全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
拟南芥低盐敏感突变体的筛选
张丽霞 1, 3 李卓夫3 杨德鑫 3 王瑞刚 2 李国婧 1, 2 黄荣峰 3
( 1内蒙古农业大学农学院,呼和浩特 010019; 2内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特 010018;
3中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081 )
摘 要: 通过对 ein31 功能缺失型突变体种子进行 EMS诱变, 筛选到 47株盐敏感突变体。根据对盐敏感程度的不同
将其分为 3类, 分别为低盐超敏感突变体 ( low concentra tion o f sa lt hypersens itive mutants, lsh) ,低盐中等敏感突变体 ( low con
centration of sa ltm oderatesensitivemu tants, lsm )和低盐弱敏感突变体 ( low concentra tion o f sa lt slightsensitivem utants, lss)。以其
中一株 lss3为例, 进行了深入研究。根据遗传分析和生理试验表明, lss3 是以 ein31为背景的隐性双突变体, 而且具有比 Co l
0和 ein31 更加敏感的盐表型。三重反应表明, lss3与 ein31 类似,表现出对 ACC不敏感的表型。推测 lss3 突变的基因可能
与乙烯信号途径组分 E IN3有关,也可能与之无关, 仅是参与抗盐的一个新基因。
关键词: ein3 1 甲基磺酸乙酯 低盐敏感突变体 乙烯信号转导途径
Identifying Low Concentration of Saltsensitive
Mutants ofArabidopsis
Zhang L ix ia
1, 3 L iZhuofu3 Yang Dex in3 W ang Ruigang2 L iGuo jing1, 2 Huang Rongfeng3
(
1
Agricultural College, InnerM ongo lia Agricultural University, H ohhot 010019;
2
College of L ife Sciences, InnerM ongolia Agricultural
University,H ohhot 010018;
3
B iotechnology R esearch Institute, ChineseA cademy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstrac:t In order to screen and identify low concentration o f saltsens itive mutants, w e generated an A rab idop sis ein3 1 m utant
pool by ethy lm e thanesu lfonate ( EMS) . B ased on the fact that A rab idop sis ein31 seedling s are sensitive to 100 mm o l/L NaC,l we then
screened and identified ca. 47 pu tative sensitivem utants from the ein31 seedm utagen ized mutants w ith 75 mm o l/L NaC .l These mu
tants can be c lassified into low concentra tion o f sa lt hype rsensitivemu tants ( lsh ), low concentration of salt m oderatesensitive mutants
( lsm ) and low concentra tion o f sa lt s lightsensitivem utants ( lss ). Furtherm ore, we take an examp le o f lss3 m utan t to study in dep th.
Genetic ana lysis ind ica tes that lss3 is a recessive mutant, w hich ism ore sens itive to 75 mm o l/L NaC l than Co l0 and ein31, ind ica ting
tha t lss3 genem ight be assoc ia ted w ith sa lt response. Physio log ica l test suggests that themuta tion of lss3 keeps the trip le response of
ein31 sing le mutant, ind icating that the alteration of sa lt sens itiv ity in lss3 mutant is possibly assoc ia ted w ith the e thy lene s igna ling
component of EIN3, or a new gene is in connection w ith salt stress.
