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瓜he r o R o ea rc h nsI it u te , 嫌 i , 、 助 a de m歹 of 肠 he 即 cs 泌~ , hS a 刀召去a i Z以洲期 ) , hC ina )
A b s t r a c t : S e er e n in g o f a e D N A li b r脚 for m OP 甲 h歹ar ,℃。 汉子n s i s w i th Por b e b a s e d u Po n kn o w n g l y c e ar d e h y d e 一 3 -
p h o s p h aet d
e h y d or g e n a s e ( G PA D H ) g
e n e s ide n ti if e d a fu l l
一
le n g th c l o n e a p Paer
n t l y e n e o d i n g e h l o or Pl a s t
g l y c e ar d e h y d已 3一 p h o s p h at e d e h y d or g e n a s e ( G a p A )
.
C l o n e G A 4P
e o n ta i n s ht e e o m p l e te c h lo or Pl a s t
一
GPA D H
e D N A o f P
.
;〕℃名。 e n s i s , c o er s Po n d in g t o a 72 am in o
一
ac i d tanr
s i t pe P ti d e a n d a 3 3 8 am i
n o 一 ac i d m aut er Por et i
n
.
M u lt i Pl e a l ig n m e n t o f th e P er d i c te d m aut er
c h l o or Pl a s t
一
G A P D H s u b u n i t a t a m in o
一
ac i d l e v e l c l e ar ly s h o w s t h a t fo u r
h i g h ly e o n s e vr e d er g io n s in G A P D H a er P er se n t in o u r e D N A e lo n e
.
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e G C c o n te n t s o f ht e e n t i er er g i o n o f t h e
G叩 A e D N A ( 64 . 2 % ) w e er s im il ar t o th e a v e ar g e G C e o n et n t ( 6 5 . 2 % ) w h i e h w a s o b ta i n e d b y oP , hxar E S T
a n a ly s i s
.
T h e Po s i t i o n o f er d a lg ae i n Ph y lo g e n e ti e t er e s i n fe er d for m G A P D H
s e q u e n e e s w a s d i s e u s s e d
.
S e q u e n e e s o f e h l o or Pl a s t
一
G A P D H e D N A h va e be e n d e Po s i te d i n eG
n B an k u n d e r ac e e s s i o n n u m b e r A 2Y 73 8 19
.
K e y wo
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:
oP 甲h了 ar ” 勿 e n s i s ; g ly e e adr e h y d e
一
3
一
ph o s p h a te d e h yd or g e n a s e ( G A p D H ) : c D N A c lo n i n g ;
Ph y lo g e n y
1 I n t r o d u c t i o n
hT
e er d a lg a l g e n u s oP , h ,
T“ i n e lu d e s s e v e r a l e e o n o m ie a l ly v a lu ab l e s Pe e ie s
,
w h ie h fo mr t h
e m o s t v a lu ab l e
In a ir n e Pl an t c or P i n t h e w o r ld
.
P a rt ly d u e t o th e e o m m e cr i a l in et er s t
, a g er a t d e al o f er s e acr h h
a s b e e n fo e u s e d
o n ht e li fe h is to 叮 , e e o lo g y , p h y s io l o g y , an d b i o e h e m i s t叮 o f oP 甲h ar ( S ti ll e r & W a al an d
,
19 3 )
.
N e v e rt h e l e s s
,
t h e m o l e e u la r g e n e ti e s t u d ie s o f oP 甲 h俐 , s u e h a s i d e n ti if c at i o n o f g e n e s er s P o n d i n g to
P h y s i o lo g ie a l v iar
a t io n
,
d e v e lo Pm e n t o f n e w s Pe e ie s u s i n g er e o m b i n an t b i o et e h n o l o g y an d g e n e ti c c la s s i if e a t io n
,
h a v e n o t b e e n ac h i e v e d s u e e e s s fu l ly
.
E v e n t h o u g h e h lo or P la s t i c g e n e s an d a fe w fu n e ti o n a l g e n e s h a v e be e n
i d e n t i if e d
,
g er at P a rt s o f oP 甲h了ar g e n e s h a v e n o t b e e n c hacr
t e ir z e d ( eL
e 。 t a l
. ,
2 00() )
.
I n fac t
,
l e s s t h a n 50
g e n e s o f ()P 切h下ar y e z o e n s i s w e er e u er n t ly er Po rt e d i n th e eG n b an k d a t a b a s e
.
