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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
可转化人工染色体(TAC)文库载体 DNA的制备
李晓玲1，2 李克秀2 赵洪锟1 赵茂林3 董英山1
(1吉林省农业科学院生物技术研究中心，长春 130033;2长春工业大学化学与生命科学学院，长春 130012;
3中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 100101)
摘 要: 对可转化人工染色体(TAC)pYLTAC747NH/sacB文库载体 DNA 的制备条件进行了较系统的摸索和研究。结
果表明，该文库载体经碱裂解法提取、QIAGEN Plasmid Mini kit纯化后，可获得较纯净的载体 DNA。对其闭环载体 DNA 分别
用不同酶量的 Hind III酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳检测得出其最佳 Hind III完全酶切条件为 2 U Hind III /μg闭环载体 DNA、
37℃酶切 30 min;分别用 0． 5 MBU和 1 MBU HK脱磷酶 /μg对其线性载体 DNA进行脱磷处理，经电泳和载体自连产物电转化
检测表明其适宜的完全脱磷条件为 1 MBU HK脱磷酶 /μg线性载体 DNA，30℃脱磷 1 h;将所制备的线性载体 DNA与 λ DNA/
Hind III酶切片段进行连接，连接产物转化频率较高，其电转化大肠杆菌 DH10B感受态细胞频率可达到 9． 6 × 108。
关键词: 可转化人工染色体(TAC) 文库载体 酶切 脱磷
Preparation of the Vector DNA for Library from the
Transformation-competent Artificial Chromosome
Li Xiaoling1，2 Li Kexiu2 Zhao Hongkun1 Zhao Maolin3 Dong Yingshan1
(1Biotechnology Research Centre，Jilin Academy Agricultural Sciences，Changchun 130033;2School of Chemistry and Life Science，Changchun
University of Technology，Changchun 130012;3 Institute of Genetics and Developmental Biology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101)
Abstract: The optimal condition for the preparation of qualified vector DNA from the transformation-competent artificial chromo-
some(TAC)pYLTAC747NH/sacB for library was groped and studied． The result showed that the pure vector DNA could be obtained af-
ter the plamid was extracted by the alkaline lysis method and purified by QIAGEN Plasmid Mini kit． The closed-loop vector DNA was
digested by gradient units of Hind III respectively． The result examined by agarose gel electrophoresis indicated that the optimal diges-
tion conditions by Hind III was 2 U Hind III /μg vector DNA at 37℃ for 30 min． Subsequently，the linear vector DNA is dephosphor-
ized by 0． 5 MBU and 1 MBU HK thermolabile phosphatase respectively． The results determined by agarose gel electrophoresis，self-
ligation reaction of the vector and eletroporation showed the suitable conditions for the complete dephosphorylation was 1MBU HK ther-