Key words: ein31 E thy lm ethanesulfonate Low concentration o f sa lt sensitive mutants Ethylene signaling pathw ay
收稿日期: 20100601
基金项目:国家基础研究项目 ( 2006CB100102) ,国家自然科学基金项目 ( 90917018)
作者简介:张丽霞,女,博士,研究方向:植物分子生物学; Em ai:l zhangl ixia522522@ 163. com
通讯作者:黄荣峰,研究员,研究方向:作物抗逆基因工程; Em ai:l rfhu ang@ caas. n et. cn
植物由于固着生活的特点,在其整个生活史中往
往要遭受多种多样的生物胁迫和非生物胁迫,如病虫
害、高盐、高温、干旱、冻害和机械损伤等,其中高盐严
重影响了植物的生长发育, 制约着农作物的产
量 [ 1- 3]。经过科研工作者多年的潜心研究,植物适应
盐胁迫的机制逐渐被挖掘出来,其中包括许多信号途
径。例如,调节离子平衡的 SOS途径 [ 2] ,诱导启动子
含有干旱响应元件 DRE /CRT基因表达的 ICEDREB
途径 [ 4]和调控渗透调节物质和抗氧化酶的 MAPK途
径等 [ 1, 3, 5 ]。此外,植物激素及其信号转导途径也参
与盐反应过程,例如乙烯、脱落酸和茉莉酸等 [ 6- 8]。
乙烯是一种具有生物活性、重要的内源性植物激
2011年第 1期 张丽霞等:拟南芥低盐敏感突变体的筛选
素,它调节植物的生长发育和许多生理生化过程,并且
乙烯在应对生物胁迫和非生物胁迫过程中也起到了至
关重要的作用 [ 9, 10]。近几年, 关于乙烯及乙烯信号途
径与盐反应的报道也相继增多。研究表明, 乙烯及整
个乙烯信号转导途径 (包括受体、CTR1、E IN2和 E IN3)
都参与植物盐胁迫过程 [ 11- 14]。但仍存在许多问题,例
如, E IN3下游与盐有关的基因是什么,功能缺失型突变
体 ein2比 ein3 1具有更敏感的表型,那么与 EIN3平行
是否还存在其他的支路参与盐反应等。
拟南芥由于植株小、生长周期短,是目前已知植
物基因组中最小的, 这就使克隆其相关基因相对比
较容易。拟南芥是自花受粉植物,基因高度纯合,用
理化因素处理突变率很高, 容易获得各种功能缺陷
型突变体;此外, 拟南芥基因组的成功测序为基因功
能分析和遗传改良奠定了坚实的基础, 继而可以通
过图位克隆等方法分离鉴定突变体基因, 进一步揭
示其基因功能。以野生型拟南芥 Co l0为背景进行
诱变突变体的筛选几乎达到饱和, 为了能筛选到更
多新的基因,必须改变策略。
本试验以功能缺失型突变体 ein3 1 [ 15]种子为
试验材料, 以烷化剂甲基磺酸乙酯 ( ethy l methane
su lfonate, EMS)为诱变剂,进行诱变处理,确定最佳
N aC l筛选浓度, 同时对诱变植株进行盐敏感筛选。
筛选到 47株盐敏感突变体,以其中一株 lss3为例,
进行了深入研究。
1 材料与方法
1. 1 植物材料与培养条件
本试验用到的材料包括 Arabidop sis thaliana Co l
0, ein3 1和以 ein3 1为背景 EMS诱变的种子 (简称
ein3 1M )。 ein31M、Co l0以及 ein3 1种子经 75%酒
精灭菌后, 播种于 MS(M urashige and Skoog )培养基
上。 4 春化 2 d置于光照培养箱,温度设定为 21 ,
16 h /8 h的光暗交替。
1. 2 EMS诱变
诱变方法如 Jander等 [ 16]所述, 略作修改。称取
0. 5 g完全干燥的 ein3 1种子 (约 5 000粒 ),把种子
放入到盛有 30 mL 100 mmo l/L 磷酸缓冲液 ( pH
75)的 100 mL三角瓶中,加入 0. 2% ( V /V )的甲基
磺酸乙酯 ( EM S), 封口后放在水浴 ( 25 )振荡器上
振荡 12 h。经诱变的种子称之为 M0代撒播到土里,
收获的种子为 M1代。约 2 400份 M 1代种子被分为
1 000个不同的池,其中包括单株、两株或者 3- 5株
植物的混合种子。
1. 3 低盐敏感突变体的筛选与表型确定
M2代幼苗在 MS培养基上生长 4- 5 d,待根长
为 1- 1. 5 cm时移至含不同浓度 N aC l的 MS培养
基上处理 7- 10 d, 观察表型。将得到的突变体移到
MS培养基上缓苗 7 d左右移植到土里生长, 直至收
获下一代种子。并且在 M 3代进行表型确认, 选出备
选的突变体。
1. 4 遗传分析与三重反应
植物基因组 DNA包括 Col0, ein31和 ein31M为
