全 文 ：抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系基因组可转化
人工染色体文库的构建及初步筛选
王晓萍1 , 张增艳1, ① , 张群宇2 , 刘耀光2 , 辛志勇1
(1.中国农业科学院作物育种栽培研究所农业部作物遗传育种重点实验室 ,北京　100081;2.华南农业大学生物技术
学院遗传工程研究室 , 广州　510642)
摘要:利用抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系 HW642 的细胞核 DNA构建了一个可转化人工染色体(transformation-
competent artificial chromosome , TAC)文库 ,文库由 2.3×106 克隆构成 ,重组率为 90.48%, 平均插入片段大小为 22kb
左右 ,约覆盖普通小麦单倍体基因组 2.5倍 , 在该文库中分离得到单拷贝 DNA序列的几率约是 95.77%。文库保存
在24 块96 孔板中 , 每个孔中约含有1000 个不同的重组克隆 , 可以采用Pooled PCR的方法对文库进行筛选。用来源
于小麦的简单重复序列(simple sequence repeat , SSR)引物 wms37 扩增中间偃麦草 、抗病易位系及感病材料 , 得到一条
与抗性共分离的特异条带 ,约 450bp。将此特异标记条带转化为 SCAR(sequence characterized amplified region)标记 , 用
于筛选HW642 基因组 TAC文库 , 得到 12 个阳性克隆。对阳性克隆进行了 PCR-Southern验证 , 以中间偃麦草基因组
总DNA为探针与限制酶 HindⅢ消化后的阳性克隆杂交 , 其中10个阳性克隆分别有 1～ 6 条杂交带 ,结果表明 , 这10
个阳性克隆可作为抗黄矮病相关基因筛选的候选克隆。
关键词:小麦;黄矮病抗性;可转化人工染色体(TAC);文库;SCAR
中图分类号:Q75　　文献标识码:A　　文章编号:0379-4172(2002)08-0712-07
Construction , Characterization and Screening of a Transformation-Competent Artificial
Chromosome(TAC)Library of Wheat-Thinopyrum intermedium Translocation
Line with Resistance to Barley Yellow Dwarf Virus
WANG Xiao-Ping1 , ZHANG Zeng-Yan1, ① , ZHANG Qun-Yu2 , LIU Yao-Guang2 , XIN Zhi-Yong1
(1.Key Laboratory of Crop genetics and Breeding of Ministry of Agriculture , Institute of Crop Breeding and Cultivation , Chinese Academy
of Agricultural Sciences , Beijing 100081 , China;2.Genetic Engineering Laboratory , College of Biotechnology , South China
Agricultural University , Guangzhou 510642 , China)
Abstract:A transformation-competent artificial chromosome (TAC)library was constructed from the genomic
DNA of wheat-Th.intermidium translocation line HW642 that harbor the barley yellow dwarf virus (BYDV)
resistance gene derived from Th .intermidium.The library consists of 2.3×106 clones with an average insert
size of 22kb , representing approximately 2.5 haploid genome equivalents and is able to give a greater than
95.77%probability of isolating single-copy DNA sequences from this library.The library was stored as frozen
cultures in 24 96-well formats , each well containing approximately 1000 different clones.TAC clones containing
interest gene could be identified by the pooled PCR technique.A sequence characterized amplified region
(SCAR)marker cosegregated with BYDV resistance gene , derived from a simple sequence repeat (SSR)or
microsatellite marker wms37 of wheat ,was applied to screen the TAC library.Twelve clones were successfully
收稿日期:2002-01-31;修订日期:2002-03-24
基金项目:国家植物转基因专项(J99-A-011)和“ 863”项目(2001AA222093)资助[ The project is supported by the National Special Fund of Transgenic
Plant(J99-A-011)and the National“ 863” Program of China(2001AA222093)]
作者 E-mail:dr wxp@sina.com
①联系人。 E-mail:zyzh-68@163.com
　　　　
遗 传 学 报 , 29(8):712～ 718 , 2002
Acta Genetica Sinica
selected by the pooled PCRmethod.PCR products were identified by hybridizing with the SCAR marker band
of Th.intermidium .Out of 12 clones ,10 positive clones restricted by Hind Ⅲ were shown to hybridize with
genomic DNA of Th.intermidium.These results showed evidences that the 10 clones could be used as
candidate clones for isolation of BYDV resistance and its related genes , and the TAC library is a useful resource
for isolating genes.
