全 文 ：第 30 卷 第 3 期
2004 年 3 月 　189～195 页 　 　
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
　 　 Vol. 30 , No. 3
pp. 189～195 　Mar. , 2004
利用中间偃麦草抗病基因同源序列分离黄矮病抗性候选基因克隆
张增艳1 　许景升1 　刘耀光2 　王晓萍1 　林志珊1 　辛志勇1 Ξ
(1 中国农业科学院作物育种栽培研究所 ,农业部作物遗传育种重点实验室 ,北京 100081 ;2 华南农业大学生物技术学院 ,广东广州 510642)
摘 　要 　根据已克隆植物抗病 (R)基因编码蛋白质的保守结构设计简并引物 ,利用同源序列法 PCR 扩增、克隆到 9 个具
有开放阅读框的中间偃麦草 R 基因同源片段 (Resistance Gene Analogs ,RGAs) 。利用抗黄矮病材料 (含 Bdv2) 、感黄矮病材
料 (无 Bdv2)进行 RFLP分析 ,筛选到 1 个 NBS类 RGA 序列 TirgaZ1 与 Bdv2 连锁。根据 TirgaZ1 的序列重新设计 1 对引物 ,
优化 PCR 扩增条件 ,将其转化为经典特异 PCR 标记 (SC2TZ1) 。利用该特异 PCR 标记 (SC2TZ1) 和克隆池2PCR 法筛选抗黄
矮病小麦2中间偃草易位系 HW642 基因组的可转化人工染色体 ( Transformation2competent Artificial Chromosome ,TAC) 文库 ,
分离到 4 个阳性 TAC克隆 T1～T4。限制酶切图谱分析结果表明 ,T1～T3 为 1 类 ,插入片段约 23 kb ,T4 为另 1 类 ,插入片
段约为 25 kb。以 TirgaZ1 为探针 ,通过 Southern 杂交证实了阳性 TAC 克隆 T1、T4 为含有 TirgaZ1 序列的抗病基因候选克
隆。分别以中间偃麦草、HW642 和小麦亲本为探针对阳性克隆 T1、T4 进行 Southern 分析 ,结果表明 ,阳性 TAC 克隆 T1、T4
的插入片段均具有抗黄矮病易位系的中间偃麦草易位染色体片段 7XL ,T1、T4 为抗黄矮病基因候选克隆。测定和分析阳
性克隆 T1 插入片段5’ 端 - 6 448 bp 部分的序列 ,表明其最长完整开放阅读框 (Open Reading Frame , ORF)为 2 675 bp ,其编
码产物具有信号肽、低复杂性结构、NB2ARC、跨膜域等结构 ,与已克隆的 NBS2LRR 类抗病基因 RPP13、I2C 等具有同源
性。抗黄矮病基因候选克隆 T1、T4 的生物学功能有待通过转化、抗病鉴定进行验证。
关键词 　中间偃麦草 ;黄矮病抗性 ;抗病基因同源序列 ;可转化人工染色体 (TAC) ;克隆池 PCR
中图分类号 : Q78
Isolation of Resistance Gene Candidates by a Resistance Gene Analog of Thinopyrum
intermedium and Pooled2PCR
ZHANG Zeng2Yan1 ,XU Jing2Sheng1 ,LIU Yao2Guang2 ,WANG Xiao2Ping1 ,LIN Zhi2Shan1 ,XIN Zhi2Yong1
(1 Key Lab of Crop Genetics and Breeding , Ministry of Agriculture , Institute of Crop Breeding and Cultivation , CAAS , Beijing 100081 ; 2 Genetics Engineering Lab ,
South China of Agricultural University , Guangzhou 510642 , Guangdong , China)
Abstract 　Based on the known R gene conserved domains , 10 pairs of degenerate primers were synthesized and used to
amplify genomic DNAs of Th. intermedium and translocation line HW642. The PCR products of Th. intermedium were
excised and cloned. Clones were sequenced and compared to sequence homolog with gene databases in GenBank by Blastx
and blastn. Nine resistance gene analogs ( RGAs) of Th. intermedium with ORF were obtained. Using the RGAs as
probes ,results of RFLP analyses indicated that 1 RGA of TirgaZ1 was associated with Bdv2 gene. Based on the sequence of
TirgaZ1 , a pair of specific PCR primers of TZ1U and TZ1L were designed , synthesized and could amplify only one band
present in the resistance materials with Bdv2 but absent in the susceptible materials without Bdv2 . According to the pooled2
PCR protocol , the primers of TZ1U and TZ1L were used to screen the genomic DNA TAC library of HW642. By three
rounds of screening , four positive TAC clones of T1 , T2 , T3 and T4 were isolated from the library. By restriction enzymes
analysis , four positive clones T1 —T4 were classified into two categories , of which T1 , T2 and T3 belonged to one group
with the insert about 23 kb , and T4 belonged to another with the insert about 25 kb. The clones T1 and T4 were further
confirmed to be resistance candidates for Bdv2 by Southern analysis with probes of TrgaZ1 , genomic DNA of Th. inter2
medium and of Zhong 8601 respectively.
