
选择。
可以直接利用脲酶，或利用具有脲酶活性的微
生物处理废水，产生的氨能通过气流、蒸汽或离子
交换来回收。 生物处理过程包括尿素水解成氨、硝
化和去硝化过程。 由于废水的 pH 通常高于 9.0，可
以通过加入磷酸，通入二氧化碳降低 pH，维持脲酶
活性。 用缓冲液和 EDTA 处理工业上废水价格比较
贵，并污染环境。因此，对于生物反应器的稳定性仍
是个问题。有人通过培养微生物分泌脲酶对污水进
行净化 [26]。
杨少斌等 [27]采用等离子体引发聚四氟乙烯（FE）
表面固定化脲酶，并利用固定化酶膜处理含尿素废
水。 研究发现， 固定化酶处理 900 mg/L 的尿素废
水，30℃以上的温度下 1 h 以内尿素转化率能保证
在 90％ 以上，并且固定化酶比活力不变。魏永峰等 [28]
发现壳聚糖球珠固定化脲酶的储藏稳定性优于游
离酶，但催化活性小于游离酶，其米氏常数小于游
离酶。应用所制备的固定化酶检测分析废水中的尿
素，线性范围为 1.0×10-5～5.0×10-3 g/ml，平均回收率
（100±3.2）％，检出限 1.0×10-5 g/ml。
4 控制或改变生物反应器中 pH
幽门螺杆菌的细胞膜中的脲酶能水解尿素产
生缓冲液-氨和氨基甲酸酯， 保证了幽门螺杆菌在
强酸性胃环境中的生存和定植，这类似于固定化脲
酶反应和酶联免疫分析中 pH 的控制技术 [29]。 通过
不断地滴定可以控制生物反应器中的 pH， 但是这
些反应是在固相介质中，滴定极易引起酶微环境中
pH 的不稳定。
在多级酶化学反应中，一个酶反应的产物是另
一个酶反应的底物 ，稳定的 pH 至关重要 ，并且每
一步的最适 pH 都各有不同。 在工业中，利用葡萄
糖糖化酶和葡萄糖异构酶催化生产高果糖浆，这两
种酶的最适 pH 值分别是 5.0 和 7.0~8.5。 当把两种
酶同时置于 pH6.5 的环境中进行催化反应时，两种
酶的活力都很低。利用含脲酶的薄层允许两步酶反
应同时进行， 利用尿素水解生成的氨消耗氢离子，
保证葡萄糖异构酶维持在最适 pH5.0[30，31]。 双酶免
疫分析法也需要不同的 pH， 辣根过氧化酶为 5.1，
β-糖苷酶为 7.0， 脲酶能将 pH 自动改变到所需的
最适 pH，以使辣根过氧化酶和 CAL 快速反应 [32]。
5 结论
利用脲酶测尿素和肌酐去除人工肾脏和酒精
中的尿素都已经商业化生产。但是其中最重要的问
题是酶的稳定性，固定化脲酶具有几天到 1 年的半
衰期，根据载体物，固定化程序和应用不同。 因此，
脲酶研究的一个趋势是寻找一个能获得高活性或
长期稳定性固定化酶的方法和分离具有高活性微
生物脲酶，耐热性脲酶，碱酸性 pH 脲酶。 利用具有
脲酶活性的微生物替代游离性脲酶也是另一个趋
势。 水解产物氨，能提高溶液 pH，能抑制和消除脲
酶活性。目前已有利用离子交换、吸收、电透析和气
膜分离方法去除氨的报道，但是，大多数情况下去
除的效率并不理想，有待于进一步研究。
固定化细胞是一种很有前途的处理技术，特别
适用于抑菌性强的废水处理，固定化细胞能保持高
活性。 而微生物是脲酶的主要来源，通过对产脉酶
的微生物进行筛选和优化处理，达到大规模生产脲
酶的目的，这也是目前研究的一个热点。此外，固定
化微生物技术还有很多问题有待解决，这也是今后
一段时间内固定化技术的研究方向。 首先，载体是
固定化技术的重要组成部分，而目前载体价格仍然
令人难以承受。一般固定化微生物半衰期较长的也
仅能达到多天，要经常更换载体，不经济，而且运行
管理繁琐。 因此，进一步开发新型优良的固定化载
体对固定化技术的发展至关重要。 其次，固定化微
生物的稳定性及性能的改善也是研究的一个重点。
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