全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
GAPDH基因克隆及其作为毕赤酵母内标物的可靠性研究
张儒1 张变玲2 谢涛 1 李谷才 1 唐勇军 1 蒋开军 1
( 1湖南工程学院化学化工学院,湘潭 411104; 2第四军医大学唐都医院疼痛生物医学研究所,西安 710038)
摘 要: 为了测定 GAPDH在巴斯德毕赤酵母中作为内参蛋白的有效性, 利用 PCR鉴定巴斯德毕赤酵母中 GAPDH基
因, 分别在含葡萄糖、甲醇、甘油培养基及不同温度下培养巴斯德毕赤酵母, 采用 SDS-PAGE、W estern b lotting和催化活性检测。
测序结果与已报道的巴斯德毕赤酵母 GAPDH基因完全一致。 SDS-PAGE结果显示, 表达蛋白分子量为 35. 4 kD,与预期分子
量相符。W estern blotting和催化活性测定显示,在葡萄糖诱导下 GAPDH表达最高 ,甲醇次之, 甘油最低。37 下 GAPDH表达
略高于 28 。在同一诱导物或温度下, GAPDH表达不会随浓度或培养时间发生明显变化。结果表明, 在同一种诱导方式下,
GAPDH可以作为异源蛋白表达的内参对照。
关键词: GAPDH 巴斯德毕赤酵母 内参对照 W estern blotting
Cloning ofGAPDH Gene ofP ichia pastoris and Its
Reliability as Internal Control
ZhangRu
1 Zhang B ianling2 X ie T ao1 L iGuca i1 TangYongjun1 J iang Kaijun1
(
1
College of Chem istry and Chem ical Eng ineering, H unan Institute of Engineering, X iang tan 411104;
2
Institute forFunctionalB rain D isorders, TangduH osp ital, Fourth M ilitary M ed ical University, X i an 710038)
Abstrac:t It was to determ ine the va lidity of GAPDH as an interna l pro te in for assessm en t inP. pastoris. TheGAPDH gene from
P. pas tor is GS115 was identified by PCR. Express ion o fGAPDH gene in g lucose, m ethano,l g lycero-l grow n ce lls a t d ifferen t tem pera-
tu re, w as identified by SDS-PAGE, W estern blotting and me tabo lic activ ity. The sequence ana lysis showed that the hom o logy of the
GAPDH gene w ith prev iously reported P. pastoris w as 100% . The SDS-PAGE ana lysis revealed the pro tein w ith am o lecularw e ight of
35. 4 kD, and theW estern blotting and m etabo lic activity analysis demonstra ted that the expression leve l of GAPDH in g lucose w as the
h ighest, and g lycero-l grow n cells was the lowest. Expression leve l a t 37 w as sligh tly h igher than that a t 28 . R esu lts show ed that
the expression leve l of GAPDH w as constant under the d iffe rent cond itions, respective ly. Therefore, w e concluded tha t GAPDH w as
suitable to be used as contro l o f he tero logous prote ins expression at the sam e cu lture w ay.