模板, PCR扩增程序如 Falque等 [ 17]中所述。鉴定 ein 31
背景的引物序列如下: ein31F: 5GAGCAAGCTAGGAG
GAAGAAAATGTCTAG3, ein31R: 5TTTAGGCAAACCA
AGTTGGATGCCAC3[ 15]。PCR产物经Hae III在 37 酶
切 1 h。
75%酒精灭菌的 Co l0、ein3 1和 ein3 1M种子
播种于含有不同浓度 ACC的 MS培养基上, 21 黑
暗处理 3 d,观察表型。
2 结果与分析
2. 1 NaC l筛选浓度的确定
根据已 有的研究 报道, 拟 南芥 Col0 在
75mmol /L NaC l胁迫下表现出明显的盐表型, 100
mmo l/L NaC l或者更高浓度胁迫下, 幼苗生长受到
严重抑制 [ 18 ]。并且, 在 100 mmo l/L N aC l或者更高
浓度时, ein 3 1 比 Col0表现出更敏感的盐表
型 [ 6, 13, 19]。筛选浓度的合理性决定突变体筛选的成
败, 所以在突变体筛选之前, 首先要设计一系列的浓
度梯度。4 - 5 d根长 1- 1. 5 cm的野生型拟南芥
Col0和 ein 3 1 ( Col0 background)转入含有不同浓
度梯度的 NaC l培养基中, 垂直倒立放置, 7 d后幼苗
生长情况见图 1。由图 1可见,野生型拟南芥幼苗
Col0和 ein31根和地上部分的生长在 75 mmo l/L
NaC l时受到明显抑制, 相比之下 50 mmol /L NaC l
时, Co l0和 ein 3 1 没有明显表型 (未展示 )。在
100mmo l/L NaC l处理下, 幼苗 Col0和 ein31受到严
重抑制,例如地上部分收缩变小,根明显变短。当 NaC l
浓度达到 150 mmo l/L时,这种抑制作用更加严重,主
根几乎被抑制,地上部分更小,真叶呈深绿色。为了避
91
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
免本来没有突变的个体被认为是突变体及以防真正的
突变体被淘汰掉,所以本试验用于筛选盐敏感突变体
的 NaC l浓度被确定为 75mmo l/L。
图 1 野生型 Co l0和 ein31幼苗在不同浓度
梯度 NaC l胁迫下的表型变化
2. 2 低盐敏感突变体的筛选
对 2万株生长在 MS培养基上的 M2代幼苗,待
4- 5 d根长约 1 - 1. 5 cm 时移至含有 75 mmo l /L
N aC l的 MS培养基上,垂直倒立放置,利用根弯曲方
法进行筛选 [ 20, 21] , 随时观察幼苗生长情况, 进行拍
照。如图 2所示,共筛选到 145株可能的盐敏感突
变体。根据幼苗表现的不同盐敏感程度, 将其大致
分为 3类。根的生长完全受到抑制, 和 (或者 )子叶
变成黄色, 真叶几乎不长, 称为低盐超敏感突变体
( low concentration o f sa lt hypersensit iv ity, lsh ) (图
2a, b, c)。第二类为低盐中等敏感突变体 ( low con
centrat ion o f sa lt moderatesensitive mutants, lsm ), 根
的生长受到明显抑制, 地上部分呈深绿色 (图 2e) ,
或者根的生长正常但地上部分呈黄绿色 (图 2d)。
第三类为低盐弱敏感突变体 ( low concentration of
salt sligh tsensit ive mu tants, lss) , 根和地上部分均受
到轻微抑制 (图 2,f g)。将这些备选突变体移到 MS
培养基上缓苗 7 d左右移植到土里生长,直至收获
种子, 并且在 M3代进行表型确认。
2. 3 低盐敏感突变体表型确定及遗传分析
对 M3代幼苗在相同选择压力下进行筛选, 其
中 47株突变体保持了盐敏感的特点。选择其中 1
株 lss3进行深入的研究。正常生长情况下, 幼苗
Co l0、ein 3 1和 lss3的生长无明显变化。然而,在
75 mmo l/L NaC l胁迫下, 与 Col0和 ein 3 1相比,
lss3根和地上部分生长受到明显抑制, 主根变短,
地上部分皱缩变小 (图 3)。 lss3具有比 Co l0和
ein3 1更加敏感的盐表型。
图 2 75mm ol/L N aC l时突变体的不同表型
图 3 lss3在 75 mm ol/L NaC l时的表型
由于 lss3来源于 ein3 1,需要明确其遗传背景。
功能缺失型突变体 ein3 1,是 EMS诱变野生型拟南
芥 Col0获得的, 645位核苷酸 G转变为 A,导致蛋
白提前终止 [ 15 ]。设计特异引物进行 PCR扩增, 产