Key words 　Thinopyrum intermedium ; Resistance to barley yellow dwarf virus ;Resistance gene analog(RGA) ; Transfor2
mation2competent artificial chromosome(TAC) ;Pooled2PCR
基金项目 :国家高新计划 (2001AA222093) 。
作者简介 :张增艳 (1963 - ) , 博士 ,研究员 ,主要从事小麦遗传与育种。Tel : 010268918781 E2mail :zyzh268 @163. com
Received(收稿日期) :2003202226 ,Accepted (接受日期) : 2003206226.

　　中间偃麦草是异源六倍体的多年生小麦近缘植
物 ,具有许多对小麦改良有益的重要基因 ,其中抗黄
矮病基因即是栽培小麦缺乏的基因。本实验室和澳
大利亚合作 ,将中间偃麦草第 7 部分同源群染色体
7X长臂上抗黄矮病基因 Bdv2 成功地导入小麦 ,育
成抗黄矮病的小麦2中间偃麦草小片段易位系
HW642、YW443、TC 系等[1～3 ] 。为了更好地利用中
间偃麦草的这些重要抗病基因 ,彻底防治小麦病害 ,
分离克隆这些抗病基因、揭示其抗病分子遗传机制
非常必要。
目前分离克隆功能产物序列未知的植物抗病
(Resistance , R)基因主要采用图位克隆法和转座子
标签法。图位克隆法需要精细的遗传图谱及物理图
谱、建立多种文库 ,工作量巨大。转座子标签法需要
有效的转座子体系和大量筛选工作。对于基因组庞
大、遗传图谱不够完善的中间偃麦草 ,采用上述方法
克隆其抗病基因显然十分困难。然而 ,已克隆植物
R 基因编码的蛋白质结构具有一定保守性 ,如具有
核苷酸结合位点 (NBS) 、富亮氨酸重复 (LRR) 或丝氨
酸/ 苏氨酸蛋白激酶 (STK) 等保守区域 ,该特点为利
用同源序列法分离其他植物抗病基因提供了一条快
捷的新途径[4 ,5 ] 。国内外学者已利用同源序列法从
多种植物中分离克隆了多个抗病基因类似物 (Resis2
tance Gene Analog , RGA) [4～10 ] 。但迄今未见有关中
间偃麦草 RGA 的报道。
与抗病基因紧密连锁的 RGA 片段是从基因组
文库中分离抗病基因候选克隆的重要探针。筛选文
库的传统方法是菌落原位杂交法。为了减少保存文
库和筛选文库所需的工作量和资金 ,我们构建的抗
黄矮病小麦2中间偃麦草易位系 HW642 的基因组
TAC 文库[11 ] ,以混合池法保存于 24 块 96 孔板中 ,每
一个孔 (即 1 个克隆池) 保存了 1 000 个不同重组克
隆 ,其中 1 个特定克隆只占每个克隆池的 1/ 1 000 ,
难以用传统的菌落原位杂交法进行有效筛选。Liu
等建立了用克隆池 PCR 法 (Pooled2PCR)筛选 TAC 文
库的方法 ,并从“中国春”小麦 TAC 文库中筛选到 Ⅰ
型硫素基因[12 ] 。
本研究利用保守序列法从中间偃麦草基因组
DNA 中进行 PCR 扩增、克隆 RGA ,利用抗黄矮病材
料 (含 Bdv2) 、感黄矮病材料 (无 Bdv2) 进行 RFLP 分
析 ,筛选到与 Bdv2 连锁的 RGA 片段 ( TirgaZ1) ,据其
序列重新设计引物 ,将其转换为经典的特异 PCR 标
记 (SC2TZ1) 。采用克隆池 PCR 法 ,通过 3 轮筛选 ,分
离到与 TirgaZ1 同源的 2 类抗病基因候选克隆 ,并对
其中 1 类进行了部分序列的测定与分析。
1 　材料和方法
1. 1 　材料
　　携有抗黄矮病基因 Bdv2 的小麦2中间偃麦草易
位系 HW642、YW443、YW243、YW1029 及二体附加系
L1、端体附加系 7Ai21L 和中间偃麦草 ,均由本实验
室选育或收集保存。
感病材料 :感病系 HW641S( HW642 姊妹系) 、小
麦亲本中 8601、中 7902、中国春 ( CS) , Vilmorin 27
(Vi) 。也由本室选育或收集保存。