Key words: G lyce ra ldehyde-3-pho sphatedehydrogenase P. pastoris In ternal control W estern blotting
收稿日期: 2010-09-25
基金项目:湖南省自然科学基金项目 ( 07JJ6031 )
作者简介:张儒,男,博士研究生,讲师,研究方向:基因工程药物; E-m ai:l zhangru2002@ 126. com
通讯作者:张变玲,女,研究方向:基因工程与细胞工程药物研究与应用; E-m ai:l blzhang369@ 163. com
巴斯德毕赤酵母 (P. pastoris )具有外源蛋白表
达量高、分泌性好、表达产物活性强和外源基因遗传
稳定等优点 [ 1, 2] ,在研究外源基因表达机制、生产药
用蛋白等方面有着广泛的应用。检测外源基因表达
产物是否正确和具有活性, 或者比较表达产物量的
相对变化, 常用W estern b lo tting进行检测。在研究
中,由于试验材料处理和试验过程存在误差,特别是
表达量不高时, 就很可能严重影响结果的分析。因
此, 需要一个可靠的分子内标,以标准化各样品和处
理步骤,使各样品具有良好的可比性。甘油醛-3-磷
酸脱氢酶 ( g lyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen-
ase, GAPDH )是糖酵解反应中的一个酶, 几乎在所
有组织或者细胞中都能高水平表达, 一般认为在同
种细胞或者组织中的蛋白质表达量是恒定的, 故被
广泛用作动植物等组织中 Northern b lo tting, W estern
b lo tt ing等试验操作的标准化内参,而在巴斯德毕赤
2011年第 2期 张儒等: GAPDH基因克隆及其作为毕赤酵母内标物的可靠性研究
酵母中少有应用。有文献 [ 3 ]报道, 巴斯德毕赤酵母
中存在 GAPDH基因后, 从中分离出 GAPDH 基因
启动子以组成型表达多种基因, 但很少直接利用
GAPDH作为内参蛋白。近年来, 一些研究表明,
持家基因的表达水平并不稳定, 它受自身启动子
或其他调控因子的影响 [ 4]。本研究从巴斯德毕赤
酵母中克隆 GAPDH基因, 研究其在不同条件下表
达的稳定性, 期望找到巴斯德毕赤酵母又一重要
的内参蛋白。
1 材料与方法
1. 1 材料
毕赤酵母菌株 GS115、DH5为本实验室保存,
重组酵母菌株 GS115 /pPIC3. 5k-ADPN、pGEM-T为
西北大学惠赠。NAD、GAPDH购自中国医药集团上
海化学试剂公司; Taq聚合酶、T4 DNA连接酶、限制
性内切酶、dNTP均购自 TaK aRa公司; 凝胶回收试
剂盒购自北京三博远志生物技术有限公司; 人脂联
素单克隆抗体 (鼠抗 )购自 ALEX IS公司; GAPDH抗
体 (兔抗 )购自北京博奥森生物技术有限公司; 羊抗
鼠、羊抗兔单克隆抗体 IgG (二抗 )及W estern化学发
光底物均购自 Pierce公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 GAPDH基因克隆和序列分析 根据 NCBI
上登录号为 U62648的酵母 GAPDH基因设计引物
扩增编码 GAPDH基因序列。上游引物 P1和下游
引物 P2如下: P1: 5-ATGGCTATCACTGTCGGTAT-
3, P2: 5-TTAAGCCTTAGCAACGTGTT-3。
取巴斯德毕赤酵母菌液, 采用文献方法 [ 5]提
取酵母基因组 DNA, 扩增反应程序: 94 预变性 5
m in; 94 40 s, 54 40 s, 72 1 m in, 30个循环;
72 延伸 10 m in。再将产物连接到 pGEM-T载体
上,并转化大肠杆菌 DH5。 PCR及双酶切初步鉴
定正确后,将含重组质粒 pGEM-T-GAP的阳性菌株
送上海奥科生物公司进行测序。测序结果进入 NC-
B I用 B lastn程序比对。
1. 2. 2 不同甲醇、甘油、葡萄糖浓度和温度诱导酵
母表达 取重组酵母菌株 GS115 /pPIC3. 5k-ADPN
分别接种于 25 mL BMGY, BMMY, YPD培养基中,