Key words:wheat;transformation-competent artificial chromosome (TAC);resistance to barley yellow dwarf
virus(BYDV);sequence characterized amplified region(SCAR)
　　小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒(barley yellow
dwarf virus ,BYDV)引起的小麦重要病害之一 , 世界
上许多小麦主产国都有该病害的发生 ,危害严重 ,难
以预测和控制。迄今 ,在普通小麦属内还未找到良
好的抗源 。中间偃麦草(Thinopyrum intermedium 或
Agropyron intermedium , 2n =6x =42 , E1E1E2E2XX 或
E1E1E2E2StSt)至少含有 2 个 BYDV抗性基因 , 分别
位于第 2(2Ai-2)和第 7(7Ai-1 , 7X)部分同源群染色
体上[ 1] 。7X上抗黄矮病基因已成功导入小麦 ,育成
一批抗病小麦-中间偃麦草易位系 ,如HW642为纯
合小片段易位系 ,携带 BYDV抗性基因的 7X长臂片
段易位到小麦染色体 7D长臂端部[ 2] ,遗传学研究表
明 ,其 BYDV抗性由显性单基因控制[ 3] ,为分离抗黄
矮病基因的基础材料 。
目前 , 酵 母 人 工 染 色 体 (yeast artificial
chromosome ,YAC)、细菌人工染色体(bacteria artificial
chromosome ,BAC)等载体是构建基因组文库常用的
载体。Murrary等利用酵母染色体的 3个元件构建
了第一个酵母人工染色体[ 4] 。现已成功构建了人 、
牛 、猪 、绵羊 、小鼠 、果蝇等动物及拟南芥 、玉米 、番
茄 、大麦 、甜菜 、水稻和马铃薯等植物的 YAC文库 。
YAC文库的突出优点是插入片段长 ,如人的 YAC 文
库平均插入片段长度达 900kb ,但易形成嵌合体 ,不
够稳定 。Shizuya等以大肠杆菌 F 因子为基础 ,采用
F因子的复制原点 ,以氯霉素抗性基因为选择标记
构建了细菌人工染色体(BAC)载体 , pBAC108L[ 5] 。
BAC文库的插入片段长度一般为 100 ～ 350kb。BAC
克隆虽不如 YAC克隆插入片段长 ,但有许多优点 ,
稳定性好 ,文库构建速度快 ,BAC 克隆易于分离 ,筛
选 BAC文库方便等 。利用 YAC 、BAC 文库进行目的
基因筛选时 ,在获得候选克隆后要进行亚克隆 ,然后
对每个亚克隆逐一进行基因功能互补试验 ,工作量
巨 大 。 Liu 等 结 合 PAC (Pl-derived artificial
chromosome)载体和双元载体的特点构建了植物可转
化人工染色体(TAC)载体 ,其最大的优点是含 P1质
粒和 Ri质粒 pRiA4的复制子 ,能在大肠杆菌和根癌
农杆菌中以单拷贝形式复制。因此 ,一旦筛选到目
标阳性克隆 ,可直接利用农杆菌转化系统将其转到
植物体中进行基因功能互补实验 ,不必进行亚克隆 ,
加速了工作进程[ 6] 。Liu 等构建了普通小麦中国春
(AABBDD)的基因组 TAC 文库 ,并采用 Pooled PCR
方法在文库中筛选到 A 、B 、D基因组中的单拷贝基
因 、一个单拷贝 STS 标记 aWG464和一个 CAB多基
因家族[ 7] 。方玉达等构建了小麦一簇毛麦 6VS 6AL
易位系 TAC 文库[ 8] 。TAC 载体已被证明能够将大
片段DNA高效地转化拟南芥[ 6]和水稻①。
本研究中 ,我们构建了抗黄矮病小麦-中间偃
麦草纯合小片段易位系HW642基因组TAC文库 ,将
与黄矮病抗性基因共分离的一个 SSR标记转化为
SCAR标记 ,并利用这个标记 ,采用Pooled PCR方法 ,
对HW642基因组TAC 文库进行了筛选 ,这些工作为
最终分离黄矮病抗性基因及其相关基因 ,研究抗病
机理打下了良好的工作基础 。
1　材料和方法
1.1　材料
抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系 HW642来
源于二体异附加系 L1(2n=44),系谱为 PP9-1 中
8601 ×3(PP9 -1 为 CSph ×2 L1 CSN5BT5D 3 中
7902 4 中 8601),由中国农业科学院作物育种栽培
研究所选育 。构建基 因组文库所 用的载体
pYLTAC17由华南农业大学刘耀光研究员提供。
SSR 引物 wms37 由 国际 玉米 小麦 改良 中心
(CIMMYT)Dr.M.Henry 提供。
1.2　方法
1.2.1　HW642 基因组 TAC 文库的构建　　根据
Liu等[ 9] 的方法分离小麦的细胞核 DNA ,制备小麦
①崔广荣.基于TAC载体水稻大片段DNA的转移 ,华南农业大
学硕士学位论文 ,2000.