小麦2中间偃麦草易位系 HW642 基因组 TAC 文
库由本课题组构建保存[11 ] 。
1. 2 　RGA引物的设计和 PCR扩增
分别根据已克隆 R 基因的 NBS、LRR 和 STK(丝
氨酸/ 苏氨酸)激酶等保守结构 ,设计简并引物 ,其序
列见表 1。
以中间偃麦草基因组 DNA、抗病易位系 HW642
及显微分离的 7XL 扩增产物为模板 ,分别利用上述
引物对其进行 PCR 扩增。PCR 扩增反应总体积为
25μL ,反应液由 10 mmol/ L , Tris2HCl (pH 8. 3) , 50
mmol/ L KCl ,2. 0 mmol/ L MgCl2 , dNTPs 各 200μmol/
L ,模板DNA 50 mg/ L ,正反引物各 0. 4～0. 5μmol/ L ,
Taq 聚合酶 1 U ,加水至 25μL 组成 ,反应在 PCR 扩
增仪 ( Perkin Elmer Cetus , DNA Thermal Cycle 480) 上
进行。程序如下 :94 ℃预变性 5 min ,再进行 35 个循
环 (94 ℃ 45 s ,50 ℃ 1. 5 min , 72 ℃ 1. 5 min) ,最后
72 ℃延伸 10 min。
1. 3 　PCR产物的克隆与分析
PCR 产物用 1. 0 %琼脂糖凝胶、1 ×TAE 电泳缓
冲液进行分离。用玻璃奶试剂盒回收 PCR 扩增片
段 ,回收产物用 p GEM2T easy vector system ( Promega)
试剂盒连接 ,电激转化 E. coli JM109 菌株感受态细
胞 (电激仪为Bio2Rad 公司的 E. coli Pulser) ,涂于含
IPTG、X2gal 和氨苄青霉素 (75 mg/ mL)的 LB 平板上 ,
37 ℃培养过夜 ,挑取单个白色菌落 ,液体 LB 培养后
用碱法提取质粒 DNA。用最接近克隆位点的 Eco R Ⅰ
酶切检测插入片段的有无与大小 ,再用 Sau 3A Ⅰ酶
切 ,对重组克隆进行指纹分析、分类 ,每类抽取1～2
个克隆采用 T7 或 SP6 引物从一端测定插入片段的
序列 ,用 Blast 软件在 GenBank 数据库进行同源序列
搜索。
091 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

表 1 RGA引物的序列
Table 1 Sequences of resistance gene analog ( RGA) primers
引物
Primer
序列　　
Sequence (5’ - 3’)
基因
Gene
结构域
Domain
来源
Source
Kin1a GGIGGIGTIGGIAAIACIAC N , Rps2 P2loop This study
HD A(A/ G) AGCIA( G/ A) IGGIA( G/ A) ICC N , Rps2 GLPLA/ TL This study
S1 GGTGGGGTTGGGAAGACAACG N , Rps2 P2loop Leister et al . [4 ]
AS1 C(A/ C) ACGCTAGTGGCAATCC N , Rps2 GLPLA Leister et al . [4 ]
NLRR Rev TATAAAAAGTGCCGGACT N LRR This study
NLRR For TAGGGCCTCTTGCATCGT N YGLLHR This study
RLKF GA(T/ C) GTNAA(A/ G) CCIGA(A/ G) AA Lr10 k Ⅵ区 This study
RLKR TC(T/ C) GG(T/ C) GC(A/ G) AT(A/ G) TANCCNGGITGICC Lr10 k Ⅷ区 Feuillet , et al . [13 ]
STK2F GNTTYGGNAGYGTNTAYAARGG Lr10 k 起始区 VYKG Feuillet , et al . [13 ]
STK2R TCYGGYGCRATRTANCCCATIGTICC Lr10 k Ⅷ区 This study