molabile phosphatase /μg linear vector DNA at 30℃ for 1 h． The vector DNA prepared and the DNA fragments from λ DNA/HindIII
were ligated，and the ligation product were eletroporated into E． coli DH10B electrocompetent cells after spotdialysis． The transformation
frequency was pleasing，which could come up to 9． 6 × 108 ．
Key words: Transformation-competent artificial chromosome(TAC) Vector for library Digestion Dephosphorylation
收稿日期:2011-03-15
基金项目:农业部野生植物资源保护项目(2010) ，国家转基因专项(2008ZX08004-004)
作者简介:李晓玲，女，博士，副教授，研究方向:植物生物技术与植物分子生物学;E-mail:lxl5275278@ 163． com
通讯作者:董英山，男，研究员，博士生导师，研究方向:植物种质资源与生物技术;E-mail:ysolong@ cjaas． com
随着分子生物学技术的普及和越来越多的植物
基因序列的获得，基因功能分析变得日趋重要而紧
迫。据此 Liu 等［1］结合 PAC(P1-derived artificial
chromosome)载体和 BIBAC 载体的特点，构建了多
个植物可转化人工染色体(transformation-competent
artificial chromosome，TAC)载体。该系列载体含有
P1 噬菌体和 Ri 质粒 pRiA4 等的复制子，能够在大
肠杆菌和根癌农杆菌中以单拷贝形式穿梭复制。因
此，一旦筛选到目标阳性克隆，便可直接利用农杆菌
转化系统将其转到植物体基因组中进行基因功能互
补试验。目前，应用该载体系统己成功构建了拟南
芥［1］、小麦 －簇毛麦易位系 6VS /6AL［2］、高抗黄矮
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
病基因的小麦 － 中间偃麦草易位系［3］、籼稻品种
H359［4］、稻瘟菌［5］、百脉根［6］、水稻［7］、桃［8］、六倍
体小麦［9］、番茄［10］、菰［11］、大豆、棉花和金鱼草等多
种植物的基因组文库，进而分离出多个拟南芥、水
稻［12］和小麦新基因。因此，该 TAC 载体系统将在
植物功能基因组学研究中发挥重要的作用。
高质量的载体 DNA 和大片段基因组 DNA 是大
片段基因组文库构建的两个基本要素，二者将对后续
连接转化反应效率及插入片段长度起决定性作用。
目前已有文献多侧重于文库的构建及利用和高质量
大片段基因组 DNA的获得，而对文库载体 DNA制备
的研究则较少报道，仅见 Osoegawa 等［13］对 BAC /
PAC、姜涛等［14］对 BAC载体 DNA的制备进行了较详
细地研究。本研究以 TAC 载体 pYLTAC747NH/sacB
为材料，针对高质量大片段文库载体 DNA制备过程
中的关键性步骤进行较详细地探讨，为进一步构建
多种植物基因组 TAC 文库及其广泛应用提供一定
的参考依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
TAC载体 pYLTAC747NH /sacB(18． 9 kb)保存
菌由华南农业大学生物技术学院刘耀光教授惠赠。
该载体具有 BamH I、Hind III和 Sal I 等一系列酶切
位点及卡那霉素(KanR)抗性标记和蔗糖致死选择
标记基因，具有连接多个外源基因的功能，可用于大
片段文库的构建。
1． 2 方法
1． 2． 1 pYLTAC747NH /sacB 质粒载体保存菌种的
活化和初步检测 将含有 pYLTAC747NH /sacB 质
粒的大肠杆菌 DH10B 保存菌塑封在无菌条件下用
剪刀剪开后，用 50 － 100 μL LB 培养基冲洗塑料膜
内的样品，然后吸取样品冲洗液并经梯度稀释后涂
于 LB + Kan 25 mg /L固体培养基平板上，37℃倒置
过夜培养。待长出菌后，挑取单菌落用同样培养基
划平板活化，37℃倒置过夜培养至长出单菌落。菌
种活化后，分别挑取 4 个单克隆于 5 mL LB + Kan 25
mg /L液体培养基中，37℃、200 r /min 过夜培养。同
时对不含 pYLTAC747NH /sacB 质粒载体的空大肠
杆菌 DH10B菌株也做同样培养处理。然后各取 1
mL待检菌液，用 LB 液体培养基进行 10 －1、10 －2、
10 －3梯度稀释。将 10 －2或 10 －3梯度稀释的待检菌
液和不含 pYLTAC747NH /sacB 质粒载体的空大肠
杆菌 DH10B原菌液分别涂布在 LB + Kan 25 mg /L、
