全 文 ：收稿日期：2009- 05- 10；修改日期：2010- 04- 20
基金项目：国家“十一五”科技支撑项目(N0.2007BAD50B01- 02- 04)资助
作者简介：武慧玲（1984-），女，山西孝义人，硕士，主要从事土壤脲酶抑制剂的研究。
*通讯作者：E- mail: shwang200@yahoo.com.cn；Tel：028- 85417281
小叶女贞叶提取物对脲酶的抑制作用
武慧玲，薛立微，王胜华 *，陈 放
（四川大学 生命科学学院，生物资源与环境教育部重点实验室，四川 成都 610064）
摘 要：以小叶女贞叶的水提物对脲酶的抑制作用进行研究，目的在于开发一种低廉优质的植物性脲酶抑制剂，同时也是
对废弃物的再利用。从小叶女贞的叶片中提取并分离了抑制脲酶的活性部分（LQE），收得率为 5.92%。LQE对刀豆脲酶有较
强的抑制作用，5 mg LQE与 76.3 mg硼砂的抑制效果相当。LQE对脲酶的抑制作用随着温度的升高（4 ~ 60 ℃）而增强。pH
5.5 ~ 9.0范围内，LQE有明显的抑制脲酶的活性，而且中性和碱性环境中 LQE的抑制率高于酸性环境。加入β- 巯基乙醇
（2- Me）后，脲酶的活性恢复，说明 LQE是通过与脲酶的 - SH发生作用而导致脲酶的活性降低。LQE可以有效抑制不同土壤
中脲酶的活性，延缓尿素的水解，并且其抑制程度随用量的增加而提高。小叶女贞广泛分布于中国，有耐修剪、生长快、低
廉、环保等优越性能，因此可以利用其叶片提取物降低土壤脲酶的活性，提高尿素的利用率，减少环境污染。
关 键 词：脲酶；抑制；小叶女贞提取物；尿素水解
中图分类号：S154.2 文献标识码：A 文章编号：0564- 3945(2011)02- 0311- 05
Vol .42 ,No .2
Apr . , 2011
土 壤 通 报
Chinese Journal of Soil Science
第 42卷第 2期
2011年 4月
尿素因其含氮量高、性质稳定、施用方便等特点，
成为世界上应用最多的一种氮肥，2006年约占氮肥消
耗总量的 51%[1]。但由于尿素表施到土壤中，经土壤脲
酶的作用，被迅速水解成氨，容易造成氨挥发，导致尿
素利用率不高，同时土壤微域内高浓度的氨及土壤 pH
的增加会伤害发芽幼苗和幼龄植株[2]。另外当氧气充
足时，氨易硝化产生亚硝酸，使大气及水体遭受污染，
已经成为人类患癌症的最主要因素[3]。解决问题很重
要的途径之一就是抑制脲酶活性。在抑制脲酶活性的
研究中，国内外学者做了大量的工作。现今已发现的
脲酶抑制剂有几百种，这些物质中抑制脲酶的效果各
不相同，但是有成本高，有毒，对植物及土壤有害，对
环境会造成污染等缺点[4,5]。因此开发具备高效、低廉、
无毒、无污染等优点的脲酶抑制剂显得非常重要。
小叶女贞（Ligustrum quihoui Carr.），木犀科，女贞
属，主要分布于华北、华中和西南地区。喜光照，稍耐
荫，较耐寒；对二氧化硫、氯等毒气有较好的抗性，可
在大气污染严重地区栽植。性强健，萌发力强，老桩移
栽极易成活。基于这些优良品质，小叶女贞已经成为
园林绿化中重要的绿篱材料而且被广泛种植于中国
的很多地方[6]。
通过研究发现小叶女贞叶的水提物对脲酶有抑
作用。小叶女贞又有常见，耐修剪，生长快，低廉、环保
等一些优越的性能[7]，因此本实验对小叶女贞叶提取物
对脲酶的抑制作用进行研究，目的在于开发一种低廉优
质的植物性脲酶抑制剂以增加脲酶抑制剂的来源，从而
延缓尿素水解，提高氮素利用率，减少环境污染。
1 材料与方法
1.1 供试材料
小叶女贞叶，采自四川大学校园内。
固体刀豆脲酶（29 500 U g-1），由 sigma公司提供。
使用前用蒸馏水新鲜配置成 10 U ml-1的水溶液。供试
土样（0 ~ 15 cm），使用前风干，研磨，过 1 mm筛待用。
理化性质采用北京强盛分析仪器制造中心生产的
TFC- 203PCB型土肥测试仪测定，脲酶活性采用靛酚