30 250 r/m in培养 30 h左右,至其 OD600约为 2. 0,
5 000 r /m in离心 8 m in, 收集菌体后分别重悬于 40
mL BMGY( 1%甘油 ), BMMY ( 1%甲醇 ) , YPD ( 2%
葡萄糖 )培养基中。 28 , 250 r/m in培养,期间每隔
24 h分别补加 1%甘油, 1%甲醇和 2%葡萄糖。第
一次加甲醇的时间点记为 0 h,菌体取样时间点分别
为 6、12、24、36、48、60 h。同上述方法,以 YPD培养
基分别在 28 和 37 无诱导培养。
1. 2. 3 SDS-PAGE和W estern blotting检测 上述
处理的菌液采用文献方法 [ 5]提取总蛋白, 蛋白经
SDS-PAGE电泳分离后, 通过半干式电转仪将蛋白
转移至硝酸纤维素膜上, 将膜短暂漂洗后在含 5%
脱脂奶粉的 TBST缓冲液中室温封闭膜 2 h,人脂联
素及 GAPDH 混合一抗 4 过夜孵育, 含 0. 05%
Tween-20的 PBS室温洗膜 10 m in, 重复洗膜 3次,
混合二抗室温孵育膜 2 h, TBS缓冲液洗膜 10 m in,
重复 3次。最后在酶联生色底物中孵育 3 m in后 X
胶片曝光。
1. 2. 4 GAPDH的活性检测 取提取的总蛋白液,
空白对照和 49 mg /mL GAPDH各 10 L,分别加入
100 L 10 mmo l/L NAD溶液, 再加入缓冲液 ( 40
mmo l/L三乙醇胺, 50 mmol /L N a2HPO4, 5 mmo l/L
EDTA, 0. 1mmol /L DTT, pH8. 6)至 1mL。 28 温浴
20m in,离心, 取上清, 340 nm测定产生的 NADH的
吸光度值。GAPDH的活性用每毫克干重蛋白提取
液所产生的 NADH的浓度 (mmo l/L )表示 [ 6, 7]。
2 结果与分析
2. 1 GAPDH基因的扩增与序列分析
根据 NCB I中登录号为 U62648. 1的 GAPDH基
因序列设计引物,经 PCR引物扩增, 得到了 GAPDH
基因片段。酵母基因组 DNA电泳结果如图 1所示,
图 2为 PCR结果。从图 2可以看出,扩增出大小为
1 000 bp左右的片段, 和巴斯德毕赤酵母 GAPDH基
因理论大小 1 002 bp大小一致,由此可以初步确定
扩增到 GAPDH 基因。将克隆的 DNA片段连接至
pGEM-T载体后送上海奥科生物公司测序, 测序结
果和 NCB I上登录号为 U62648. 1的巴斯德毕赤酵
母 GAPDH基因序列比对, 结果表明, 克隆的人脂联
素基因和该序列完全一致, 同源性达 100%。表明
克隆得到的巴斯德毕赤酵母 GAPDH基因序列完全
正确,通过分析比较发现基因序列和其他生物的序
列结构非常相似。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
1- 4.酵母基因组 DNA; M. DNA M arker
图 1 巴斯德毕赤酵母基因组 DNA电泳结果
1- 4.酵母 GAPDH 基因 PCR扩增产物; M. DNA M arker
图 2 GAPDH基因 PCR扩增
2. 2 甲醇诱导表达和W estern杂交鉴定
重组酵母菌株 GS115 /pPIC3. 5k-ADPN经甲醇
在不同诱导时间诱导结果 (图 3-A )显示, 表达的
GAPDH分子量大小为 35. 4 kD, 和理论大小一致;
诱导后以 GAPDH作内参 Western杂交结果 (图 3-
B )显示,脂联素蛋白表达受甲醇诱导而发生规律性
变化,其中甲醇诱导 48 h时, 人脂联素表达量最高,
而 GAPDH的表达没有受到甲醇诱导的影响。
2. 3 葡萄糖、甲醇和甘油浓度对 GAPDH 表达的
影响
将 P. pastoris(GS115)经葡萄糖、甲醇和甘油在
不同的时间诱导,经 SDS-PAGE电泳后进行W estern
blotting分析,结果如图 4-A;利用 A lpha Innotech公
司的 A lphaE aseFC软件测定杂交条带的 OD值, 结
果表明,经葡萄糖诱导后 GAPDH表达量最高, 甲醇
次之, 甘油诱导表达最少。其中甲醇诱导表达量是
葡萄糖诱导表达量的 2 /3左右, 甘油诱导表达量是