LB + 5% Sucrose、LB + Kan 25 mg /L + 5% Sucrose
固体培养基上，37℃过夜培养;分别估算每微升待检
菌液在蔗糖平板上出现的非致死菌落占无蔗糖平板
总菌落数的频率。
1． 2． 2 载体 DNA 的分离、纯化与浓度估测 载体
经初步检测合格后，进行液体摇菌、过夜培养至菌液
浑浊，分别用碱裂解法和普通大片段质粒提取试剂
盒提取载体 DNA。其中，经碱裂解法制备的载体
DNA粗体物，需用 RNAase 去除残留 RNA 后，再用
QIAGEN Plasmid Mini kit 对其进行纯化。最后用
1%琼脂糖凝胶电泳检测载体 DNA的质量和浓度。
1． 2． 3 载体 DNA 的酶切 采用 NEB 公司的限制
性内切酶 Hind III(20 U /μL)对载体 DNA进行梯度
酶切消化，即每微克载体 DNA 分别用 0． 5、1． 5、
2． 0、3． 0 和 4． 0 U Hind III 进行酶切处理，酶切体系
为 20 μL，37℃酶切 30 min。酶切反应结束后，68℃
水浴处理 5 min，完全灭活内切酶活性，最后经 1%
琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。
1． 2． 4 线性载体 DNA的脱磷酸化及脱磷效果检测
1． 2． 4． 1 线性载体 DNA 的脱磷酸化 分别吸取 2
份 20 μL酶切液，并向其中加入 2 μL Epicenter公司
的 100 mmol /L CaCl2，使其终浓度为 10 mmol /L。
30℃预热 5 min 后，分别以 0． 5 MBU /μg 线性载体
DNA和 1 MBU /μg 线性载体 DNA 量加入 HK 脱磷
酶(HKTM thermolabile phosphatase)。30℃脱磷 1 h
后，65℃水浴处理 30 min完全灭活脱磷酶活性。
1． 2． 4． 2 脱磷效果检测 载体自连体系为 20 μL:
两种不同梯度脱磷后的产物 4 μL(约 100 ng)、NEB
公司的 T4DNA连接酶 0． 5 μL(15 U)、10 × Buffer 2
μL、H2O 13． 5 μL，于 Bio-Rad Mycycler
TM PCR 仪上
16℃自连过夜。自连结束后，65℃水浴处理 20 min，
完全灭活连接酶活性，先用 1%琼脂糖凝胶电泳检
测载体脱磷及自连反应结果。同时，将连接产物用
VSWP纤维素微孔滤膜(0． 025 μm，Millipore)在1 /4
TE(pH8． 0)缓冲液上、4℃冰箱中透析 1 h 后，取 1
μL电激转化到 10 μL DH10B 感受态细胞中。用
0. 8 mL SOC 培养基复苏培养后，取 100 μL 涂于
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2011 年第 9 期 李晓玲等:可转化人工染色体(TAC)文库载体 DNA的制备
LB + Kan 25 mg /L + 5%蔗糖的平板上，于 37℃培养
12 － 24 h，观察菌落生长情况，以进一步确认载体脱
磷效果。
1． 2． 5 载体连接能力检测 将自制的 λDNA /Hind
III 完全酶切产物与完全酶切、脱磷后的线性载体
DNA在 NEB公司 T4 DNA连接酶的作用下，按下列
条件在 PCR 仪上进行连接:先加入 λDNA /Hind III
0． 5 μL(100 ng)和载体 DNA 4 μL(约 100 ng) ，50℃
温育 1 min。再加入 T4 DNA 连接酶 1 μL 及 10 ×
Buffer 2 μL，用 0． 7 × TEN补足到 20 μL。16℃连接
过夜后，65℃5 min灭活连接酶活性。
将连接产物用漂浮在 1 /4TE 缓冲液上的 Milli-
pore(0． 025 μm)膜 4℃透析 3 － 4 h，小心吸取 DNA
溶液到 EP管中。将 1 μL 的连接产物电激转化到
10 μL大肠杆菌 DH10B 感受态细胞中。经 0． 8 mL
SOC复苏 1 h 后，取 50 μL 菌液涂于 LB + Kan 25
mg /L + 5%蔗糖的平板上培养 12 － 24 h。统计平板
上转化子个数，计算转化频率(转化子总数 /质粒
DNA加入量(mg) )。随机挑取 10 个菌落于 10 mL
LB + Kan 25 mg /L液体培养基中过夜培养采用碱裂
解法提取质粒 DNA，经 Hind III 酶切后进行电泳
检测。
2 结果
2． 1 载体的初步检测
为获得 pYLTAC747NH /sacB 质粒，先将含此质
粒的大肠杆菌 DH10B 活化培养得到单菌落。经初
步检测，含 pYLTAC747NH /sacB 质粒大肠杆菌
DH10B 1 000 倍稀释液在 LB + Kan 25 mg /L固体培
养基上生长较好，而其 10 倍稀释液在 LB + 5% Su-
crose、LB + Kan 25 mg /L + 5% Sucrose 固体培养基
上几乎不生长，经估算该菌种在蔗糖平板上出现非
致死菌落的频率远远低于无蔗糖平板上菌落频率的