蓝比色法检测[8]，结果见表 1。
土样类型
Soil type
铵态氮（mgkg-1）
速效磷（mgkg-1）
速效钾（mgkg-1）
盐分（g kg-1）
有机质（g kg-1）
pH（水∶土 =2.5∶ 1）
脲酶活性（mgh-1 g-1 soil）
黄壤
Yellow
98.2
4.24
133.8
0.09
16.56
4.0
0.059
砖红壤
Laterite
35.8
11.9
8.41
<0.01
42.89
6.0
0.036
赤红壤
Red
53.5
18.9
328.8
0.18
50.95
5.9
0.029
紫色土
Purple
45.2
4.55
373.0
0.20
20.01
6.1
0.012
表 1 供试土样的理化性质及脲酶活性
Table 1 General characteristic of soil samples
第 42 卷土 壤 通 报
1.2 试验方法
1.2.1 小叶女贞叶提取物（LQE）的制备 取小叶女
贞叶洗净阴干打粉，称取 10 g加入 10倍的蒸馏水 60
℃超声波提取 1 h后过滤，重复 2 ~ 3次，合并滤液减
压浓缩成浸膏。依次用石油醚，三氯甲烷和水饱和的
正丁醇萃取，减压浓缩正丁醇液得浸膏，真空冷冻干
燥后用少量水溶解，上聚酰胺凝胶柱，水洗脱液经减
压浓缩蒸干得到小叶女贞叶的提取物（LQE）5.92 mg。
用蒸馏水配置成 5 mg ml-1的 LQE 水溶液，- 20 ℃保
存。
1.2.2 LQE对刀豆脲酶抑制作用与硼砂的比较 将
1 ml固体脲酶液和 1 ml LQE溶液或 7.63 ~ 76.30 mg
的硼砂室温混合 1 h后加入 4 ml柠檬酸盐缓冲液（pH
6.7）及 0.1 g尿素，蒸馏水定容到 20 ml，于 37 ℃培养。
定时测定脲酶活性及 NH3- N的释放量。
1.2.3 温度对 LQE抑制作用的影响 将相同的脲酶
抑制剂混合物（20 ml：含 10 U脲酶，5 mg LQE，4 ml
pH 6.7的柠檬酸盐缓冲液，0.1 g尿素）置于不同温度
下（4, 24, 37, 50, 60 ℃）培养，1 h后取样测定脲酶活
性并计算抑制率。抑制率计算方法：
抑制率（%）=（A- B）/A×100%
式中 A表示不加抑制剂时的脲酶活性，B表示加
入抑制剂时的脲酶活性。
1.2.4 pH对 LQE抑制作用的影响 将 1 ml固体脲
酶液和 1 ml LQE溶液室温混合 1 h后加入 4 ml不同
pH（4.0 ~ 9.0）的柠檬酸盐缓冲液及 0.2 g尿素，蒸馏
水定容到 20 ml，于 37 ℃培养，定时测定脲酶活性。
1.2.5 β-巯基乙醇（2-Me）对 LQE抑制作用的影响
将 1 ml固体脲酶液和 1 ml LQE 溶液及不同浓度的
2- Me（0 ~ 21 mmol）室温混合 1 h后加入 4 ml柠檬酸
盐缓冲液（pH6.7）及 0.2 g尿素，蒸馏水定容到 20 ml，
于 37 ℃培养，定时测定脲酶活性。
1.2.6 LQE对土壤脲酶的抑制作用 向 10 g土样中
加入 2 ml甲苯（以能全部使土样湿润为度），15 min后
加入不同量的 LQE（0 ~ 20 mg）和 20 ml柠檬酸缓冲
液（pH6.7），混匀。1 h后加入 1 g尿素定容到 100 ml，于
37 ℃培养。隔天取样测定由脲酶水解的 NH3- N释放
量。每次处理设置 3次重复，数据处理和统计分析采用
Microsoft Excel和 SPSS 11.0软件，结果以平均值表示。
2 结果与讨论
2.1 LQE对刀豆脲酶抑制作用与硼砂的比较
含硼化合物，如硼酸、硼砂等，可作为脲酶抑制剂
是 Sor等[9]提出来的。含 4%硼砂的尿素与一般尿素一
起施入土壤 20 d 后，氨的挥发损失率分别为 23%和
43.3%[10]。实验中应用不同量的硼砂作为对照，衡量了
LQE的抑制作用。从图 1中可以看出，在 LQE和硼砂