7138期　　　王晓萍等:抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系基因组可转化人工染色体文库的构建及初步筛选
高分子量基因组 DNA , 包埋于低熔点琼脂糖凝胶
中。取 凝 胶 0.75g , 加 入 4mmol L 亚 精 胺
(spermidine),1%BSA ,1×酶切缓冲液 ,0.5U μl Hind
Ⅲ ,冰浴 2 ～ 3h使内切酶均匀地渗入到凝胶中 ,然后
37℃温育 15min。经部分酶切后的基因组 DNA进行
CHEF(Clamped homogeneous electric field)电泳 ,30s※
30s ,1.5h , 10s※2s ,12h。回收 20 ～ 100kb 的片段 ,按
照从小到大分成 1 ～ 9个不同组分 ,在 TE(pH8.0)中
平衡 1h , 4℃保存备用。经 CsCl 离心纯 化的
pYLTAC17质粒用限制酶 Hind Ⅲ 37℃酶切 20min ,
70℃5min 钝化限制酶 ,加 HK 脱磷酸酶 30℃作用
1h ,65℃温育 30min , 最后 , 在 TE(pH8.0)中透析
30min , -20℃保存备用。取不同组分的 DNA ,经琼
脂糖酶消化后 ,用 33mmol L NaCl 、2 3×TE(pH8.0)、
4℃透析 1h。DNA片段与载体以 1∶1.5 ～ 2 的比例
在PCR仪上进行连接反应 ,条件是:10℃ 1s;10℃
2min;16℃ 3min;16℃ 3min;20℃1min;20℃30s , 13
～ 25个循环 ,最后 65℃加热失活连接酶 5min。连接
产物于4℃、1 4×TE(pH8.0)透析 3 ～ 4h 。
通过电激法转化 E.coli DH10B感受态细胞 ,每
次电激取 1 ～ 1.5μl连接产物与 20μl E .coli DH10B
感受态 细胞混合 , 电激的各项参数 是:电压
(voltage),300V;充电(charge),快速(fast);调压器电
阻 (voltage booster resistance ), 2kΨ;电 容
(capacitance),330μF;阻抗(impedance),低(low)。电
激后 ,立即将菌体转入 1.5ml SOC 培养基中 ,37℃震
荡培养(200r min)60min。将培养好的转化菌分别取
50μl 、100μl涂于含25μg ml卡那霉素(km)和 5%蔗
糖的 LB固体培养基(1.5%琼脂)过夜培养 。计算每
个电激反应所得到的克隆数 。每 1000个重组克隆
为一个单位 , 加入保存液(LB +25μg ml km +
36mmol L K2HPO4+13.2mmol L KH2PO4+1.7mmol L
C6H8O7 ·H2O +0.44mmol L MgSO4 +6.8mmol L
(NH4)2SO4 +4.4%Glycerin),用涂布器从平板表面
刮下菌落 ,混匀后平均分成 4份 ,70℃保存于 96 孔
酶标板中 。碱裂解法随机提取文库的质粒 DNA ,用
限制酶 Hind Ⅲ完全消化 ,0.8%琼脂糖凝胶电泳检
查文库插入片段的大小。
1.2.2　黄矮病抗性基因特异 PCR标记 SC-W37 的
获得　　用位于小麦 7DL 近端部 SSR引物 wms37
扩增中间偃麦草 、抗病易位系及感病材料 ,反应体系
20μl ,包含 1 ×Buffer , 2.0mmol L MgCl2 , 200μmol L
dNTP ,40ng模板 DNA , 0.9U Taq DNA 聚合酶(华美
生物公司), 引物 wms37-R 、wms37-L 的浓度 为
0.125μmol L , 反 应 在 Perkin-Elmer DNA Thermal
Cycler 9600 上进行 , 扩增条件是 93℃ 2min;93℃
1min ,50℃ 2min , 72℃ 2min , 35 个循环;最后 72℃
5min ,3%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 。从凝胶上
切下特异扩增片段 ,用 Glass Milk回收试剂盒(原平
皓生物公司)回收该片段 ,溶于适量无菌水中。
用 pGEM-T Easy Vector System I(Promega)连接回
收的特异片段 ,连接产物用 CaCl2 法转化 E.coli
JM109感受态细胞 ,通过蓝 白斑筛选 、限制内切酶
消化鉴定重组克隆 。挑取 3个重组克隆做序列分析
(上海博亚生物公司),其中一个插入片段来自中间
偃麦草 ,两个来自 HW642 ,根据测序结果设计一对
特异引物 ,分别命名为 SC-W37U和SC-W37L。
用特异引物对 SC-W37(U+L)扩增中间偃麦