1 /5 000 或 1 /10 000。且不含 pYLTAC747NH /sacB
质粒大肠杆菌 DH10B 在含卡那霉素的培养基上都
不生长，而在不含卡那霉素的培养基上则长出较厚
的菌苔。该检测结果表明 pYLTAC747NH /sacB 质
粒含有抗卡那霉素的基因，并且蔗糖致死基因 sacB
基因功能正常。
2． 2 载体 DNA的分离、纯化和浓度估测
本试验首先采用碱裂解法提取菌液中 pYLTAC
747NH /sacB 质粒 DNA，随后用大量的 RNAase 对
其进行处理。再经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果
见图 1。电泳后在琼脂糖凝胶下部仍可看到极亮
的 RNA条带，表明该载体 DNA粗体物中仍含有大
量的残余 RNA 分子，继续加大 RNAase 用量仍无
法去除这些已降解的小 RNA分子。由于反差的原
因，该亮带导致凝胶上部载体 DNA 主带显得很
弱，无法较准确估计其大致浓度，因而有必要对该
载体 DNA 粗体物进一步纯化处理。经 QIAGEN
Plasmid Mini kit纯化后，其在电泳图谱上已看不到
细菌 DNA和 RNA等杂带，且该大片段载体 DNA主
带清晰，长度接近 pYLTAC747NH 质粒的全长
18． 9 kb(图 2)。参照未酶切 λDNA 上样梯度和紫
外吸收测定结果，估测该载体 DNA产物浓度大致为
120 ng /μL，其纯度和浓度均可满足构建植物基因组
文库的要求。
1．未酶切 λDNA Marker;2． λDNA /Hind III 酶切 Marker;
3 － 6． pYLTAC747NH /sacB载体 DNA
图 1 pYLTAC747NH/sacB载体粗体产物电泳检测
1 －6． 10、20、30、40、50、60 ng未酶切 λDNA Marker;7 －12．
1、2、4、5、8 和 10 μL pYLTAC747NH/sacB 载体 DNA20 倍
稀释液
图 2 pYLTAC747NH/sacB载体经纯化后电泳检测
2． 3 载体 DNA的酶切
分别采用梯度酶量对载体 DNA进行单酶切，酶
切时间均为 30 min。从图 3 可以看出，无论是在
Hind III Buffer2 酶切缓冲液中，还是在 HK脱磷酶缓
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
冲液中，当酶用量增至 2． 0 U Hind III /μg 闭环 DNA
时，酶切产物电泳后载体 DNA 均仅现一条带，表明
此时载体 DNA 酶切完全。因此，该载体 DNA 最佳
Hind III完全酶切条件为 2 U Hind III /μg 闭环载体
DNA、37℃酶切 30 min。
1，2．未酶切 λDNAMarker;3，11，17． λDNA/Hind III酶
切 Marker;4． 完整 pYLTAC747NH/sacB 载体 DNA 对
照;5 －10． 0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、3． 0和 4． 0 u Hind III /μg载
体 DNA在 Buffer2中的酶切结果;12 －16． 1． 0、1． 5、2． 0、
3． 0和4． 0 u Hind III /μg载体DNA在脱磷酶 TA缓冲液
中的酶切结果
图 3 pYLTAC747NH/sacB载体 DNA的预酶切
2． 4 线性载体 DNA的脱磷酸化
经 1%琼脂糖凝胶电泳检测结果(图 4)显示，
0． 5 MBU HK脱磷酶 /μg 线性载体 DNA 处理后，脱
磷产物经自连后电泳图谱呈现两条带。而 1． 0 MBU
HK脱磷酶 /μg线性载体 DNA 处理后，自连产物电
泳图谱则仍为一条带，由此表明 1． 0 MBU HK脱磷
酶 /μg线性载体 DNA的脱磷酶用量对该线性载体
脱磷较彻底。为进一步检测脱磷效果，分别将脱磷
后自连产物电击转化大肠杆菌 DH10B 感受态细胞
后，在 LB + Kan 25 mg /L 平板上选择培养。结果
1．未酶切 λDNA Marker;2，9． λDNA/Hind III 酶切 Mark-
er;3．完整 pYLTAC747NH/sacB 载体 DNA 对照;4． 线性
pYLTAC747NH/sacB载体 DNA对照;5． 1． 0 MBU脱磷酶 /
μg处理载体 DNA;6． 1． 0 MBU脱磷酶 /μg 处理载体 DNA
进行自连反应结果;7． 0． 5 MBU脱磷酶 /μg处理载体 DNA;
8． 0． 5 MBU脱磷酶 /μg处理载体 DNA进行自连反应结果
图 4 载体脱磷电泳检测
(图 5)发现，0． 5 MBU HK脱磷酶 /μg处理的线性载
体因脱磷不足，其自连产物电转后在选择平板上长
出比较多的菌落，而后者并未长出菌落，进一步表明
线性载体 DNA完全脱磷所需 HK脱磷酶用量为 1． 0
MBU /μg线性载体 DNA。经琼脂糖凝胶电泳，参照
未酶切 λDNA上样梯度，估测该脱磷线性载体浓度