I n o dr e r ot o b t a i n m o er g e n e ti e
i n fo mr
a t i o n o f )tP , h了ar
,
w e s h o u l d i d e n ti fy m a n y m o er fu n e ti o n a l g e n e s for m oP 甲 h , T“
.
G l y e e r a ld e h y d e
一
3
一
p h o s p h a te d e h y dor g e n a s e s ( G” D H s ) a er an e i e n t a n d u bi q u i ot u s l y d i s tir b u et d e n z y m e s ,
a e t iv e b o th i n g l y e o ly s i s ( N A D +
一
G A p D H ) an d i n ph o t o s y n t h e ti e a s s i而 l iat o n o f e abr o n d i o x ide v i a th e C a l v i n
c y c l e ( N A I〕p + 一G AP D H ) ( F
o t h e吧 111一G i lm o er an d M i e h e l s , 19 9 3 ) . hT e g ly e o l y ti e ( e at a b o li e ) N A D + 一 G A DP H
( EC 1
.
2
.
1
.
12 ) 15 a e y t o s o l ie h o m o et t r a ll l e r ac ti v e i n g l y e o ly s i s
,
hw i l
e i n h i g he r P lan t s ht e P l a s it d
一
l o e al i z e d
N A D p +
一
G AP D H ( E C 1
.
2
.
1
.
13 ) 15 h e t e or te t r a ll l e ir c ( AZ B : ) an d 15 i n v o lv e d i n ph o t o s y n ht e ti e as s im i l a ti o n o f
e a br o n d i o x i d e
.
N u c le ar g e n e s ( G叩A , G叩 B . G叩 C ) e n e o d e n o t o n l y th e e y t o s o li e ( G aP C ) b u t al s o th e t w o
R e e e i v de d a et
: 2 (幻 3 一的一 3 0
B ir ef i n t八刁 u e t i o n Of t h e 仃喊 a u t h o r : M A L i n g 一加 ( 一9 72 , m a l e , bo m i n L i an e h e n g i n F从iian , A s s l s t an t R e seacr h e r
,
m aj o r i n m o lec u lar
b i o l o g y E
一
m a i l
:
m a l i n g b o @ s l n a
.
e o m
cD A N c】俪 n g明 d叫 un c e ec比川昵颐阳6 mf o此 cl l 】 or叩】a s tl y gC e伪 d ey h由一各内抑恤坦 山出 y如 gea n s el 加 I nP o, 丙,扭 ” 及姗“ 幼 7
yt p e s o f P l as it d
一
lco al i z e d ( G aP A
,
G a PB ) s u bu n i t s
.
eG
n e an d de du
e e d a m i n o
一
ac id seq
u en e e s aer kn
o w n fo r
C A PD H s o f e u
一
an d 娥h ae b ac et ir a , P or t i s t s , g er e n P lan t s , an im al s an d fu n g i . hT e s e G A PD H s aer e l e alr y
ho m o l o g o u s
,
an d e x h i bi t hi g h de ger
s o f s e q u en e e e o n s e vr at i o n i n er g io n s k n o wn
to b e fu n e it o n al l y im P o rt an t
.
In
c o m p如 s o n w iht o het r Por et in 一 e o d i n g g e n e s , G A P D H g e en s h a v e e v o l v ed s l o w ly ( 5 p AM s 伴 r 10 而 l l i o n y e asr ;
oF het gr il l
一
G i lm o er an d M ie h e l s
,
1 9 3 )
,
an d hut
s
aer op et
n it a ll y u s e fu l fo r het
s ut d y o f o gr an i sm a l Ph y l o g e n y
.
G A P D H 15 a e e n t r a l m e t ab o li e e n z y m e in v o l v e d i n b o ht g l y e o ly s i s an d ht e C al v i n e y e le
.
A s ht e if sr t s t e P
to w a dr u n d e sr t an d in g ht e or l e o f G A卫D H er lat ed t o hP o to sy n ht e is s , g l y e o ly s i s an d l e af d e v e lop m en t at ht e
b io e h e而 e al an d mo le e u lar le ve l s , we erP o rt h e er ht e e lo n i n g an d s e q u e n ce e h a acr et ir z a tion o f a e D N A e n c o d in g
het
e h l o r o P l as t g ly e e r a d e hy d
e 一3
一
P h o s P h aet d he y dor g
e n a s e
for m het m iar
n e er d al g a oP , 人了m }瑰 o e sn is .