物经限制性内切酶H ae III(B suR I: GG CC)酶切鉴
定。由于 Co l0含有H ae III酶切位点, 经酶切鉴定
后得到 393 bp的片段, 而 ein 31和 lss3发生了 G
到 A的转变, H ae III不能识别, PCR产物没有被切
断, 仍为 438 bp(图 4)。所以 lss3的遗传背景仍为
ein3 1。 lss3与 ein 3 1回交,得到的 F2代幼苗进行
了盐敏感筛选试验。如表 1所示, 在 75 mmo l/L
NaC l处理下,回交得到的 F2代幼苗盐敏感突变体
92
2011年第 1期 张丽霞等:拟南芥低盐敏感突变体的筛选
与不敏感突变体的分离比为 13, 表明 lss3是一个
隐性双突变体。
图 4 H ae III酶切鉴定 Col0, e in31
和 lss3 的 PCR产物
表 1 lss3 的遗传分析
回交 世代 总数 75 mmo l/L NaC l敏感突变体
75mm ol /L N aC l
不敏感突变体
lss3 ein31 F2 106 27 79
E IN3是乙烯信号途径的一个重要因子, ein3 1
对乙烯及乙烯的前体 ACC不敏感, 表现出盐敏感
性 [ 15, 19 ]。其他的乙烯不敏感突变体, 如 ein2 5、etr1
和 mkk9同样对盐敏感 [ 11, 13, 19, 22 ]。然而组成型乙烯
突变体 ctr1 1和 ebf1 1 ebf2 1 [ 6]以及乙烯过量生成突
变体 eto (未发表 )具有明显的抗盐性。21 黑暗条
件下生长 3 d, lss3 下胚轴比 ein3 1 略短, 但是
5 mol/L ACC处理下 lss3与 ein31表型类似,表现
出对 ACC的不敏感性 (图 5)。推测 lss3 可能与
E IN3有关,参与乙烯信号途径; 也可能只是一个与
盐有关的新基因。三重反应并不能完全说明问题,
只是一个检测指标,关于 lss3详细的特性及基因功
能还有待进一步试验证明。
图 5 lss3 的三重反应
3 讨论
对于突变体的大量筛选,筛选方法和筛选浓度
是成功的关键。采用广泛应用的根弯曲方法筛选拟
南芥突变体, 此方法直观、快捷、灵敏 [ 21 ]。筛选浓度
过高使得超敏感突变体不能存活而损失许多突变
体, 或者一些本来没有突变的个体被认为是突变体;
浓度过低会使真正的突变体被淘汰掉,所以在筛选
突变体之前要设计试验, 选择合适的筛选浓度。大
量试验表明,拟南芥 Col0幼苗在 75 mmo l/L NaC l
的处理下表现出明显的盐表型, 100mmo l/L N aC l或
者更高的浓度胁迫下, 幼苗生长受到严重抑制 [ 18]。
ein3 1在 75mmol /L NaC l时, 与野生型相比无明显
区别。当 N aC l浓度达到 100 mmo l/L或者更高时,
表现出比野生型更加敏感的表型。所以对于筛选以
ein3 1为背景的盐敏感突变体, 75 mmo l /L NaC l最
为合理 [ 6, 13, 19]。
乙烯被认为是一种逆境植物激素,它参与了许多
的生物胁迫和非生物胁迫 [ 9]。目前普遍认为乙烯及
整个乙烯信号转导途径 (包括受体、CTR1、E IN2和
E IN3)都参与植物盐胁迫过程 [ 11- 14]。EIN3是乙烯信
号途径中的一个重要因子,在盐响应过程中起着正调
控的作用。功能缺失型突变体 ein 31,在种子萌发、
幼苗生长以及后期的生长发育阶段, 与野生型相比,
表现盐敏感的表型, 特别是在高盐环境下 [ 6, 11, 13, 19 ]。
200mmol /L N aC l处理下, ein 31幼苗的成活率只有
20%
[ 6]。但是,到目前为止关于依赖 E IN3,并且与盐
有关的因子还没有报道。本研究通过对 ein 31功能
缺失突变体种子进行 EMS诱变,筛选到了 47株盐敏
感突变体。以 lss3为例,突变体的三重反应与 ein3 1
类似,推测突变的基因可能与 E IN3有关,参与乙烯信
号转导途径;也可能与 EIN3无关,只是与盐有关的新
基因。但 47个突变体的突变基因可以通过图位克隆
等方法获得,然后深入研究其功能。
植物耐盐性是一个复杂的过程, 它受到植物种
类、形态结构和内部生理生化反应的影响,并且受到
多基因控制。目前已经克隆到许多与盐相关的基
因, 但是还存在大量的未知基因, 克隆鉴定这些优良
的基因,是目前急需解决的问题。
参 考 文 献
[ 1 ] X iong L, Schum ak er KS, Zhu JK. C ell s ign aling du ring co ld,
drough t, and salt stress. P lant C el,l 200 2, 14( Supp. ) : S1 6583.