草 、抗病易位系及感病材料 ,反应体系 25μl ,包含 1
×Buffer , 2.5mmol L MgCl2 , 100μmol L dNTP , 10 ～
40ng 模板 DNA , 1U Taq DNA 聚合酶(华美生物公
司), 引物浓度为 0.2μmol L , 反应在 Perkin-Elmer
DNA Thermal Cycler 9600 上进行 ,扩增条件是 72℃
5min ,96℃1min;94℃1min ,64℃1min ,72℃ 2min , 30
个循环;最后 72℃5min。扩增产物在 1%琼脂糖凝
胶上电泳检测。
1.2.3　利用特异 PCR引物对 SC-W37(U+L)筛选
HW642 基因组 TAC 文库　　采用碱裂解法提取
HW642基因组 TAC 文库中的质粒 DNA ,然后利用特
异引物对SC-W37(U+L)进行 Pooled-PCR筛选。首
轮筛选以 1000个混合克隆的质粒 DNA为模板进行
扩增 ,在混合池中扩增出特异的片段后 ,将对应池中
的细菌涂 LB平板 ,挑取单克隆提取质粒 DNA作为
模板再扩增 ,直到找到有特异扩增的单克隆 。反应
体系及条件同上。
以 SC-W37扩增的中间偃麦草特异产物作为探
针 ,用Southern杂交的方法验证上面筛选到的阳性
克隆。阳性克隆经限制酶 Hind Ⅲ消化后转膜 ,以标
记的中间偃麦草基因组总 DNA为探针进行 Southern
杂交 ,检查阳性克隆中是否含有来源于中间偃麦草
基因组的DNA序列 。
2　结果
2.1　小麦-中间偃麦草易位系 HW642 的基因组
TAC文库
　　TAC 文库容量 2.3×106 。随机取 63个重组子
检查插入片段大小 , 插入片段在 10 ～ 50kb 之间
714 遗　　传　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　　　 　29卷
(图 1),不同大小插入片段的分布频率如图 2。按加
权平均数计算 ,文库插入片段的平均长度为 22kb。
文库重组率为 90.48%,约覆盖普通小麦单倍体基
因组的 2.5倍。
图 1　重组 TAC克隆限制内切酶 HindⅢ消化结果
M:λ EcoRⅠ +HindⅢ分子量标记
Fig.1　Recombinant TAC clones digested with restriction enzyme HindⅢ
M:λ EcoRⅠ +HindⅢ molecular marker
图 2　HW642基因组 TAC 文库插入片段频率分布情况
Fig.2　Size dist ribution of clones in the TAC library
2.2　黄矮病抗性基因的特异 PCR标记
利用小麦 SSR引物wms37扩增中间偃麦草 、抗
图 3　小麦 SSR引物 wms37 的扩增结果
1 ,2:中间偃麦草;3:L1;4～ 6:易位系;7:感病系H641s;
8:中 8601;箭头示特异片段;M:PCR分子量标记
(Υx174 DNA HaeⅢ)
Fig.3　Analysis with SSR primer wms 37
1,2:Th.Intermedium;3:L1;4 ～ 6:Translocation lines resistant to
BYDV;7:Susceptible line H641s;8:Zhong 8601;Arrow indicates
specific fragment;M:Υx174 DNA HaeⅢ molecular marker
病易位系及感病材料 ,该引物序列为:U:ACT TCA
TTG TTG ATC TTG CAT G ,L:CGA CGA ATT CCC AGC
TAAAC 。结果表明 ,在中间偃麦草和抗病易位系中
图 4　SSR特异片段克隆重组质粒的酶切
1～ 5:插入片段来源于中间偃麦草;6～ 11:插入片段来源于
抗病易位系;M:PCR分子量标记(华美生物公司)
Fig.4　Recombinant clones harboring specific fragment
digested with restriction enzyme
1～ 5:Insert fragment was from Th.Intermedium ;
6～ 11:Insert fragment was from translocation Line resistant
to BYDV;M:PCR molecular marker
7158期　　　王晓萍等:抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系基因组可转化人工染色体文库的构建及初步筛选
可以扩增出一条 450bp 左右的特异带 ,而感病材料
中均无此带(图 3),这条特异带可作为黄矮病抗性
