全 文 :第37卷 第2期 西 南 师 范 大 学 学 报 (自然科学版) 2012年2月
Vol.37 No.2 Journal of Southwest China Normal University(Natural Science Edition) Feb.2012
文章编号:1000-5471(2012)02-0102-07
EMS诱变越橘的研究①
郑文娟, 石 佳, 任广炼, 李 政, 李 凌
西南大学 园艺园林学院,重庆400716
摘要:用甲基磺酸乙酯和聚乙二醇处理蓝丰越橘组培苗茎尖,筛选诱变处理的最佳组合和模拟干旱处理的临界浓
度,并应用主成分及隶属函数分析法对诱变前后的蓝丰、达柔组培苗进行耐旱性和耐水淹能力评价.结果表明:
诱变处理的最佳组合为3%EMS处理4h,聚乙二醇的临界浓度为10%;通过主成分分析,耐旱性指标可归纳成
叶绿素因子和渗透调节因子2个主成分,越橘的耐旱性由强到弱为:未经处理的达柔、未经处理的蓝丰、诱变处
理后的蓝丰、诱变处理后的达柔;耐水淹能力指标可归纳成叶绿素因子、抗氧化酶因子和渗透调节因子3个主成
分,越橘的耐水淹能力由强到弱为:诱变处理后的达柔、未经处理的达柔、诱变处理后的蓝丰、未经处理的蓝丰.
关 键 词:甲基磺酸乙酯;越橘;主成分分析;隶属函数分析
中图分类号:Q949.772.3 文献标志码:A
越橘是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium.SPP)多年生落叶、常绿灌木类果树[1],因其果实成熟
后为蓝紫色,又被称为蓝莓、蓝浆果.越橘果实柔软多汁,风味醇美,有特殊香气,富含熊果苷、花青苷和
抗氧化成分(VA、VC、VE),具有明目、防止脑神经衰老、提高人体免疫力、防癌、改善微循环等功效[2],既
可鲜食又宜于加工,还可用于天然食用色素的提取,被誉为“21世纪功能性保健浆果”.
甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate,简称EMS)是一种具有高效性、稳定性的化学诱变剂[3-4],
它可直接引起DNA点突变及染色体损伤,并且诱变效果远远高于自发诱变和电离辐射,被广泛应用于作
物诱变育种中[5].
越橘喜酸性土壤,为浅根系树种,根系集中分布在10~60cm土层内,严重制约了越橘在干旱及半干
旱地区的栽培推广.重庆地区夏季长时间的高温伏旱天气严重影响越橘的栽培推广,而同为西南地区的成
都,夏季经常出现连续几天的暴雨天气,长时间的水淹也影响越橘的正常生长.目前,国内外对越橘在水
分胁迫下的反应尚无系统的研究[6-7].因此,获得耐旱、耐水淹型越橘对其在西南地区的栽培推广具有重
要意义.
本实验应用化学诱变剂EMS处理越橘组培苗茎尖[8-9],并用PEG-6000模拟干旱条件初步筛选处理后
的组培苗,再对所得的植株进行水分胁迫,通过测定部分生理指标,评价处理前后植株群体的耐旱性及耐
水淹能力,以期为越橘水分胁迫研究以及育种工作奠定基础.
1 材料与方法
1.1 材 料
诱变材料为取自本学院的北高丛蓝丰(Vaccinium corymbosum cv.Bluecrop)、达柔(Vaccinium dar-
① 收稿日期:2011-11-14
作者简介:郑文娟(1986-),女,重庆长寿人,硕士研究生,主要从事园林植物生物技术与遗传育种研究.
通信作者:李 凌,教授,硕士生导师.
rowii.Camp)越橘组培苗,用蓝丰筛选各种实验条件.化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)为美国SIGMA公
司生产.
1.2 PEG-6000临界浓度的筛选
采用聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫,配制PEG浓度为0%,5%,10%,15%和20%的 MS培养基,
切取生长健壮的蓝丰组培苗茎尖(长约5mm),分别接种于上述培养基中.25d后观察继代苗生长情况.