Cf9F CGAGACGACAGGACAAGTGA Cf9 3152334 This study
Cf9R CAACCGTAACCCACGAGAAC Cf9 251622497 王石平等 [5 ]
PtoF GTTTACAAGGGTGTTTTGCG Pto 1632182 王石平等 [5 ]
PtoR TATTATGCGACTCCACTGCC Pto 7842765 王石平等 [5 ]
Xa21F ATAGCAACTGATTGCTTGG Xa21 322523243 王石平等 [5 ]
Xa21R CGATCGGTATAACAGCAAAAC Xa21 Downstream of 3’ 王石平等 [5 ]
end of Xa21 王石平等 [5 ]
KIN2A TGATACTGGATGATGTCTGG Cre3 Kinase2 Collin et al . [8 ]
EGF GTGCTTCTTATGAACCCTTC Cre3 EGF Collin et al . [8 ]
1. 4 　RFLP分析
RFLP分析程序参见本实验室程序[14 ] ,采用 Eco
R Ⅰ、EcoR Ⅴ、Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ、Dra Ⅰ、Pst Ⅰ、Xho
Ⅰ、Xba Ⅰ、Bgl Ⅱ等限制性内切酶完全消化中间偃
麦草、HW642、HW641S和小麦亲本中 8601 各 15μg ,
探针为序列分析后确定的 RGA 片段。
1. 5 　特异 PCR标记的建立
根据与 Bdv2 连锁 RGA 片段的序列及其与 E.
coli 基因组序列比较结果 , 设计一对特异引物
TZ1U、TZ1L ,根据该引物的 Tm 值设计扩增程序 ,对
含 Bdv2 的不同抗病系、感病材料 (无 Bdv2) 进行
PCR 扩增 , 以建立经典的特异 PCR 标记。
1. 6 　抗病易位系基因组 TAC文库的筛选
用碱裂解法提取抗病易位系 HW642 的基因组
TAC文库的所有混合质粒。通过克隆池 PCR 法进
行筛选 :第 1 轮筛选以 1 000 个混合克隆的质粒作为
一个扩增模板 ;第 2 轮筛选将初级阳性克隆池稀释
铺单板、收集 50～60 个克隆构成次级克隆池作为 1
个扩增模板 ,第 3 轮筛选是将次级阳性克隆池再次
稀释分离单菌落作为扩增模板。PCR 扩增反应总体
积为 25μL ,其组成为 10 mmol/ L Tris2HCl (pH 8. 3) ,
50 mmol/ L KCl , 210 mmol/ L MgCl2 , dATP、dTTP、
dGTP和 dCTP 各 012 mmol/ L , Taq 聚合酶 1 U ,10～
20 ng 质粒 ,1 对特异 PCR 引物各 0. 5μmol/ L ,补水
至25μL ,反应在 PCR 仪 9 600 或 PTC2100 上进行 ,扩
增程序 :
95 ℃变性 3 min ,进入以下程序 35 个循环 (94 ℃45 s ,
64 ℃1 min ,72 ℃ 1. 5 min) ;然后 72 ℃延伸补平 10
min。
1. 7 　可能的阳性单克隆的鉴定
用 EcoR Ⅰ、EcoR Ⅴ、Not Ⅰ、Pst Ⅰ、Sca Ⅰ、
Xho Ⅰ、Hind Ⅲ、Xba Ⅰ、BamH Ⅰ等 9 种限制性内切
酶消化可能阳性的 TAC 单克隆质粒 ,然后碱变性转
膜 ,用宝生物工程公司 BcaBEST DNA 聚合酶标记
TirgaZ1 片段作探针 ,进行 Southern 杂交分析 ,在 Ko2
dak K磷屏上曝光适时 ,用 Molecular Image (Bio2Rad
公司)系统扫描、记录结果。
再以中间偃麦草、抗病易位系 HW642、小麦亲
本中 8610 基因组 DNA 约 30 ng 作探针 ,对各种限制
酶切阳性克隆质粒的产物进行 Southern 分析 ,程序
同上。
2 　结果与分析
2. 1 　中间偃麦草 RGA的克隆与序列分析
　　除 NF + NR 引物对外 ,其余 9 对引物对分别在
中间偃麦草基因组 DNA 中扩增到 1～3 条理想带
(图 1) ,回收中间偃麦草和 7XL 的预想扩增片段 ,进
