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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
铅螯合物人工抗原的制备与鉴定
刘功良 1 王菊芳 2 李志勇 3 梁世中 2
(1仲恺农业工程学院轻工食品学院 ,广州 510225; 2华南理工大学生物科学与工程学院 ,广州 510006;
3广东检验检疫技术中心 ,广州 510623)
　　摘 　要 : 　以双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸 ( ITCBE)螯合铅离子 ,制备得半抗原 Pb2ITCBE,然后再分别与载
体蛋白 KLH或 BSA偶联制备得免疫原 Pb2ITCBE2KLH与包被抗原 Pb2ITCBE2BSA, ITCBE2BSA。用二喹啉甲酸法测 3种抗原
的浓度 ,分析半抗原、抗原与载体蛋白的紫外吸收光谱 ,利用 SDS2PAGE对 3种抗原的分子量进行鉴定 ,用三硝基苯磺酸法检
测 3种抗原中的赖氨酸残基的ε2NH2被半抗原替换的程度 ,用石墨炉原子分光吸收法检测抗原中铅的含量。研究结果表明 ,
免疫原与包被抗原制备成功 , Pb2ITCBE2KLH、Pb2ITCBE2BSA、ITCBE2BSA的浓度依次为 6. 47 ±0. 08 mg/m l, 6. 68 ±0. 06 mg/
m l, 5. 57 ±0. 05 mg/m l;抗原与载体蛋白的紫外吸收光谱的特征各不相同 ; SDS2PAGE的结果显示 3种抗原的分子量均不同于
各自的载体蛋白 ;抗原中载体蛋白ε2氨基的替换程度依次为 1. 86 ±0. 74 %、55. 53 ±1. 13%、54. 19 ±1. 34% ;铅的含量依次
为 15. 64 ±0. 11μg/m l, 17. 33 ±0. 15μg/m l, 0μg/m l。
关键词 : 　铅 双功能螯合剂 抗原 制备 鉴定
Preparation and Identif ication of Artif ic ia l Lead Antigen
L iu Gongliang1 W ang Jufang2 L i Zhiyong3 L iang Shizhong2
(1 College of L ight Industry and Food, Zhongkai University of Agricultural and Engineering, Guangzhou 510225;
2 College of B ioscience and B ioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006;
3 Guangdong Inspection and Quarantine Technical Center, Guangzhou 510623)
　　Abs trac t: 　 In this paper, isothiocyanobenzylethyl enediam ine tetraacetic acid ( ITCBE) was used to chelate lead ion as a bifunc2
tional chelator for p reparing artificial hap ten Pb2ITCBE. The antigens which included immunogen and coating antigen were p repared
through the coup ling the hap ten with carrier p rotein keyhole limpet hemocyanin ( KLH) and bovine serum album in (BSA) , respectively.
The hap ten, antigens and carrier p rotein were scanned with ultraviolet spectrophotometer, the molecular weight of the antigens was veri2
fied with SDS2PAGE, the degree of antigen substitution was quantified using the 2, 4, 62trinitrobenzene sulfonic acid ( TNBS) method,
and the concentration of cadm ium ion in the antigen was quantified with graphite furnace atom ic absorp tion spectrometry ( GFAAS). The
results indicated the antigens were p repared successfully. The ultraviolet absorp tion spectrum of antigens was different with their corre2
sponding carrier p rotein. The results of SDS2PAGE indicated the molecular weight of antigens was different with corresponding carrier
p rotein. The concentration of Pb2ITCBE2KLH, Pb2ITCBE2BSA and ITCBE2BSA was 6. 47 ±0. 08 mg/m l, 6. 68 ±0. 06 mg/m l and 5.
57 ±0. 05 mg/m l. The ratio of cadm ium to carrier p rotein in antigens was 31. 86 ±1. 33% , 55. 53 ±1. 28% and 54. 19 ±1. 69% ,
respectively. The content of lead in the antigens was 15. 64 ±0. 11μg/m l, 17. 33 ±0. 15μg/m l and 0μg/m l, respectively.