相等用量（5 mg）的情况下，前者的抑制效果明显高于
后者。培养 2 h内，5 mg LQE的抑制作用与 76.3 mg的
硼砂作用相当，2 h后，前者的抑制效果优于后者。说
明小叶女贞叶的提取物相比硼砂来讲是一种很高效
的抑制剂。
2.2 温度对 LQE抑制作用的影响
从表 2可以看出，脲酶的最适温度为 50 ℃，这与
Wilson等[11]报道的结果相似。含 LQE的混合物中，脲
酶活性明显低于不加 LQE的混合物；而且 LQE对脲
酶的抑制率随温度的升高（4 ~ 60 ℃）而增大。这说
明，提高温度有利于 LQE与脲酶的结合，导致脲酶活
性的降低。这一结果与 Sahrawat [4]所报道的 130种化合
物对土壤脲酶的抑制作用随温度的升高而降低正好
相反，可能由于脲酶抑制剂不同，还可能与脲酶的状
态有关。
2.3 pH对 LQE抑制作用的影响
从图 2可以看出，pH < 5.0和 pH > 9.0时，脲酶
处于失活状态；pH6.5时脲酶活性达到最大值；脲酶酶
促反应的最适 pH 范围为：pH6.0 ~ 8.0。这与
Frankenberger等[12]提出的 pH 6.0 ~ 9.0较为接近。
pH5.5 ~ 9.0范围内，LQE可以明显的抑制脲酶的
活性，而且碱性环境中 LQE的抑制率高于酸性环境。
含 10 mg的 LQE 混合物中，pH5.5 ~ 6.5 时抑制率为
63.0% ~ 76.7%，pH7.0 ~ 8.5 时为 85.8% ~ 91.5%。
LQE对脲酶抑制作用的 pH范围比较广，NBPT对脲酶
注：NH3- N的含量为由脲酶水解的释放量
图 1 LQE抑制作用与硼砂的比较
Fig.1 Inhibition of jack bean urease by LQE compared with borax
312
2 期
温度
Temperature
（℃）
4
24
37
50
60
LQE 5 mg抑制率
Inhibition rate
（%）
31.31
38.21
50.13
63.98
64.40
LQE 0 mg
0.713
1.526
2.714
3.038
2.750
LQE 5 mg
0.490
0.943
1.354
1.094
0.979
脲酶活性 Urease activity
（NH3- N, mg h-1）
表 2 温度对 LQE抑制作用的影响
Table 2 Effects of temperature on inhibition of urease by LQE
武慧玲等：小叶女贞叶提取物对脲酶的抑制作用
的抑制最适 pH为 5.91[13]，NSKP仅在酸性条件下对土
壤脲酶有抑制作用 [14]。这些结果说明 LQE在不同的
pH条件下均有很强的抑制作用，而且随着尿素的水
解，pH的升高，LQE的抑制作用增强。
2.4 β-巯基乙醇（2-Me）对 LQE抑制作用的影响
脲酶是富含巯基的一种酶，刀豆脲酶中含有 15
个半胱氨酸残基[15]。图 3中显示，含 5 mg LQE和 2- Me
的混合物中，脲酶的活性得到恢复，并且随着 2- Me用
量的增加而增加。类似的现象也见于其他一些脲酶抑
制剂，如α, β- 不饱和酮[16]，α- 羟基酮[17]，苯醌[15]。说
明 - SH是脲酶的一个活性部位，LQE是通过与脲酶的
- SH发生作用而导致脲酶的活性降低，推测其中起抑
制作用的成分为酚类物质。
另外，2- Me在浓度很小（3.5 mmol）的情况下即可
恢复被 LQE所抑制的脲酶活性（图 3），这与 2- Me和
DTT可以降低雷贝拉唑（rabeprazole）的抑制作用[18]相
同，推测 LQE可能对别的巯基酶也有抑制作用，这一
点还有待考证。
2.5 LQE对土壤脲酶的抑制作用
如图 4所示，在初始的 4 d内，土壤脲酶的活性较
高，随后脲酶的活性逐渐降低。不同土壤的脲酶活性
不同，脲酶活性越高的土壤尿素分解速率越快。土样 a
中，无抑制剂对照组的 NH3- N释放量为 35 mg的时间