基因的分子标记 。
用pGEM-T Easy Vector System I克隆回收的特异
片段 ,重组质粒用限制内切酶 EcoR I消化(图 4),挑
选插入片段合适的克隆进行序列分析 ,其中 2个的
测序结果如下(划线黑体示 SSR引物序列)。
来源于中间偃麦草的插入片段的序列(3号质粒):
来源于抗病易位系的插入片段的序列(9号质粒):
　　根据测序结果重新设计引物 SC-W37U 与 SC-
W37L ,序列分别是:ACG AAT TCC CAG CTA AAC
GCC CTC 和 TCA TTG TTG ATC TTG CAT GGT CGT
AG 。用这对引物扩增中间偃麦草 、抗病易位系 、感
病材料 ,结果在中间偃麦草和抗病易位系中只扩增
出一条清晰的 450bp左右的特异带 ,感病材料没有
扩增带 。25μl体系中模板 DNA量从 10ng 至 40ng ,
结果均相同 ,说明 SCAR标记 SC-W37的转换是成功
的(图 5)。
图 5　特异引物 SC-W37的扩增结果
1～ 6:模板量为 40ng 25μl体系;7～ 12:模板量为 20ng 25μl体系;13～ 18:模板量为 10ng 25μl体系;1 ,7 , 13:Th intermedium;
2～ 4 , 8～ 10 ,14～ 16:抗病易位系;5 , 11, 17:感病亲本中 8601;6 , 12, 18:感病系 H641s;M:PCR分子量标记
Fig.5　Analysis with primer SC-W37
1～ 6:Concent ration of template is 40ng 25μl;7～ 12:Concent ration of template is 20ng 25μl;13～ 18:Concentration of
template is 10ng 25μl;1 , 7 , 13:Th.intermedium;2～ 4, 8～ 10 , 14～ 16:Translocation lines resistant to BYDV;
5 , 11 , 17:Susceptible parent Zhong 8601;6 , 12 , 18:Lines susceptible to BYDV;M:Molecular marker(PCR)
2.3　用 SCAR标记 SC-W37 筛选 HW642 基因组
文库
　　用一对 SC-W37引物扩增 HW642基因组文库 ,
首轮筛选以 1000 个混合质粒 DNA 为模板 ,在 3 个
混合池中得到与阳性对照相同的扩增带(图 6)。将
有阳性扩增的混合池中的菌稀释后铺在 LB固体培
养基上培养 ,分离出单克隆 ,提取单克隆质粒 DNA
再进行第二轮筛选 ,得到有阳性扩增的单克隆 12
个 。将阳性克隆的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳 、
转膜 、杂交 ,以 SC-W37在中间偃麦草中的扩增产物
为探针和阳性对照 ,结果证明 ,扩增产物与阳性对照
具有较高同源性(图 7 ,图 8)。
716 遗　　传　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　　　 　29卷
图 6　引物SC-W37 对 TAC 文库的首轮筛选结果
在 9 、15、16池中得到与阳性对照 25(中间偃麦草)相同的扩增带 ,如箭头所示;M:分子量标记(λ EcoRⅠ+HindⅢ)
Fig.6　Screen of TAC library with primer SC-W37 by the pooled PCR method
Three pooled samples, lane 9 , 15 and 16 , gave positive signals;lane 25 is positive control
(Th.intermedium);M:λ EcoRⅠ +HindⅢ molecular marker
图 7　引物 SC-W37 对 TAC 文库的第二轮筛选结果
与阳性对照 14(中间偃麦草为模板)有相同扩增带的 1 、3 、
11确定为阳性克隆;M:分子量标记(λ EcoRⅠ +HindⅢ)
Fig.7　PCR products of single clones from posit ive pools
amplifiedwith primer SC-W37
Three lanes , 1 ,3 and 11 , gave positive signals;Lane 14 is
positive control(Th.intermedium);M:λ EcoRⅠ +
HindⅢ molecular marker
图 8　PCR-Southern结果