Key wo rds: 　Lead B ifunctional chelator Antigen Preparation Identification
收稿日期 : 2009205225
基金项目 :仲恺农业工程学院自然科学基金资助项目 (2009G3091416) ,广东省科技计划项目 (2003C20409) ,国家质检总局科技项目 (2004 IK062)
作者简介 :刘功良 (19802) ,男 ,博士 ,讲师 ,主要从事发酵工程与食品安全检测研究 ; E2mail: gongliangL iu@126. com
通讯作者 :王菊芳 (19732) ,女 ,副教授 ,硕士生导师 ; Tel: 020239380626, E2mail: jufwang@ scut. edu. cn　　铅是一种具有神经毒性的重金属元素 ,进入血液后 ,可引起机体代谢过程的障碍 ,对全身各组织器官都有损害 ,尤以神经系统的损害最为严重 [ 1 ]。研 究表明 ,人体血铅浓度超过每升 30μg时 ,就会出现头晕、头痛、肌肉关节酸痛、全身乏力、失眠多梦、低血红蛋白性贫血、腹胀、腹痛、便秘以及女性月经不
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2009年第 11期 刘功良等 :铅螯合物人工抗原的制备与鉴定
调等多种症状的神经毒性反应 [ 2 ]。随着工业和交
通运输业的日益发展 ,铅及其化合物的生产量和使
用量不断增长 ,主要通过呼吸尘埃以被污染的食物
等途径进入人体内 ,通过食物链和消化道的传递作
用在人体内积累 ,对人类健康构成严重威胁 [ 3 ]。因
此 ,监控食品中的铅含量至关重要。传统的铅离子
检测方法多采用化学仪器检测 ,例如石墨炉原子吸
收光谱法 ( GFAAS)、火焰原子吸收光谱法、氢化物
原子荧光光谱法等 [ 4 ] ,这些方法需要对大量的样品
进行预处理 ,并且检测过程必须在集中大型分析仪
器的室内进行 ,无法用于现场检测 ,具有费用高、处
理量有限、检测时间长等缺陷。重金属免疫学检测
技术具有检测速度快、费用低廉、灵敏度高和选择性
强等优点 ,可用于农产品与环境样品的抽样检测及
进出口通关的快速检验中 [ 5, 6 ]。重金属免疫检测技
术以重金属螯合物特异性单克隆抗体或多克隆抗体
为基础 ,而成功制备重金属螯合物免疫原与包被抗
原是制备抗体的关键 [ 7, 8 ]。
本研究旨在制备并鉴定重金属铅螯合物抗原 ,
为制备抗铅螯合物单克隆抗体或多克隆抗体以及建
立快速检测方法奠定基础。
1　材料与方法
1. 1 材料与试剂
1 mg/m l Pb2 +标准溶液 [ Pb (NO3 ) 2 ] ,购于中国
国家标准物质研究中心 ; 12(42异硫氰酸苄基 ) 2乙二
胺四乙酸 [ 12( 42isothiocyanobenzyl) 2ethylenedia2
m ine2N , N, N′, N′2tetraacetic acid, ITCBE ] ,购于上海
同仁化学研究所 ;羟乙基哌嗪乙磺酸 ( hydroxyethyl
p iperazine ethanesulfonicacid, HEPES) ,牛血清白蛋
白 ( bovine serum album in, BSA ) ,钥孔戚血蓝素 ( key2
hole limpet hemocyanin, KLH ) 均为 Sigma 产品 ;
BCATM蛋白质检测试剂盒 , 2, 4, 62三硝基苯磺酸 ( 2,
4, 62trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)均购于 Pierce
公司 ; Centricon230超滤离心管购于 M illipore公司 ,
其他试剂均为分析纯。
1. 2 仪器设备
CR22G高速冷冻离心机 ,日立 (上海 )仪器有限
公司 ; 5810高速冷冻离心机 ,德国 Eppendorf公司 ;
赛多利斯 A rium 611UF实验室超纯水器 ,赛多利斯
科学仪器 (北京 )有限公司 ; UV22102 PC型分光光度
计 , Unico (上海 )仪器有限公司 ;北京六一 DYY228C