1.3 EMS处理越橘茎尖
用0.01mol/L,pH=4.8高压灭菌后的磷酸缓冲液分别配制浓度为1%,3%,5%的EMS溶液,以磷
酸缓冲液作对照,以CK表示 .切取长度约5mm的蓝丰组培苗茎尖用不同浓度的EMS溶液分别浸泡1h,
2h,3h,4h,处理过程中不断震荡.无菌水冲洗5~6次,接种于 MS培养基上.25d后观察茎尖的生长情
况并统计死亡率.
将经半致死浓度处理25d的蓝丰、达柔组培苗接种于10%的PEG培养基中进行初步筛选,25d后转
接于正常培养基中,待其长至4~5cm高(约30~40d)时进行生根处理,生根炼苗后,移栽于8cm×8cm
规格的小塑料钵中,进行水分和养分管理.
1.4 植株耐性比较
1.4.1 胁迫条件的选择
以未经EMS处理的蓝丰作为胁迫条件选择试验的材料,待植株生长到12~16片真叶时对其进行干
旱、淹水胁迫处理.(1)干旱胁迫:以根际水分胁迫为主,处理前先浇透水,处理开始后停止浇水.当土壤
含水率为70%,50%,30%时,早晨8点,随机取植株功能叶片保存于4℃保温盒中,进行生理指标测定.
正常浇水时,土壤含水率约为70%,故将其作为干旱胁迫的空白对照.(2)淹水处理:处理开始后,一直保
持塑料钵中土面以上2cm高的水位,直至实验结束.于处理开始后0,3,6,12,24和48h随机取植株功能
叶片,测定植株的生理指标,以未经淹水处理的植株作为空白对照(即处理0h).
1.4.2 耐性指标的筛选
(1)干旱胁迫:当土壤含水率为50%时,测定蓝丰、达柔经EMS处理前后各植株群体功能叶中叶绿
素、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶活性[10-14].(2)淹水处理:于处理开始后12h,随
机取各类植株功能叶片,测定各项生理指标.
1.5 测定方法
氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶[15];硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛[15];茚三酮比色法测定脯氨
酸[16];蒽酮比色法测定可溶性糖[15];分光光度法测定叶绿素[17].
1.6 数据处理
用Excel(Office 2003)和SPSS(版本11.5)软件进行方差分析,并用主成分分析和隶属函数法评价2种
越橘诱变前后耐旱性、耐水淹能力强弱.
隶属函数计算方法:如果某指标与抗性成正相关,R(Xi)= (Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin);如果某指标与
抗性成负相关,R(Xi)=1-[(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)].
其中,R(Xi)为测定指标的隶属函数值,Xi为某参试材料某一指标测定值,Xmax,Xmin为所有供试材料
该指标测定值的最大值和最小值.
2 结果与分析
2.1 PEG-6000临界浓度的确定
经不同浓度PEG处理后,蓝丰组培苗生长缓慢或不能正常生长,有的叶片边缘出现干枯现象,产生大
量玻璃化苗.由表1可知,随着PEG浓度的升高,组培苗的玻璃化率先升高后降低,分化率逐渐降低,当
PEG浓度为15%时,玻璃化率最高.最终确定PEG模拟水分胁迫的临界浓度为10%.
301第2期 郑文娟,等:EMS诱变越橘的研究
表1 越橘茎尖经PEG处理后的生长情况
PEG浓度/% 接种数 玻璃化率/% 分化率/% PEG浓度/% 接种数 玻璃化率/% 分化率/%
0 72 0 100 15 72 63.9 61.1
5 60 40 86.7 20 60 45 25
10 72 48.6 72.2
2.2 EMS处理浓度和处理时间的确定
经EMS处理后的越橘茎尖的生长能力明显比对照组弱,表现在株高较矮、基部分枝能力减弱、叶片发
黄等方面(图1、图2).EMS对越橘茎尖的作用主要受处理浓度和处理时间两方面的影响.由表2可知,在
3%+4h和5%+1h的处理组合下,越橘茎尖的死亡率约为50%.考虑到高浓度的EMS会对植株造成很
大的损伤,最终确定EMS处理越橘茎尖的最佳组合为3%EMS处理4h.