[ 2] Zhu JK. R egu lat ion of ion hom eos tasis under salt s tress. Cu rr Op in
93
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
Plant B io,l 2003, 6 ( 5) : 4415.
[ 3] Sek iM, Kam eiA, Yam aguch iSh inozak iK, et a.l M olecu lar respon ses
to d rough t, sal in ity and frost: comm on and d ifferent p aths for p lan t
protect ion. Cu rr Op in B iotechno,l 2003, 14( 2 ): 1949.
[ 4] Agarwa lPK, Agarw alP, Reddy MK, et a.l Role of DREB transcrip
tion factors in ab iot ic and b iot ic stress to lerance in p lan ts. P lan tC ell
Rep, 2006, 25( 12 ): 126374.
[ 5] Yoo SD, Sheen J. MAPK signaling in p lan t h orm one ethylene signal
transduction. P lan t S ignal Behav, 2008, 3 ( 10) : 8489.
[ 6 ] Ach ard P, Cheng H, D e Grauw e L, et a.l In tegration of p lan t respon
ses to env ironm en tally activated phytoh orm onal s ignals. Science,
2006, 311( 5757 ): 914.
[ 7] Kem pa S, K rasensky J, Da l San to S, et a.l A central ro le of abscis ic
acid in stressregu lated carbohydrate m etabo lism. PLoS On e, 2008, 3
( 12 ) : e3935.
[ 8] Szepesi, Cs iszr J, Gm esK, et a.l Salicylic acid imp roves accl ima
tion to salt stress by stim u lat ing ab scisic ald ehyde ox idase activ ity
and ab scis ic acid accumu lat ion, and in creasesN a+ con tent in leaves
w ithou t toxicity sym p tom s in Solanum lycopersicum L. J Plan t Physi
o,l 2009, 166( 9 ): 91425.
[ 9] B leecker AB, Kende H. E thylene: a gaseous signal m olecu le in
p lan ts. Annu Rev C ellDev B io,l 2000, 16: 118.
[ 10 ] Guo H, E cker JR. Th e ethylene signaling p athw ay: new ins igh ts.
Curr Op in P lan t B io,l 2004, 7( 1) : 409.
[ 11 ] C aoWH, L iu J, H eXJ, et a.lM odu lation of ethylene responses affects
p lan t saltstress responses. P lan t Physio,l 2007, 143( 2 ): 70719.
[ 12 ] Cao Y, Song F, Goodm an RM, et a.l M olecu lar characterizat ion of
four rice genes en cod ing ethylenerespons ive transcrip tional factors
and th eir exp ressions in response to b iotic and ab iotic stress. J
Plant Physio,l 2006, 163( 11) : 116778.