型电泳仪 , DYCZ224DN型小号双垂直电泳槽 , JC303
型电热隔水式恒温培养箱 ,上海嘉程仪器设备厂 ;
DELTA 320pH计 ,梅特勒 2托利多仪器 (上海 )有限
公司 ; C24KC恒温摇床 ,美国 New B runswich Scien2
tific公司。
1. 3 抗原的合成
1. 3. 1　抗原 Pb2ITCBE2KLH与 Pb2ITCBE2BSA的制
备 　将 KLH、BSA溶于 pH7. 4, 0. 1 mol/L的 PBS;将
ITCBE溶于 0. 1 mol/L, pH9. 5的 PBS;取一定量的
ITCBE添加至含有相同摩尔数铅离子的溶液中 ,调节
pH至 7. 4。在 25°C下 , 100 r/min震荡反应 24 h,制备
得半抗原 Pb2ITCBE母液。将半抗原与载体蛋白 KLH
(BSA)等质量混合 ,调节 pH至 9. 0。在 25°C下 , 100 r/
min震荡反应 24 h,制备得 Pb2ITCBE2KLH 与 Pb2
ITCBE2BSA。偶联反应后 ,用 Centeicon230超滤离心
管对蛋白质偶联物进行分离纯化。使用前 , 用
100 mmol/L EDTA 和 pH7. 4的 HEPES对 Centeico
n230超滤离心管分别冲洗 3次 [ 9, 10 ]。
1. 3. 2 无铅抗原 ITCBE2BSA的制备 用超纯水代
替铅离子标准溶液 ,制备无金属抗原 ITCBE2BSA ,其
反应步骤同 1. 3. 1。
1. 4 抗原的鉴定
1. 4. 1 抗原的浓度测定 以 BSA和 KLH作为标
准蛋白 ,用 BCA法构建浓度检测标准曲线 [ 11 ]。BSA
浓度标准曲线的线性方程 : y = 0. 0014x + 0. 0224,线
性相关系数 R2 = 99. 59% ; KLH浓度标准曲线的线
性方程 : y = 0. 0012x + 0. 0198, R2 = 0. 9967,其中 y
为样品在波长为 562 nm处吸光度 , x为样品蛋白浓
度 (μg/m l)。
1. 4. 2 半抗原、抗原与载体蛋白的紫外光谱 以
011 mol /L, pH7. 4 HEPES作空白 ,取 50μl BSA及其
相应的抗原 ,用 HEPES稀释至 1 mg/m l;取 25 μl
KLH及其相应的抗原 ,用 HEPES稀释至 0. 5 mg/m l;
取 20μl半抗原 ,用 HEPES稀释至 0. 15 mg/m l。在波
长 230～320 nm范围内进行紫外扫描 [ 12 ]。
1. 4. 3 抗原 SDS2PAGE电泳 用 5%浓缩胶 , 8%
分离胶 ,点样量 2 μg/孔 ,对 BSA、ITCBE2BSA、Pb2
ITCBE2BSA进行垂直 SDS2PAGE电泳。用 3%浓缩
胶 , 5%分离胶 ,点样量 4μg/孔 ,对 KLH、Pb2ITCBE2
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KLH进行垂直 SDS2PAGE电泳。
1. 4. 4 抗原中 ε2氨基的替换程度 以 BSA 和
KLH作为标准蛋白 ,用 TNBS法构建蛋白质赖氨酸
残基的ε2氨基含量的标准曲线 [ 13 ]。BSA中赖氨酸
残基的ε2氨基含量的标准曲线的线性方程为 : y =
0. 0025x + 0. 009,线性相关系数 R2 = 0. 9989; KLH
中赖氨酸残基的ε2氨基含量的标准曲线的线性方
程为 y = 0. 001x + 0. 009, R2 = 0. 9922。其中 y为
样品在波长为 335 nm处的吸光度 , x为样品蛋白浓
度 (μg/m l)。将抗原及相应的载体蛋白稀释 ,用
TNBS法测定样品在波长为 335 nm处的吸光值 ,计
算公式如下 :
ε2氨基的替换程度 ( % ) =A1 2A2
A1
×100%
式中 , A1为载体蛋白在浓度为 C时经 TNBS法
测出的 A335 , A2为免疫原或包被抗原在浓度为 C时
经 TNBS法测出的 A335。