为 4 d（图 4a），而土样 b，c，d则分别需要 7，11，15 d
（图 4 b, c, d）；NH3- N达到最大释放量（45 mg）依次所
需 10，14，21，29 d（图 4a, b, c, d）。
含 LQE的混合物中，几种不同的土壤脲酶的活性
降低，尿素的分解速率明显延缓；其抑制程度随用量
的增加而增强；土壤脲酶活性越高，达到相同抑制作
用所需 LQE越多。因此在土壤中可以通过控制 LQE
的用量，使尿素的分解速度与植物吸收氮的速度同
步，提高 N的利用率。
图 2 pH对 LQE抑制作用的影响
Fig. 2 Effects of pH on inhibition of urease by LQE
图 3 2-Me对 LQE抑制作用的影响
Fig. 3 Effects of 2- Me on inhibition of urease by LQE
注：NH3- N的含量为由脲酶水解的释放量
313
第 42 卷土 壤 通 报
注：NH3- N的含量为由土壤脲酶水解的释放量（P<0.05）；图 a, b, c, d分别表示 LQE对土样 a, b, c, d（表 1）中土壤脲酶的抑制作用
图 4 LQE对土壤脲酶的抑制作用
Fig. 4 Inhibition of LQE on soil urease in 4 different soils
3 结论
按照活性追踪的方法，从小叶女贞叶片中提取到
可以抑制脲酶的活性部分（LQE），收得率为 5.92%。
LQE对刀豆脲酶有较强的抑制作用，相当于 15倍质
量硼砂的抑制效果。随着 LQE浓度增加，抑制作用增
强。LQE对脲酶的抑制作用随着温度的升高而增强。
pH5.5 ~ 9.0 范围内，LQE 可以明显的抑制脲酶的活
性，而且碱性环境中 LQE的抑制率高于酸性环境。β-
巯基乙醇（2- Me）可恢复被 LQE抑制的脲酶活性，说
明 LQE是通过与脲酶的 - SH发生作用而导致脲酶的
活性降低。
LQE对几种不同的土壤的脲酶均有不同程度的
抑制作用；其抑制程度随用量的增加而提高。因此
LQE可以用来抑制土壤脲酶的活性，减缓尿素的水
解，提高 N的利用率，减少环境污染。但是 LQE进入
农田生态环境后，是否能够对农产品的增产起到一定
的作用，对生态学质量是否有影响目前还不能确定，
因而将其应用于农业之前仍需进行进一步的研究。
参考文献：
[ 1 ] VAIO N, CABRERA M, KISSEL D E, et al. Ammonia volatilization
from urea- based fertilizers applied to tall fescue pastures in Georgia,
USA [J]. Soil Science Society of America Journal, 2008, 72: 1665 -
1671.
[ 2 ] ZAMAN M, NGUYEN M L, BLENNERHASSETT J D, et al. Reduc-
ing NH3, N2O and NO3-- N losses from a pasture soil with urease or
nitrification inhibitors and elemental S- amended nitrogenous fertiliz-
ers [J]. Biology Fertility Soils, 2008, 44: 693 - 705.
[ 3 ] 王天元，宋雅君，滕鹏起. 土壤脲酶及脲酶抑制剂[J]. 化学工程师,
2004, 8: 22 - 24.
[ 4 ] SAHRAWAT K L. Control of urea hydrolysis and nitrification in soil
by chemicals prospects and problems [J]. Plant Soil, 1980, 57: 335 -
352.