行克隆。限制酶 ( EcoR Ⅰ, Sau3A Ⅰ) 酶切图谱分析
白色克隆 ,部分克隆进行测序和序列分析。结果表
明 ,获得 9 个具有开放阅读框的中间偃麦草 RGA ,分
别属于 NBS、STK、LRR 类 ,这些 RGA 特点见表 2。
191　3 期 张增艳等 :利用中间偃麦草抗病基因同源序列分离黄矮病抗性候选基因克隆 　　　

图 1 RGA引物的扩增结果
Fig. 1 PCR products amplified by RGA primers
模板 1 ,6 ,11 ,15 ,20 ,25 ,30 :7XL ;2 ,7 ,16 ,21 ,26 ,31 : HW642 ;3～5 ,8～10 ,12～14 ,17～19 ,22～24 ,27～29 ,32～34 :中间偃麦草 ;引物 1～3 :
K2A/ EGF 引物对 ;4 : EGF ;5 : K2A ;6～8 :NLRRF/ NLRRR 引物对 ;9 :NLRRR ;10 :NLRRF ;11 ,12 :RFKF/ RLKR 引物对 ;13 :RLKR ;14 :RLKF ;15～17 :
S1/ AS1 引物对 ;18 :AS1 ;19 :S1 ;20～22 :ST2F/ ST2R 引物对 ;23 :ST2R ;24 :ST2F ;25～27 :CF9F/ CF9R ;28 :CF9R ;29 :CF9F ;30～32 : K1A/ HD 引物
对 ;33 :HD ;34 : K1A ;M:λ/ Eco R Ⅰ+ Hin d Ⅲ分子量标准
Template 1 ,6 ,11 ,15 ,20 ,25 ,30 :7XL ;2 ,7 ,16 ,21 ,26 ,31 :HW642 ;3～5 ,8～10 ,12～14 ,17～19 ,22～24 ,27～29 ,32～34 : Th. intermedium ;Primers
1～3 : K2A/ EGF pair ;4 : EGF ;5 : K2A ;6～8 :NLRRF/ NLRRR pair ;9 :NLRRR ;10 :NLRRF ;11 ,12 : RFKF/ RLKR pair ;13 : RLKR ;14 : RLKF ;15～17 :S1/
AS1pair ;18 :AS1 ;19 :S1 ;20～22 :ST2F/ ST2R pair ,23 :ST2R ;24 :ST2F ;25～27 :CF9F/ CF9R pair ;28 :CF9R ;29 :CF9F ;30～32 : K1A/ HD pair ;33 : HD ;
34 : K1A ;M:λ/ Eco R Ⅰ+ Hin d Ⅲmolecular marker
表 2 中间偃麦草 R基因同源序列的特点
Table 2 Features of resistance gene analogs of Thinopyrum intermedium
片段的名称
Name of RGA
片段大小
Size (bp)
类别
Type
引物对
Primer pair
与已克隆基因编码蛋白的同源性比较 Alignment comparing
基因名称 Gene name Identities ( %) Positive ( %)
TirgaZ1 537 NBS S1/ AS1 RPP13/ RPM1/ Mi/ Rx 39 / 36 / 38 / 34 58 / 58 / 57 / 55
TirgaZ2 536 NBS S1/ AS1 Putative protein of Arabisdopsis 　25 　45
TirgaZ3 670 NBS S1/ AS1 RPP13 / Mi/ I2C21 32/ 31/ 29 53/ 50/ 48
TirgaZ4 541 NBS K1A/ HD RPP13/ I2C22/ Prf/ Rx 30/ 28/ 27/ 26 52/ 49/ 48/ 46
TirgaZ5 532 NBS K2a/ EGF Cre3/ / Rp12dp2/ I2C22 84/ 38/ 33 89/ 55/ 49
TirgaZ6 544 NBS K2a/ EGF Cre3/ Rp12dp3/ I2C22 56/ 36/ 26 69/ 55/ 45