1. 4. 5 抗原中铅的含量 以 0. 1 mol /L , pH7. 4
HEPES做空白 ,将离心纯化后的抗原用 0. 1 mol /L,
pH 7. 4 HEPES稀释 100倍 ,参照国标 GB /T 5009. 12 -
2003,用石墨炉原子吸收光谱法检测抗原中铅的
浓度 [ 14 ]。
2 结果与讨论
2. 1　抗原的浓度
利用 BCA 法检测分离纯化后的 Pb2ITCBE2
KLH、Pb2ITCBE2BSA、ITCBE2BSA 中蛋白的浓度依
次为 6147 ±0. 08 mg/ml, 6. 68 ±0. 06 mg/ml, 5. 57 ±
0. 05 mg/ml。　
2. 2 免疫原与包被抗原的紫外吸收光谱分析
如图 1所示 , BSA在波长 235、278 nm处各有
一个吸收峰 ;半抗原 Pb2ITCBE在波长 260、272 nm
处有最大吸光值 ,在 240～285 nm 之间的吸光值
均在 2. 0以上 ,属于高吸光值的区域 ;与载体蛋白
和半抗原相比 , Pb2ITCBE2BSA最大吸收波长飘移
至 250 nm , ITCBE2BSA 的最大吸收波长漂移至
247 nm,两种抗原的紫外吸收曲线在 240～285 nm
之间均属于高吸光值的区域 ,并且与 BSA紫外吸收
曲线在 240～285 nm之间完全没有重叠之处。抗原
Pb2ITCBE2BSA、ITCBE2BSA紫外吸收光谱的特征既
具有载体蛋白 BSA的特征 ,还具有半抗原 Pb2ITCBE
的特征 ,这初步证明了抗原 Pb2ITCBE2BSA、ITCBE2
BSA制备成功。
图 1　BSA、Pb2ITCBE、Pb2ITCBE2BSA与
ITCBE2BSA的紫外吸收特征图
如图 2所示 , KLH在 234、279 nm各有一个吸收
峰 ;半抗原 Pb2ITCBE在 260、272 nm有最大吸光值 ,
在 240～285 nm之间的吸光值均在 2. 0以上 ,属于
高吸光值的区域 ; Pb2ITCBE2KLH的最大吸收峰为
234、274 nm,在最大吸收峰的吸光值比 KLH要高 ,
并且在 240～285 nm之间属于高吸光值的区域 ,具
有半抗原 Pb2ITCBE的紫外吸收特征。免疫原 Pb2
ITCBE2KLH紫外扫描的特征既具有载体蛋白 KLH
的特征 ,还具有半抗原 Pb2ITCBE的特征 ,这证明
了免疫原 Pb2ITCBE2KLH制备成功。但 KLH的分
子量远远超过 BSA ,其分子结构也远比 BSA复杂 ,
所以 ,以半抗原 Pb2ITCBE与等质量的载体蛋白制
备的抗原 Pb2ITCBE2KLH 和 Pb2ITCBE2BSA ,前者
携带半抗原 Pb2ITCBE的紫外吸收特征不如后者
的明显。
图 2　KL H、Pb2ITCBE与 Pb2ITCBE2KL H的
紫外吸收特征图
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2009年第 11期 刘功良等 :铅螯合物人工抗原的制备与鉴定
由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸
和色氨酸 ,因此蛋白质通常在 280 nm处具有紫外
吸收高峰。将小分子化合物交联至蛋白质后 ,半
抗原 2蛋白质复合物与载体蛋白的紫外吸收光谱不
会相同 ,吸收峰和最大吸光值均发生改变。 ITCBE
是的 EDTA衍生物 ,带有苯环和异硫氰酸 (含共轭
双键 ) ,紫外吸收特征非常明显。本研究在制备免
疫原与包被抗原的过程中 ,半抗原与载体蛋白的
质量比是 1∶1 ,确保将半抗原分子尽可能多地替
代载体蛋白表面赖氨酸残基 ε2氨基 ,同时用截留
分子量为 30 kD 的 centricon230超滤离心管进行
纯化 , 将混合溶液中可能存在的游离的 Pb、
ITCB E、Pb2ITCB E以及一些缓冲液成分 ,截留下
来的就是半抗原 2蛋白质复合物。在进行紫外光
谱扫描分析时候 ,可以排除游离的半抗原 Pb2
ITCB E、ITCB E等带有强烈紫外吸收特征的物质
的干扰。
2. 3 抗原的 SDS2PAGE电泳