约为 20 － 25 ng /μL。
图 5 0． 5 MBU HK脱磷酶 /μg处理载体 DNA
自连反应电转化结果
2． 5 载体连接能力检测
将脱磷后的线性载体 DNA 与 λDNA /Hind III
酶切片段在 T4连接酶的作用下连接、并转化大肠杆
菌后，吸取 50 μL转化产物涂布在 LB + Kan 25 mg /
L + 5% Sucrose 平板上，于 37℃倒置培养过夜(图
6)。经 16 － 18 h 培养后，在平板上开始出现单菌
落。随机挑取 10 个菌落，进行质粒提取、酶切检
测(图 7) ，电泳后发现均连接有一定长度的
λDNA /Hind III 片段，说明该载体的连接能力较
好。初步估测每板阳性克隆约 300 个，而 50 μL转
化产物中约含 0． 3125 ng λDNA /Hind III，由此计
算转化频率约为 9． 6 × 108个 /mg，可以用于后续
TAC 文库的构建。
图 6 脱磷后的载体与 λDNA/Hind III酶切片
段连接、电转化结果
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2011 年第 9 期 李晓玲等:可转化人工染色体(TAC)文库载体 DNA的制备
1，14． λDNA/Hind III酶切Marker;2．完整 pYLTAC747NH/
sacB载体对照;3． 线性 pYLTAC747NH /sacB 载体对照;
4 － 13．阳性克隆质粒
图 7 阳性克隆质粒酶切检测结果
根据以上梯度酶切、脱磷和连接转化试验结果，
选用最佳酶切和脱磷条件，大量制备线性载体
DNA。估测浓度后，每管 5 μL分装保存于 － 20℃。
3 讨论
刘耀光等［1］首先成功构建了可转化人工染色
体文库载体 pYLTAC7，并根据不同需要对其进行了
一系列的改进，由此构建成多种类型的 TAC 载体，
用于构建植物大片段基因组文库。这些载体均带有
卡那霉素(KanR)抗性标记，并在克隆位点处引入
sacB基因，sacB基因可以使受体大肠杆菌无法在含
有 5%蔗糖的培养基中存活。电转后，采用 LB +
Kan 25 mg /L + 5% Sucrose 培养基对转化产物进行
双重选择，以保证所长出的菌落均为阳性克隆，进而
大大提高文库的筛选效率。因此在试验之前有必要
对含有 pYLTAC747NH /sacB质粒的克隆进行检测，
以确保 KanR和 sacB 基因正常，否则电转后必然产
生一定量的假阳性克隆，影响文库的筛选。
相对来讲，TAC 系列载体 DNA 片段较大，制备
较高质量的载体 DNA相对困难。因此，为得到高质
量的 pYLTAC747NH /sacB载体 DNA，试验中尝试分
别采用多种 10 － 15 kb 普通质粒提取试剂盒和碱裂
解法提取质粒载体。结果表明普通试剂盒提取的质
粒溶液中载体 DNA 含量太低，无法满足建库要求。
而碱裂解法提取的质粒溶液，用大量 RNAase 处理
后，电泳时仍可看到 RNA 小片段残留，并出现非常
量的条带。由于扫胶反差的原因导致载体 DNA 主
带模糊不清，影响了后续试验的进行。所以试验中
有必要采用 QIAGEN Plasmid Mini kit对碱裂解法提
取的载体 DNA粗提物进行纯化，电泳检测结果表明
纯化后的载体 DNA 纯度和产量均可满足进一步试
验的要求。因此，综合经济和质量两方面考虑，对于
大片段载体的提取与纯化，建议用碱裂解法粗提后，
再用 QIAGEN Plasmid Mini kit 对其粗提产物进行
纯化。
制备高质量的 TAC载体 DNA 的最终目的是为
了能够插入大片段外源 DNA，因而合适的载体完全
酶切和彻底脱磷反应对后续的连接转化非常重要。
有研究表明，酶用量过大可能产生非特异性酶切或
星号活性，进而增加文库中非插入片段克隆，导致产
生假阳性;脱磷不足，载体很容易产生自连。脱磷酶
用量过大，不仅造成不必要的浪费，还会损伤载体，
同样会使载体与外源 DNA的连接能力下降［13］。因
此，本试验采用不同梯度酶量，对载体进行酶切和脱
磷条件摸索。当加酶量增至 2． 0 U Hind III /μg闭环
载体 DNA、酶切时间为 30 min时，载体 DNA完全酶
切;该载体彻底脱磷所需的最低 HK 脱磷酶用量为
1． 0 MBU /μg 线性载体 DNA。将制备的载体 DNA
与 λDNA /Hind III 酶切片段进行连接转化试验，进
一步表明该条件下制备的载体连接能力较好，可用
于制备高质量的 pYLTAC747NH /sacB 载体 DNA，进
而用于植物基因组 TAC文库的构建。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
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主要报道国内外农、林、牧、渔及医学等领域中生物技术研究的新进展、新技术、新成果与发展趋势，内容
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