TirgaZ7 485 STK ST2F/ ST2R STK protein of Arabisdopsis 69 83
TirgaZ8 488 STK ST2F/ ST2R STK protein of Arabisdopsis 64 80
TirgaZ9 455 — RLKF/ R GYPSY反向转座子 65 80
TirgaZ10 428 LRR NLRRF/ R Xa1/ Cf9 21/ 17 42/ 36
2. 2 　与抗黄矮病基因 Bdv2 连锁的 RGA 的鉴定及
其转换
利用上述中间偃麦草 RGA 为探针 ,与中间偃麦
草、抗病易位系 HW642 和感病系 HW641S、感病小麦
亲本中 8601 等基因组 DNA 限制酶切产物 ,构成不
同的酶切/ 组合 ,进行 RFLP 分析。结果表明 ,大多
数 RGA 片段/ 酶切组合没有多态性 ,只有 1 个 RGA
片段 TirgaZ1 与 EcoR Ⅰ酶切组合 ,能够检测出抗病
杂交带 ;进一步扩大抗病与感病样品 ,表明 TirgaZ1/
EcoRⅠ组合能够在含有 Bdv2 的抗病材料 (中间偃
麦草 , L1、抗 病 易 位 系 HW642、Yw443、Yw243、
Y990129 及 F2 抗病单株)中检测到约 4. 0 kb 的特异
杂交带 ,而没有 Bdv2 的感病系 HW641S、感病小麦
亲本中 7902、Vi、CS及 F2 感病单株均没有上述特异
杂交带 (图 2) ,说明 TirgaZ1 是 Bdv2 连锁的 RGA 基
因片段 ,可作为筛选文库的探针。
为了采用 PCR 法高效筛选文库 ,根据 TirgaZ1 序
列重新设计了 1 对特异 PCR 引物 TZ1U、TZ1L ,优化
PCR 扩增条件后 ,以具有 Bdv2 抗病材料和没有
Bdv2 的感病材料的基因组 DNA 为模板 ,进行 PCR
扩增。结果表明 ,引物对 TZ1 (U + L) 能够在具有
Bdv2 的抗黄矮病材料中扩增出约 460 bp 的单一产
291 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

图 2 Tirga Z1/ Eco R Ⅰ的 Southern 杂交
Fig. 2 Southern hybridization of Eco R Ⅰdigested DNAs
1 ,2 : 中间偃麦草 ;3 : 7Ai21L ;4～7 : 抗病易位系 ;8 ,9 : 感病系
和小麦亲本 ;M: 分子量标准
1 ,2 : Th. intermedium ; 3 : 7Ai21L ; 4～7 : Resistant translocation
lines ;8 ,9 :Susceptible line and wheat parents ;M:λDNA/ Hin dⅢ
物 ,而感病材料中无任何扩增产物 (图 3) ,说明特异
的 TirgaZ1/ EcoR Ⅰ标记成功地转换为经典的特异
PCR 标记 (SC2TZ1) ,可用于 PCR 法筛选文库。
图 3 引物 TZ1( U+ L)扩增抗病材料、感病材料
Fig. 3 PCR pattern with primer pair of TZ1 ( U+ L)
Z1146 : 中间偃麦草 ; ZY172、ZY200 : HW642 ; M: 分子量标准
Z1146 : Th. intermedium ; ZY172 ,ZY200 : HW642 ; M:λDNA/ Eco
R Ⅰ+ Hin d Ⅲmolecular marker
2. 3 　抗病易位系基因组 TAC文库的筛选
利用特异引物对 TZ1 (U + L)和 Pooled2PCR 法筛
选抗病易位系 HW642 的基因组 TAC 文库。通过第
一轮筛选 ,分离到 3 个初级阳性克隆 (图略) ,每个初
级克隆池稀释涂布 ,50～60 个菌构成 1 个次级克隆
池 ,再经 Pooled2PCR 筛选 ,获得 13 个次级阳性克隆
池 (图 4) ,将次级阳性克隆池稀释铺成单菌落 ,对每