表2 越橘茎尖经EMS处理后的死亡率 /%
EMS浓度
处理时间/(h)
1 2 3 4
CK 0 0 0 0
1% 0 0 3.2 4.2
3% 20.8 37.3 45.2 48.4
5% 50.8 69 88.2 96
图1 对照植株 图2 经EMS处理后的植株
2.3 胁迫条件的确定
植物为了避免受到因胁迫而造成的伤害,形成了抗氧化酶类保护系统,超氧化物歧化酶(SOD)就是其
中一种.植物膜脂过氧化终产物———丙二醛含量的变化也可以反映出植物遭受伤害的程度.作为渗透调节
物质,脯氨酸含量的变化也与植物遭受伤害的程度相关.
2.3.1 苗期干旱胁迫条件的确定
土壤含水率可以表示土壤的水分状况,本实验在同一时间段进行,所有参试植株都种植在同一栽培基
质中,可以排除季节和不同基质特性对植株的影响,故土壤含水率可以作为植物耐旱性筛选的梯度指标.
由表3可知,随着干旱胁迫的加强,SOD活性先升高后降低.这是因为干旱胁迫初期植物抗氧化酶类活动
活跃,SOD活性增强,当土壤含水率为50%时,其活性最高.随着胁迫的进一步增强,当土壤含水率为
30%时,抗氧化酶类保护系统可能遭受破坏,SOD活性有所下降.随着干旱胁迫的加强,丙二醛和脯氨酸
含量也呈现出先升高后降低的趋势.当土壤含水率为50%时,含量最高.故选择土壤含水率为50%作为研
究越橘苗期干旱胁迫的条件.
401 西南师范大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第37卷
表3 干旱胁迫对蓝丰叶片部分生理指标的影响
土壤含水率 SOD/(U/g) 丙二醛/(umol/g) 脯氨酸/(ug/g)
70% 132.29c 24.59c 66.44c
50% 479.70a 42.59a 175.34a
30% 216.97b 32.59b 153.26b
注:每一指标同列中不同小写字母表示差异显著p<0.05,下同.
2.3.2 苗期淹水胁迫条件的确定
随着淹水处理时间的延长,SOD活性和丙二醛含量均呈现出先升高后降低再升高的变化趋势,当处理
时间为12h时,SOD活性最低,丙二醛含量也低;脯氨酸含量先升高后降低,当处理时间为12h时,其含
量最高(表4).故选择淹水处理12h作为研究越橘苗期淹水胁迫的条件.
表4 淹水胁迫对蓝丰叶片部分生理指标的影响
处理时间/h SOD/(U/g) 丙二醛/(umol/g) 脯氨酸/(ug/g)
0 132.29d 24.59f 66.44d
3 236.03c 44.84c 69.49c
6 242.72c 59.47b 87.00b
12 120.10e 43.02d 93.16a
24 300.61b 61.69a 92.41a
48 330.61a 32.83e 88.37b
2.4 越橘苗期耐旱性综合评价
采用主成分分析能够避免多个指标的重复性和单一指标的片面性,更能全面评价水分胁迫下越橘的适
应机制.
2.4.1 干旱胁迫下方差分析
方差分析结果表明(表5),越橘的7个耐旱性指标中,重复间差异不显著,材料间差异显著,可以做主
成分分析[18].
表5 干旱胁迫下的方差分析及F值检验
指 标 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛 脯氨酸 可溶性糖
种质资源间差异 0.012 0.003 0.025** 101.094** 652.643** 584.609** 0.384**
区组间差异 0.005 0.002 0.001 1.951 15.491 11.737 0.011
注:F检验,*表示差异显著,p<0.05;**表示差异极显著,p<0.01,下同.
2.4.2 干旱胁迫下主成分分析
主成分分析能够排除多指标数据间的重叠性[19-20],较好地反应越橘的耐旱性.
由表6可知,1、2两个主成分的累计贡献率已达97.807%,表明它们在越橘的耐旱性评价中起主要作
用.因此,可以选取它们作为综合指标评价越橘的耐旱性(表7).