半抗原 Pb2ITCBE的分子量为 01646 kD ,螯
合剂 ITCB E的分子量为 0. 439 kD , B SA 的分子
量为约 67 kD ,铅螯合物 (螯合剂 )通过异硫氰酸
苄基交联至 B SA 上形成 Pb2ITCB E2B SA ( ITCB E2
B SA ) 。如图 3 所示 , Pb2ITCB E2B SA、ITCB E2B SA
的电泳速度均比 B SA 要慢 ,并且 Pb2ITCB E2B SA
的电泳速度比 ITCB E2B SA慢 ,表明两种包被抗原
的分子量均高于 B SA , Pb2ITCB E2B SA 的分子量
高于 ITCB E2B SA。这从另外一个角度证明 Pb2
ITCB E或 ITCB E已经成功交联至 B SA ,包被抗原
制备成功。
M. 高分子量标准蛋白 ; 1, 2. Pb2ITCBE2BSA;
3, 4. ITCBE2BSA; 5, 6. BSA
图 3　BSA及包被抗原的 SD S2PAGE
KLH 由多个亚基组成 ,其分子量在 8. 00 ×
104 ～1. 20 ×105 kD之间 ,而标准蛋白的最大分子量
为 200 kD ,如若采用 SDS2PAGE的常规步骤 , KLH
及 Pb2ITCBE2KLH在分离胶中移动缓慢 ,甚至有可
能积压在浓缩胶与分离胶的边界线。本试验采用
3%浓缩胶 , 5%分离胶 ,试验中使用还原 SDS2PAGE,
同时通过延长电泳时间 ,在标准蛋白所含的溴酚蓝
跑出分离胶以外再加跑 1 h。如图 4所示 , KLH的
电泳图有 3条带 ,显示 KLH 的亚基种类不低于 3
种 ,而 Pb2ITCBE2KLH中的电泳图只显示出 1条带 ,
这说明了与载体蛋白相比 ,交联后的蛋白质的分子
量发生了变化。在 2. 1, 2. 2, 2. 3研究结果的基础
上 ,这也说明了 Pb2ITCBE2KLH制备成功。
M. 高分子量标准蛋白 ; 1, 2. KLH; 3, 4. Pb2ITCBE2KLH
图 4　KL H及免疫原的 SD S2PAGE
2. 4 TNBS法检测抗原中载体蛋白赖氨酸ε2氨基
的替换程度
如图 5所示 ,半抗原 Pb2ITCBE是通过异硫氰酸苯
基与载体蛋白的ε2氨基反应 ,因此 ,可用偶联前后载体
蛋白中ε2氨基的替换程度间接表示偶联率。利用 TN2
BSA 法检测 Pb2ITCBE2KLH, Pb2ITCBE2BSA, ITCBE2
BSA中赖氨酸残基的ε2NH2被半抗原替换的程度依次
为 31. 86 ±0. 74 %、55. 53 ±1. 13%、54. 19 ±
1134%。与 Khosraviani等 [ 11 ]的结果相比 ,本试验
制备的 Pb2ITCBE2KLH , Pb2ITCBE2BSA 与 ITCBE2
BSA中赖氨酸残基的 ε2NH2被半抗原替换的程度
均要高。这是由于在制备过程中 ,半抗原与载体
蛋白按照 1∶1的质量比混合反应 ,确保载体蛋白
交联足够多的半抗原 ,使得免疫原 Pb2ITBCE2KLH
中有数量众多的表位去刺激小鼠产生目标抗体。
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图 5　铅抗原制备示意图
抗原 Pb2ITCBE2KLH中载体蛋白 KLH分子量较
大 ,且结构要比 BSA复杂得多 ,有些ε2氨基由于空间
阻碍无法与异硫氰酸苯基反应 ,因此ε2氨基的替换程
度比 Pb2ITCBE2BSA的低。免疫原 Pb2ITCBE2KLH中
ε2氨基的替换程度比 Pb2ITCBE2BSA的低 ,从而使得
Pb2ITCBE2KLH所具有的半抗原的紫外吸收特征不如
Pb2ITCBE2BSA,这与图 1中紫外吸收光谱鉴定的结
果一致。这也证明了免疫原与抗原制备成功。
2. 5 石墨炉原子吸收光谱法检测抗原中铅的含量
半抗原 Pb2ITCBE是以 ITCBE螯合等摩尔的铅
离子制备而成 ,并且每个 ITCBE分子只能螯合 1个
铅离子 ,制备得到的半抗原再与载体蛋白交联形成
抗原 ,这排除了游离的铅离子被载体蛋白上巯基结
合的可能性。经过超滤离心后 ,免疫原与包被抗原
溶液中不存在游离的铅离子 ,只有被螯合剂 ITCBE