个次级阳性克隆池挑取 96～192 个单菌落分别做模
板进行 PCR 筛选 ,获得 4 个阳性单克隆 T1、T2、T3、
T4 (图略) 。同时用引物对 TZ1 (U + L) 扩增这 4 个单
克隆和抗病 (中间偃麦草 : Ti、抗病易位系 HW642 :
R) 、感病对照 (感病系 HW641S : S、小麦亲本 : 中
8601)基因组 DNA ,结果表明 4 个阳性单克隆与抗病
对照扩增带一致 (图 5) 。
对上述 4 个阳性 TAC 克隆质粒进行 EcoR Ⅰ、
EcoR Ⅴ、Not Ⅰ、Pst Ⅰ、Sca Ⅰ、Xho Ⅰ、Hind Ⅲ、
Xba Ⅰ、BamH Ⅰ等 9 种酶切分析 ,结果表明 4 个阳
性克隆分为 2 类 ,T1、T2、T3 为 1 类 ,T4 为另 1 类 (图
略) ,插入片段分别为 23 kb、25 kb 左右。将阳性克
隆 T1 和 T4 的酶切产物转移到尼龙膜上 ,以 RGA 基
因片段 TirgaZ1 做探针进行 Southern 杂交。看到各
种酶切产物均有明显的不同杂交带 ,并且同一酶切
产物杂交带中包含 1～2 条相同带和 1～3 相异带
(图 6) ,说明这 2 个克隆为含有 NBS 类 R 基因片段
TirgaZ1 的候选抗病基因克隆。
图 4 第 2 轮筛选 TAC文库部分结果
Fig. 4 PCR products of partial TAC clones in second
round amplified with primer pair of TZ1( U+ L)
1～17 :次级克隆池 ;箭头示阳性扩增带
1 - 17 :Secondary pools
图 5 TZ1 ( U+ L)扩增阳性克隆和对照箭头示阳性扩增带
Fig. 5 PCR products of positive single TAC clones and
controls amplified with primer pair of TZ1( U+ L)
391　3 期 张增艳等 :利用中间偃麦草抗病基因同源序列分离黄矮病抗性候选基因克隆 　　　

图 6 Tirga Z1 作探针与内切酶消化阳性
克隆产物的 Southern 杂交
Fig. 6 Southern hybridization of digested positive clones
by restriction enzymes with Tirga Z1
将阳性克隆 T1 和 T4 的酶切产物转膜 ,分别以
抗黄矮病中间偃麦草、抗黄矮病易位系 HW642 和小
麦亲本中 8601 的基因组 DNA 做探针 ,进行 Southern
杂交分析 ,由杂交图谱 (图略) 可知 ,阳性克隆 T1、T4
的 Xho Ⅰ、EcoR Ⅴ、EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ酶切产物 ,能与
中间偃麦草、HW642 的基因组 DNA 杂交出在小麦杂
交中不存在的特异杂交带 ,即阳性克隆 T1 和 T4 插
入片段中有中间偃麦草特异片段 ,说明阳性克隆 T1
和 T4 来源于抗黄矮病易位系的中间偃麦草易位染
色体片段 7XL ,是抗黄矮病候选基因克隆。
3 　讨论
近年来 ,植物抗病基因分离克隆的研究已成为
植物分子生物学领域的热点之一。图位克隆法已成
功分离 10 多个植物抗病基因 ,如水稻 Xa21、Xa1、
Pib 和番茄 Pto 等。图位克隆时必须对 R 基因进行
精细定位 ,寻找与该基因紧密连锁的分子标记 ,再利
用基因区段两侧的标记筛选基因组文库 ( YAC、BAC
或 TAC 文库) ,构建克隆重叠群 ,确定候选基因所在
的克隆 ,对此克隆进行亚克隆 ,经互补试验来证实基
因的功能。而小麦不仅基因组庞大 ,基因组大小为
116 ×1016 bp ,相当水稻基因组的近 40 倍 ,且重复序
列含量丰富 ,这些特点使寻找到小麦抗病基因区段
两侧的分子标记比较困难 ,更增加了染色体步移或
重叠克隆群构建的难度 ,至今尚无分离小麦抗病基
因的成功报道。小麦2中间偃麦草易位系中抗黄矮
病基因 Bdv2 来源于中间偃麦草染色体 7XL。由于