表6 干旱胁迫下主成分分析结果
主成分 特征值 贡献率/% 累积贡献率/%
1 5.544 79.203 79.203
2 1.302 18.604 97.807
表7 干旱胁迫下各因子载荷矩阵
指 标 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛 脯氨酸 可溶性糖
成分1 0.941 0.965 0.988 -0.881 -0.999 0.090 -0.984
成分2 0.336 -0.239 0.151 0.344 -0.032 0.993 0.054
第一主成分对应较大的特征向量中,SOD、丙二醛和可溶性糖为负向标,说明低活性的SOD活性、低
501第2期 郑文娟,等:EMS诱变越橘的研究
含量的丙二醛和可溶性糖有利于越橘耐旱,而叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量为正向标,说明叶绿素含
量高有利于越橘耐旱,故称该主成分为叶绿素因子.
第二主成分中,脯氨酸为较大的正特征向量.脯氨酸是一种渗透调节物质,高浓度的脯氨酸能够使植
物保持从外界继续吸水、维持细胞膨压等生理过程,故称该主成分为渗透调节因子.
2.4.3 干旱胁迫下隶属函数分析
第一主成分已经代表了79.203%的越橘耐旱性信息,故选第一主成分中的较大特征向量:叶绿素a、
叶绿素b、叶绿素总含量、SOD、丙二醛、可溶性糖6个指标进行隶属函数分析,评价越橘的耐旱性.根据
隶属函数平均值的大小(表8),得到越橘耐旱性由强到弱的顺序为:DCK、LCK、LE、DE.
表8 干旱胁迫下越橘隶属函数值
材料 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛 可溶性糖 隶属函数平均值
LCK 1 1 1 0.33 0 0 0.56
LE 0.83 0.83 0.81 0 0.18 0.29 0.49
DCK 0.33 0 0.13 1 1 1 0.58
DE 0 0.33 0 0.69 0.98 0.85 0.48
注:LCK表示未经EMS处理的蓝丰,LE 表示经EMS处理后的蓝丰,DCK表示未经EMS处理的达柔,DE 表示经EMS处
理后的达柔,下同.
2.5 越橘苗期耐水淹能力综合评价
2.5.1 淹水胁迫下方差分析
方差分析结果表明(表9),越橘的7个耐水淹指标中,实验材料间均差异极显著,重复间差异不显著,
可以进行主成分分析.
表9 淹水胁迫下的方差分析及F值检验
指 标 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛 脯氨酸 可溶性糖
种质资源间差异 0.095** 0.022** 0.205** 366.494** 91.448** 1653.213** 0.303**
区组间差异 0.001 0.001 0.002 5.1 0.865 5.016 0.01
2.5.2 淹水胁迫下主成分分析
由表10可知,前3个主成分的累积贡献率已达100%,表明它们能够全部反映出越橘的耐水淹信息.
因此,选取前3个主成分作为综合指标评价越橘的耐水淹能力(表11).
表10 淹水胁迫下主成分分析结果
主成分 特征值 贡献率/% 累积贡献率/%
1 4.008 57.254 57.254
2 1.565 22.353 79.607
3 1.428 20.393 100.000
表11 淹水胁迫下各因子载荷矩阵
指标 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总含量 SOD 丙二醛 脯氨酸 可溶性糖
成分1 0.946 0.982 0.967 -0.737 0.26 0.313 0.711
成分2 0.317 0.170 0.253 0.662 0.471 0.475 -0.697
成分3 -0.071 0.084 -0.025 0.134 -0.843 0.823 0.097
第一主成分贡献率为57.254%,对应较大的特征向量中,SOD为负向标,说明低活性的SOD活性有
利于越橘耐水淹,而叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量、可溶性糖为正向标,说明叶绿素和可溶性糖含量
高有利于越橘耐水淹,称该主成分为叶绿素因子.
第二主成分贡献率为22.353%,对应较大的特征向量中,SOD为正向标,可溶性糖为负向标.水分胁
迫下,抗氧化酶类活动活跃,清除植物体内多余的活性氧,以保证植物正常的生理生化代谢,称该主成分
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为抗氧化酶因子.
第三主成分贡献率为20.393%,对应较大的特征向量有丙二醛、脯氨酸.其中丙二醛为负向标,丙二
醛是膜脂过氧化产物,也是衡量植物受损害程度的生理指标[21].脯氨酸为正向标,故称该主成分为渗透调
节因子.