[ 13] Wang Y, L iu C, L iK, et a.l Arabidopsis E IN2 m odu lates s tress re
sponse th rough abscisic acid response pathw ay. P lan t M ol B io,l
2007, 64( 6 ) : 63344.
[ 14] K on ish iM, Y anag isaw a S. E thy len e s igna ling inA rabid op sis involves
feedb ack regu lat ion via the elaborate contro lof EBF2 exp ress ion by
E IN3. Plant J, 2008, 55( 5) : 82131.
[ 15] C hao Q, RothenbergM, SolanoR, et a.l A ct ivat ion of th e ethylene gas
respon se pathw ay inAra bid op sis by the nuclear protein ETHYLENE
INSENS IT IVE3 and related proteins. C el,l 1997, 89( 7) : 113344.
[ 16] Jand er G, B aerson SR, H udak JA, et a.l E thylm ethanesu lfonate satu
rat ion mu tagen es is inA rabid op sis to determ ine frequen cy of herb i
cide res is tan ce. P lan t Physio,l 2003, 131 ( 1) : 13946.
[ 17] Falque M, Decousset L, D erv ins D, et a.l L inkage m app ing of 1454
new m aize cand idate gene Loc.i G enetics, 2005, 170( 4 ) : 195766.
[ 18] M unns R, Tester M. Mechan ism s of salin ity tolerance. Annu Rev
P lan t B io,l 2008, 59: 65181.
[ 19] Yoo SD, Cho YH, Ten aG, et a.l Dual control of nuclear E IN3 by b i
furcate MAPK cascades in C2H 4 s ignall ing. N ature, 2008, 451
( 7180) : 78995.
[ 20] Zhao SQ, L in C, Y ang XH, et a.l Iso lation and gen et ic analys is of
A rabidopsis mu tants w ith Low _K+ tolerance. A cta B otan ica S in ic,
2001, 43( 1 ) : 105107.
[ 21 ] Mu rphyA, TaizL. A n ew verticalm esh transfer techn ique for m etal
tolerance stud ies inA rabid op sis ( ecotyp ic variation and coppersen
sit ivem utan ts) . Plan tPhysio,l 1995, 108 ( 1) : 2938.
[ 22] CaoWH, L iu J, Zhou QY, et a.l Express ion of tobacco ethylene re
cep tor NTHK1 alters p lan t responses to salt stress. P lan tC ellE nvi
ron, 2006, 29( 7 ): 12109.
(责任编辑 李楠 )
(上接第 89页 )
[ 7] Jez JM, Bowm anME, Noel JP. Expanding the b iosyn th et ic repertorie
of p lant type III polyk et ide syn thases by altering starterm olecu le spe
cif icity. PNAS, 2002, 99( 8 ) : 53195324.
[ 8] Aust in MB, Noel JP. The chalcon e syn th ase superfam ily of type
polyketid e synthases. Nat Prod Rep, 2003, 20( 1 ): 79110.
[ 9] 生书晶,赵树进.植物 型聚酮合酶的分子机制与应用前景.生
物工程学报, 2009, 25( 11 ) : 16011607.
[ 10 ] M a LQ, Pang XB, Shen HY, et a.l A novel type III polyketid e syn
thase encod ed by a three intron gene from P olygonum cusp ida tum.
P lanta, 2009, 229 ( 3) : 457469.
[ 11 ] KarppinenK, H okkan en J, Matt la S, et a.l Octaketidep roducing type
III polyketide synthase fromH ypericum p erforatum is exp ressed in
dark g lands accum u lating hyp ericins. FEBS Journa,l 2008, 275
( 17 ): 43294342.
[ 12 ] D ixon RA. Natural p roducts and plant disease resistance. Natu re,
2001, 411( 6839) : 843847.
[ 13 ] Abe I, U tsum iY, Ogu ro S, et a.l The f irst plant type III polyketide
syn thase that catalyzes form at ion of arom atic h eptaketide. FEBS Let
ters, 2004, 562( 13) : 171176.
[ 14 ] Abe I, U tsum iY, Oguro S, et a.l A p lant type III polyketide syn thase
that p roduces pen tak et ide chrom on e. J Am Chem Soc, 2005, 127
( 5 ): 13621363.
(责任编辑 李楠 )
94