中间偃麦草与小麦染色体间重组交换频率很低 ,难
以精确定位于 7XL 上的分子标记与 Bdv2 的遗传距
离 ,也难以进行染色体步移 ,采用通常图位克隆法分
离克隆抗黄矮病基因 Bdv2 的可能性较小。利用同
源序列法克隆中间偃麦草抗病基因同源序列 RGA ,
通过 RFLP 分析 ,筛选与 Bdv2 连锁的 RGA ,可望获
得 7XL 片段上的某一 R 基因 (簇) 或抗黄矮病基因
Bdv2 的一部分或紧密连锁的标记 ,再以此做切入
口 ,筛选基因组文库 ,直接着陆到某一 R 基因 (簇)
或抗黄矮病基因 Bdv2 中。
本文首次克隆了中间偃麦草 RGA 基因片段 ,特
别是NBS类 RGA 与已克隆 R 基因具有一定同源性 ,
具有 NBS 的保守区。通过 RFLP 分析鉴定出 1 个
RGA 片段 TirgaZ1 与 Bdv2 共分离 ,位于 7XL 上。但
是利用 Cf9F/ R、RLKF/ R、Xa21F/ R、NLRRF/ R 等引
物扩增的中间偃麦草片段 ,克隆的插入片段经序列
分析后发现 ,许多扩增产物并非与设计引物所依据
的 R 基因同源 ,主要原因是 :设计引物的专一性不
强 ,扩增条件并非最佳 ,或者是中间偃麦草基因组缺
乏上述结构。另外每对引物均可在抗病易位系
HW642 基因组 DNA 中扩增 ,对其克隆进行酶切分
析、序列分析 ,从中获得 35 个 RGA ,对它们进行
RFLP 分析发现 ,HW642 来源的大多数 RGA 与小麦
基因组同源性更高 ,可能与扩增产物来源于易位系
的小麦部分的基因组有关。当以 7XL 的 LA2PCR 产
物为模板 ,仅有 S1/ AS1、NLRRF/ NLFFF 2 个引物对
能扩增出理想产物 ,其余引物不能很好扩增 ,原因可
能与 7XL LA2PCR 产物的片段太小或其中没有与引
物很好配对的序列有关。即使来源 7XL LA2PCR 产
物的 RGA 也没有找到与 Bdv2 相关片段 ,或许与获
得的 RGA 太少或与 7XL LA2PCR 产物中不包含 7XL
完整序列有关。
克隆池 PCR 法筛选基因组文库较传统的菌落
原位杂交法有以下优点 : ①PCR 法速度快、效率高、
易操作 ,而菌落原位杂交需要用特殊设备将菌落影
印到尼龙膜上 ,再用同位素进行标记杂交 ,难度大。
②由于构建基因组文库时 ,以大肠杆菌作为受体 ,因
此与大肠杆菌基因组 RNA 有部分同源性的 DNA 序
列 ,在菌落原位杂交时 ,背景往往很深 ,易于掩盖阳
性克隆的信息 ,只能通过克隆池 PCR 法筛选。③由
于抗黄矮病小麦2中间偃麦草易位系 HW642 基因组
TAC文库以混合池方式进行保存 ,每 1 个混合克隆
池有 1 000 个不同的克隆 ,其中一个特定克隆只占
491 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

每个克隆池的 1/ 1 000。用菌落原位杂交筛选时杂
交信号过弱会影响筛选结果。而 PCR 扩增的灵敏
度高 ,克隆池 PCR 法能够检测到混合克隆池中每个
克隆。
本文首先根据与 Bdv2 共分离的 RGA 序列及其
与大肠杆菌基因组序列比较的结果 ,设计了 1 对严
紧度高的特异引物 ,能够在抗黄矮病材料基因组中
扩增出单一产物 ,而感病材料和大肠杆菌中无扩增
产物 ,然后再用这对特异引物 ,通过克隆池 PCR 方
法高效筛选了庞大的抗黄矮病小麦2中间偃麦草易
位系 HW642 的 TAC 文库 ,分离到 4 个阳性克隆T1～
T4。对 T1～T4 进行限制酶切图谱和 Southern 杂交
分析 ,T1～T3 为一类 ,T4 为另一类 ,它们含共有序列
也含特有序列 ,可能会构成一个 contig ,并证实了
T1～T4 确为含有 NBS的抗病基因候选克隆 ,可能是
7XL 上抗黄矮病基因 Bdv2 的候选克隆。其生物学
功能有待通过转化和抗病鉴定来验证。
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591　3 期 张增艳等 :利用中间偃麦草抗病基因同源序列分离黄矮病抗性候选基因克隆