[ 5 ] YAN X, JIN J Y, HE P, et al. Recent advances on the technologies to
increase fertilizer use efficiency [J]. Agriculture Science in China,
2008, 7: 469 - 479.
[ 6 ] 朱 莉，李延成. 小叶女贞在城市园林绿化中的应用[J]. 山东林业
科技，2004, 5: 59 - 60.
[ 7 ] 姜 龙，冯 凯. 小叶女贞盆景制作技术[J]. 科技与应用，2008, 2:
73 - 74.
[ 8 ] 关松荫. 土壤酶及其研究法 [M]. 北京: 农业出版社, 1987: 115 -
297.
[ 9 ] SOR K M. US patent office: 3232740 [P]. 1966.
[10] GEISSLER P R. US patent office: 3523018 [P]. 1970.
[11] WILSON D J, VAN DER WAL R, CHANG E R, et al. Urea hydrol-
ysis and nitrification in Arctic salt marsh soils- possible constraints on
growth of forage plants [J]. Ecoscience, 1999, 6: 72 - 78.
314
2 期
Inhibition of Urease by Ligustrum quihoui Carr. Extract
WUHui- ling, XUE Li- wei, WANGSheng- hua*, CHEN Fang
(Key Lab of Bio-resources and Eco-environment, Ministry of Education, College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China)
Abstract: The inhibitory effects of Ligustrum quihoui Carr. extract (LQE) on urease were investigated in order to
discover a new source of urease inhibitor and reuse the abandoned leaves. The rate of LQE extraction was 5.92%. LQE
showed potent inhibition against jack bean urease and the inhibition by 5 mg LQE was equivalent to 78.30 mg borax.
The inhibition increased with temperature from 4 to 60 ℃. LQE could inhibit urease widely at pH 5.5 - 9.0 and the
inhibition was stronger in neutral and alkaline conditions than in acid ones. The inhibitory effects were blocked by
β- mercaptoethanol (2- Me), which indicated that LQE inhibited urease by binding to cysteinyl residues. LQE could
inhibit soil urease activities and retard the urea hydrolysis in dose- dependent manner when applied in different soils.
Ligustrum quihoui is a widespread plant in China with a lot of good qualities, such as strong abilities of adaptation,
sprouting, regeneration, and anti- pollution. Thus it would be a great potential plant and LQE could be applied in soil
for the better use of urea and preventing environmental pollution.
Key words: Urease; Inhibition; Ligustrum quihoui Carr. extract (LQE); Urea hydrolysis
[12] FRANKENBERGER W T J, JOHANSON J B. Effect of pH on en-
zyme stability in soils [J]. Soil Biology Biochemistry, 1982, 14: 433 -
437.
[13] 孙庆元，张雪崧，王艳红. 土壤脲酶抑制剂正丁基硫代磷酰三胺的
作用基团研究 [J]. 土壤, 2007, 39 (3): 492 - 495.
[14] MOHANTY S, PATRA A K, CHHONKAR P K. Neem (Azadirachta
indica) seed kernel powder retards urease and nitrification activities
in different soils at contrasting moisture and temperature regimes [J].
Bioresource Technology, 2008, 99: 894 - 899.
[15] ZABORKA W, KRAJEWSKA B, KOT M, et al. Quinone- induced
inhibition of urease: Elucidation of its mechanisms by probing thiol
groups of the enzyme [J]. Bioorganic Chemistry, 2007, 35: 233 - 242.
[16] TANAKA T, KAWASE M, TANI S. Urease inhibitory activity of sim-
ple α, β- unsaturated ketones [J]. Life Scencience, 2003, 73: 2985
- 2990.
[17] TANAKA T, KAWASE M, TANI S. α- Hydroxyketones as inhibitors
of urease [J]. Bioorganic & Medical Chemistry, 2004, 12: 501 - 505.
[18] TSUCHIYA M, IMAMURA L, PARK J B, et al. Helicobacter pylori
urease inhibition by rabeprazole, a proton pump inhibitor [J]. Biology
Pharmacology Bulletin, 1995, 18: 1053 - 1056.
武慧玲等：小叶女贞叶提取物对脲酶的抑制作用 315