螯合的铅 ,经 GFAAS检测得知免疫原与包被抗原中
均存在铅。通过石墨炉原子吸收光谱法检测 Pb2
ITCBE2KLH、Pb2ITCBE2BSA , ITCBE2BSA, HEPES中
的铅含量依次为 15. 64 ± 0. 11 μg/m l, 17. 33 ±
0. 15μg/m l, 0μg/m l, 0μg/m l。说明半抗原确实偶
联到蛋白质上 ,因此 ,该结果进一步证明免疫原与包
被抗原制备成功。
3 讨论
重金属铅免疫检测技术的关键在于抗铅螯合物
单克隆抗体或多克隆抗体的制备 ,而两种抗体制备
的关键又在于铅免疫原与包被抗原的制备 [ 15 ]。铅
与动物体内生物分子可发生强烈的不可逆的反应 ,
导致动物中毒 ,因此 ,可利用特异性的双功能螯合剂
ITCBE螯合铅 ,形成能被动物免疫系统识别的螯合
物 ,但这些重金属螯合物复合物是分子量低于 1 kD
的半抗原 ,免疫原性低 ,不足以引起免疫反应 ,因此 ,
需要将其交联至免疫原性好的载体蛋白。 ITCBE除
了能以 4个羧基螯合铅离子形成螯合物之外 ,还能
通过异硫氰酸苄基与载体蛋白表面的氨基偶联 ,形
成铅的免疫原和包被抗原 [ 16 ]。
制备了重金属免疫原与包被抗原后 ,应该进行
鉴定之后再免疫小鼠。本研究先扫描抗原及相应载
体蛋白的紫外光谱和 SDS2PAGE电泳 ,定性分析抗
原合成是否成功 ,再用 TNBS法检测载体蛋白被半
抗原修饰的程度 ,最后利用石墨炉原子吸收光谱法
检测抗原中的铅的含量 ,通过这一系列的方法对抗
原进行鉴定 ,证实免疫原与包被抗原制备成功 ,为下
一步的抗铅螯合物单克隆抗体的制备或多克隆抗体
的制备奠定了基础。
参 考 文 献
1　 A rora M, et al. Sci Total Environ, 2006, 371: 55～62.
2　 Lurie D I, et al. NeuroToxicology, 2006, 27: 108～117.
3　 M ishra KP, et al. Toxicology, 2003, 188: 251～259.
4　 Johnson DK, et al. Environ Sci Technol, 2002, 36: 1042～1047.
5　 B lake DA, et al. Anal Chim Acta, 1998, 376: 13～19.
6　 B lake DA, et al. B iosens B ioelectron, 2001, 16: 799～809.
7　 Delehanty JB, et al. B iochem istry2US, 2003, 42: 14173～14183.
8　 Jones RM, et al. B ioconjugate Chem, 2002, 13: 408～415.
9　 B lake II RC, et al. B iochem istry2US, 2003, 42: 497～508.
10　BugsMR, et al. B iochem B iophys Res Commun, 2007, 353: 889～
894. 　
11　KhosravianiM, et al. B ioconjugate Chem, 2000, 11: 267～277.
12　刘功良 ,王菊芳 ,李志勇 ,等. 华南理工大学学报 (自然科学版 ) ,
2008, 36 (12) : 133～137.
13　Cayot P, Tainturier G. Anal Chem, 1997, 249: 184～200.
14　中华人民共和国卫生部与中国国家标准化管理委员会 ,北京 :中
国标准出版社 , GB /T5009. 1522003,食品中铅的测定 [ S].
15　刘功良 ,等. 生物工程学报 , 2006, 22 (6) : 877～881.
16　Zhu XX, et al. J Agric Food Chem, 2007, 55: 7648～7653.
261
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net