2.5.3 淹水胁迫下隶属函数分析
第一、二两个主成分的累积贡献率已达79.607%,表明这两个主成分在越橘的耐水淹能力评价中起主
要作用.选这两个主成分中的较大特征向量:叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量、SOD、可溶性糖5个指标
进行隶属函数分析,评价越橘的耐水淹能力.根据隶属函数平均值的大小(表12),得知越橘耐水淹能力由
强到弱的顺序为:DE、DCK、LE、LCK.
表12 淹水胁迫下越橘隶属函数值
材料 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总含量 SOD 可溶性糖 隶属函数平均值
LCK 0 0 0 0.83 0.16 0.2
LE 0.89 0.79 0.87 1 0 0.71
DCK 1 0.89 1 0.07 0.67 0.72
DE 0.89 1 0.96 0 1 0.77
3 结论与讨论
EMS作为一种化学诱变剂,被广泛应用于各种植物的诱变育种中,特别是一些农作物,如水稻、小麦、
玉米、马铃薯、大豆等[22].本实验得出:EMS处理蓝丰茎尖的半致死组合是3%的EMS处理4h.在组培
苗模拟干旱胁迫方面,PEG的最佳浓度为10%,此时,蓝丰组培苗茎尖的玻璃化率接近50%,分化率
较高.
对蓝丰幼苗进行干旱和淹水胁迫,通过其叶片部分生理指标的变化情况确定:土壤含水率为50%作为
研究越橘苗期干旱胁迫的条件;淹水处理12h作为研究越橘苗期淹水胁迫的条件.土壤含水率过高达不到
干旱胁迫的目的,过低就会对植物造成一些不可逆转的损伤,严重时会使植株因缺水而死亡.同理,淹水
胁迫时间过短就达不到胁迫的效果,而时间过长就会造成植株叶片萎焉、脱落,甚至死亡.
越橘耐旱性结果表明:未经EMS处理的越橘材料的耐旱性强于处理过的越橘材料;就越橘的品种而
言,达柔的耐旱性强于蓝丰;而经EMS处理之后,蓝丰的耐旱性却强于达柔,这可能是因为EMS处理使
蓝丰群体中产生了一些耐旱性增强的变异体.
越橘淹水处理的结果表明:就不同品种而言,不管是否经过EMS处理,达柔的耐水淹能力都强于蓝
丰;同一品种中,经EMS处理后的材料的耐水淹能力强于未处理的材料.这可能是因为经EMS处理之后,
越橘材料中出现了一些耐水淹能力增强的变异体.
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A Preliminary Study of Mutagenesis in Blueberry Plants with EMS
ZHENG Wen-juan, SHI Jia,
REN Guang-lian, LI Zheng, LI Ling
School of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University,Chongqing 400716,China
Abstract:The shoot tips of the test-tube plantlets of blueberry(Vacciniumspp.)cultivars Bluecrop and
Darrow were treated with EMS(ethyl methane sulphonate)at different concentrations and subjected to
PEG(polyethylene glycol)-simulated drought,to determine the optimum chemical mutagenesis combina-
tion and the critical PEG concentration.Principal component analysis and membership function analysis
were made to evaluate the drought resistance and water-logging tolerance of the materials before and after
the treatment.The results showed that the best combination of chemical mutagenesis was EMS treatment
at 3%and for 2hand the critical PEG concentration of simulated drought was 10%.By principal compo-
nent analysis and membership function analysis,the factors of chlorophyl and osmotic adjustment were
shown to be the two principal components and the drought tolerance of the plantlets studied were in the or-
der of non-EMS-treated Darrow>non-EMS-treated Bluecrop>EMS-treated Bluecrop>EMS-treated Dar-
row;and chlorophyl,antioxidant enzymes and osmotic adjustment were the three principal components
for water-logging-resistance,which was in the order of EMS-treated Darrow>non-EMS-treated Darrow>
EMS-treated Bluecrop>non-EMS-treated Bluecrop.
Key words:ethyl methane sulphonate(EMS);blueberry;principal component analysis;membership func-
tion analysis
责任编辑 欧 宾
801 西南师范大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第37卷