葡萄糖诱导量的 1 /3左右。对提取蛋白进行相对活
性测定,由结果 (图 4-B)可以看出,经不同物质诱导
后 GAPDH 的活性和 W estern b lott ing结果基本一
致, 对于同一种物质对不同时期的 P. pastoris表达
GAPDH没有明显的影响, 但不同的诱导物对 GAP-
DH表达量有较大的影响。
M.蛋白 M ark er; 1 - 6.甲醇诱导 6, 12, 24, 36, 48, 60 h;脂联
素 (ADPN)为参照
图 3 甲醇诱导表达蛋白 SDS-PAGE(A)和
W estern杂交 ( B )鉴定结果
2. 4 温度对酵母生长和 GAPDH表达的影响
以 YPD培养基分别在 28 和 37 无诱导培
养, 并测定培养 96 h内的生长曲线和 GAPDH的活
性。结果 (图 5-A)显示,在无诱导的条件下 24 h左
右菌体迅速生长, 48 h后菌体生产速度趋于稳定,
和巴斯德毕赤酵母的生长规律基本一致, 37 下酵
母菌略比 28 下生长迅速。而 GAPDH的活性在酵
母菌开始培养时活性就达到 33 mo l/L, 12 h开始
急剧增加, 24 h时达到最大值 53 mol/L, 随后活性
有所下降, 并且保持相对平稳 (图 5-B )。同样, 在
37 条件下 GAPDH的活性略高于 28 的活性。
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2011年第 2期 张儒等: GAPDH基因克隆及其作为毕赤酵母内标物的可靠性研究
a, b, c分别为葡萄糖、甲醇和甘油
图 4 葡萄糖、甲醇和甘油诱导 GAPDH
表达 (A)及活性测定 ( B)
图 5 28 和 37 P. pastoris生长曲线
( A)和 GAPDH活性 ( B)
3 讨论
巴斯德毕赤酵母是表达外源基因的良好宿主细
胞,基因表达后常常需要一些持家基因的表达产物
作为内参对照进行鉴定。 -actin在多种生物中也
可作为内参对照, -actin是否能够作为一个稳定可
靠的内标物少有报道。C regg等 [ 3]已经从巴斯德毕
赤酵母中鉴定出 GAPDH 基因, 并且该基因含有组
成型的启动子 pGAP,并且将其分离出来,用于多种
基因的表达 [ 8]。但随后对于用 GAPDH作为内参对
照的研究比较少见,本研究旨在进一步鉴定巴斯德
毕赤酵母中 GAPDH 基因, 同时以含有甲醇诱导型
的启动子的脂联素基因表达产物作为对照, 用以分
析 GAPDH 在不同的诱导条件下表达是否发生变
化, 从而证实 GAPDH 作为内参蛋白的可靠性。结
果表明,巴斯德毕赤酵母中含有和 C regg等 [ 3]报道
一致的基因,表达出和理论大小一致的蛋白,初步说
明 GAPDH具有较高的稳定性, 有作为内参蛋白的
潜力。同时在用甲醇诱导脂联素蛋白表达时, 采用
SDS-PAGE和 W estern b lotting检测证实 GAPDH 基
因表达保持较好的稳定性。
近年来一些研究表明 [ 4, 9] , -actin和 GAPDH等
内参蛋白在表达时有时也会受不同的培养条件、生
理状态和环境调控而出现表达差异, Gozalbo等 [ 10]
发现饥饿和温度对 GAPDH 的表达有明显的影响,
因为饥饿和温度可能影响 GAPDH蛋白进入细胞壁
以抵抗不利环境。本研究结果亦表明, 温度对 GAP-
DH的表达有轻微的影响,初步推断当温度提高时,
GAPDH蛋白因进入细胞壁使其总 GAPDH 在细胞
中得以积累,从而使其表达量和活性有所提高。另
外, 可能是由于 GAP启动子的原因, 不同的生长环
境可以在一定程度上控制基因的表达, C regg等 [ 3]
发现葡萄糖、甘油和甲醇对一些基因的转录有较大
的影响。本研究发现,这 3种底物对巴斯德毕赤酵
母内源性的 GAPDH 表达也有类似作用, 但是同一
种培养物的浓度变化对 GAPDH的表达没有显著的
影响,因而可以利用 GAPDH作为内参蛋白。
本研究对巴斯德毕赤酵母的 GAPDH 基因进行
克隆和分析,首次对 GAPDH作为其内参蛋白的稳
定性进行研究,为毕赤酵母利用其做内参蛋白提供
可靠的数据。
参 考 文 献
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