2 M a t e r i a ls a n d M e ht o d S
2
.
1 A lga l m a t e ir ia a n d e o刀` t ur e t i o n of e D N A li b r a yr
oP 尽h)y ar , ℃ z o esn i s ht al l u s we er e o l l e e et d at Qi d o gn ( Jian g su p ro v i n c e
,
C ih n a ) n e ar ht e Y e l l o w S e a o n eF b
2 5
,
20( )3
.
hT
e th al l u s we er tanr
s
OP rt
e d li v e t o ht e 1a b 0 ar t o yr
,
w a s h ed an d t h e n ter a t e d im m e d iaet l y
o r s to er d at
一 8 0℃ u n t i l an a ly s i s .
T o alt R N A w a s i s o laet d for m ht
a l l u s u s in g T ir z o l er ag ent ( L ife T
e c h n o l o g i e s )
.
M e s s e n g e r R N A fo r e D N A
s y n ht e s i s w as i s o laet d
u s i n g p o ly
AT
tr ac t m R N A i s o l iat o n s y s t e m s ( P r o m e g a )
.
A ht ia l i e D N A li b r a yr w a s m ad e
u s i n g het ZAP
E x per s s e D N A 斗 n het s i s an d P er d ig e s t e d v e t o r ik t s ( Satr ag e en )
.
2
.
2 P C R me 山 a t e d ge en ar it o n o f a h o m o l o g o us P or b e
eD g
e n e r a te o li g o n u e le o tid e s w e er d e s i g n e d b a s e d o n ide n t i e al o r hi g h l y e o n s e vr e d am i
n o
ac id
s e q u e n e e s o f
kn
o w n G A PD H s a ft e r an al i g n m e n t m a t r i x o f G A P D H s e q u en e e s for m
o r g an i sm s er P er sen it
n g d i v e r s e e v o lu t io n脚
li n e a罗 5 . hT e s en s e irP m er G S T 1 5 ’ 一 C AYT C NT A Y CA N G G N G A Y C A
一
3
’
an d an t i s e n s e p ir m er G S2T 5
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G A N A C R T T N G G NG T N GG N A C
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’
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u s e d to am p l i fy ht
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CP R am p li if
e at i o n er ac t i o n s ( ot t a l v o l u m e
: 3印 L ) we er c a in e d o u t u s i n g 4 u n i t s o f T a q D N A p o l y m e ar s e
( T ak ar )
,
3拌L 10 x T明 D N A p o ly maesr e b u fe r
,
80 pmo l
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o f Pir m e sr G S T I an d G s咒 , an d ab o u t l拼L
c D N A l ib r a yr 入D N A et m p laet
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e t e r s w e er 9 5℃ , 5而 n , 3 2 c y e l e s ( 9 5℃ fo r 3 0 5 , 5 0℃ fo r
30 5
,
72 ℃ fo r 4 5 5 ) , an d a if n al 72℃ e x et n s io n fo r s m i n . hT e CP R er ac t i o n m ix ut er s w e er s u bj ce te d ot g e l
e l ce otr P h
o er s i s u s i n g a 1
.
5 % a gaor se
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e x e i s e d
,
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一
T v ec t o r
( T ak ar ) an d
s e qu e n e e d
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Iden ti t y o f t h e por d u e ts wa
s e o n if n 刀 e d b y B la s t X s e a cr he s o f eG
n B a n k
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n t o f P
. 卯名。 e sn is w a s th e n arn d o m ly Iab e le d w iht a
一
3 2 P an d d e s i g n a te d as 6G
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l e n g t h c D N A e l o in n g a n d hy b ir d i
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r e D N A e lo n i n g o f G ap A
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e d u s i n g
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d o v e m i ght i n hi g h S D S h yb ir d i z a t i o n b u fe
r ( 5 x S S C
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u
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,
7 % S D S
,
2 % b l o c ik n g er 昭e n t , 0 . 1 %
lau or y ls acr
o s i n e
,
l o m g
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一 ` s al m o n s p e mr D N A ) at 4 9℃ . hT e m e mb anr e if let r w a s w a she d t w i e e w i ht Z x
s s e
,
0
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1 % S D S at 2 0℃ 几 r s 而 n an d th e n w a s比 d t w i e e 嫩ht 0 . 1 % S D S at 叱℃ fo r 15 m i n . Se v e n p o s i it v e
e l o n e s we er i
s o la et d an d i n se rt e D N A s we er
s e l e e te d fo r s叫 u en c e an aly s i s
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S e q u cen
e d at w
e er s ub 而 et d ot
N C B I an d s e acr h
e d u s i n g ht e B L A S TX al g o ir ht m an d n o n
一
er d u n d an t anu
n o ac i d d a tab a s e
.