探针为引物 SC-W37从中间偃麦草扩增出的片段 ,
样品顺序同图 7;M:分子量标记(λ EcoRⅠ +HindⅢ)
Fig.8　Result of PCR-Southern hybridized with fragment amplified
with primer SC-W37 in Th.intermedium
The order of samples i s the same as Fig.7;M:λ EcoRⅠ +
HindⅢ molecular marker
图 9　从 TAC 文库中筛选到的阳性克隆
用限制酶 HindⅢ消化的结果
1～ 13:阳性克隆;M:分子量标记(λ EcoRⅠ +HindⅢ)
Fig.9　Positive clones from the TAC library digested
with restriction enzyme HindⅢ
1～ 13:Posi tive clones;M:Molecular marker(λ EcoRⅠ +HindⅢ)
图 10　用中间偃麦草基因组总 DNA作探针与
TAC阳性克隆杂交的结果
1～ 13:阳性克隆;M:分子量标记(λ EcoRⅠ +HindⅢ)
Fig.10　Positive clones hybridized with genomic
DNA of Th.intermedium
1～ 13:Positive clones;M:Molecular marker(λ EcoRⅠ +HindⅢ)
7178期　　　王晓萍等:抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系基因组可转化人工染色体文库的构建及初步筛选
2.4　TAC阳性克隆的酶切分析及 Southern验证
筛选到的阳性克隆经限制酶 Hind Ⅲ消化后电
泳(图 9)、转膜 ,用 α-32P-dCTP 标记的中间偃麦草基
因组总DNA为探针进行Southern杂交 ,结果 12个阳
性克隆中有2个没有杂交信号(图 10中 6和 10),其
余10个阳性克隆有 1 ～ 6条带能与中间偃麦草基因
组总 DNA杂交 ,说明这些克隆的插入片段来源于中
间偃麦草基因组 。
3　讨论
TAC载体的产生标志着新一代大容量可转化载
体的诞生 ,在植物基因工程中有着巨大的发展潜力
和优越性。相对于 YAC 载体而言 ,TAC 载体是环状
质粒 ,独立于染色体之外 ,它的复制不受染色体的影
响 ,不会发生重组交换导致嵌合现象 。TAC 载体具
有大肠杆菌和农杆菌的复制子 ,可以在两者之间穿
梭复制 , 非常稳定。TAC 载体在构建时加入了 T-
DNA的左右边界序列 ,在农杆菌的介导下能直接将
外源 DNA片段转化并整合到植物细胞的染色体上 。
因此在筛选 TAC文库时 ,一旦得到候选基因阳性克
隆 ,不必进行亚克隆 ,可直接转化植物进行功能互补
试验 ,大大加快了试验进程。
普通小麦单倍体基因组的 DNA 含量即 C 值约
为1.6×1010bp ,其中约75%～ 80%的 DNA是由重复
序列组成的。在以杂交为基本原理的基因组文库筛
选方法中 ,由于重复序列的干扰 ,将导致染色体步行
停滞或改变方向 ,从而使采用染色体步行进行图位
克隆小麦基因十分困难。因此 ,我们采用 PCR方法
进行文库的筛选 ,高效 、快速。本研究中所构建的文
库平均插入片段为 22kb ,在理论上可以包含基因的
完整编码序列 、调控序列及侧翼序列等 。
本研究构建的文库包含 2.3×106 克隆 ,约覆盖
普通小麦单倍体基因组 2.5倍 ,在理论上筛选到任
一单拷贝序列的几率约是 95.77%。为了提高这个
概率 ,可以进一步扩大文库的克隆数 ,并增加较大插
入片段克隆的比例。Allouis等[ 10] 构建了 Pennisetum
glaucum 的 BAC 文库 , 用 5 个 STS(sequence-tagged
site)和 6个微卫星标记 ,采用 Pooled PCR的方法筛
选文库 ,每个标记得到 2 ～ 11个阳性池(pool),平均
每个标记得到 5.4个。在本研究中 ,利用与抗病基
因连锁的 SCAR标记筛选文库时 ,在 24个池中扩增
得到3个阳性池。
利用 SCAR标记SC-W37筛选文库时 ,在每个克
隆池或单克隆中的扩增产物不仅有 450bp特异带 ,
还有其他扩增带 ,杂交结果显示有些带是非特异扩
增;当用中间偃麦草基因组总 DNA作探针与酶切后
的阳性克隆杂交时 ,分别得到 1 ～ 6条杂交带;上述
结果说明这些阳性克隆的插入片段来源于易位的中
间偃麦草染色体 7XL ,可以作为克隆易位系 HW642
中来源于中间偃麦草的黄矮病抗性基因候选克隆。
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