C lon e G A P 4 e on tia n s
het al m
o s t e o m Pl e et c h l o or Pl as t
一
G A P D H e D N A o f P
. 产名硬犯琳 15 . T h e s e q u e n e e o f e川 o or P l as t一G A PD H e D N A h a s
be n d e P o s i et d in eG
n B an k u n de r ac e e s s i o n n u m b e r A Y 2 7 38 19
.
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; 、 yl goe ne it 。 an aly 动
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e i n fe l T e d
~
n o
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s e q u e n e e s we er
a li g n e d w i ht P u b li s h e d e u k a yr o ti c G A P D H s e q u e n e e s u s i n g
M Ai L ng
一
bot e a l
.
CLS T U AL Vn ad d j a
u st ed y be ye s
.二 i ni ti al alg i n e mnt u si ng G A PD Hr o fml Pt n a s, an im a ls , fu n g i , an d er d
a lg ae er s u l et d i n 30() un am b i g uo
u s l y a l i g n e d e h ar ac te r s
.
G ap s ht at e o u ld n o t b e acn
h o der er l iab ly w iht
e
on se vr de
s e q ue n c e s
Pa r s l m o n y
d e et n l l i l l e
o n b o ht e n d s w e er er m o v e d fo r Ph y l o g e n e tic an a ly s i s
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P h y lo ge ne t ic an al y se s w e er pe for mr
e d
, n e i g h b o -r j o in i n g ( pYH L IP )
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an d m ax im u m like li h o do (M L ) al g
o ir ht m s ( p A M L an d M o hlP y )
ht e s etr
n g ht o f Ph y lo g e n et i c c o n c lu s io n s
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100 0 Pasr imon
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o r一o i n i n g , an d 10()
U S l l g
.
T O
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b o o t s t r ap er P li e aet
s an d Par s im o n y d e c ay a n al y s i s
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.
1 丸 T C G C C G C T T C C T C C C T C A T C C口C A G C C C C G C C G C C】C G C T T G再启T CG C丁心T G T G G A T C C几 C A T C C C G A C G T C TC G T C C C C几C A C C A C C C
9 1 T C T T C A C C八T G G C G 1 T T C T C G G C A G C A C G C T G A C T G C C G T
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o GG G G G C C C G CG CG C C亡A比八G C A再 GA T C T G C T C G A C C C GCG C C A C C T
3 1 M A 卫 又 G 丑 工 父 工 G 又 A 口 A R A 卫 里 吕 兰 工 C a 盈 且 五 盆 卫
1 8 1 T C G C C C A G I 叮 (月 .C G G G C A T G C GC T CG GT C A丸 C GC C G C G C G T A T G C T G C A C C C GC Ir G C几G G GC G C T C A C G C C A A C G A T G C G T T C T T丁 G C C G
6 1 A O 卫 S Q 琶 丘 a 艾 泣 G A 且 丛 L Q 卫 又 0 G A D A 坟 n A 卫 E A A
2 7 1 C C G T了 r C G A C C召 C C G C T G T C C C G T e G G C G T C C A C C G C G C C G A C GA T G A A G C丁C A A C C T G G C T A T C几C C GG C了】叮 C C C C G C A T T G G C C G C A
9 1 又 三 工 A A 又 卫 吕 A 吕 I A 卫 I M K L K V A I S G F G R I C R N
3 6 1 A C 1
.
TC C T G C G C G C C T G GG C C G C G A A G A G C G A C几 C C C C G C T GG A GG T GG T C TG C A T C八A C G A C A C C T C G C G T G T C A A GA C共G C C T G C C几 T C
1 2 1 F L R A W A A K S D T P L E V V C 1 N D T 5 G V K T A C H L
4 5 1 T G C r G A A G T A C G A T T C T九 TC C T G G G C A C C T r T G C C G G C A C C G T C G A GC C C 口G C G A G G几C丁 C G八T C八C C A T C A A CG G C A八G A A G G飞甲 CG C G
1 5 1 L K Y D 5 1 L G T F A G T V 它 A G E D 5 1 T 1 N G K K V R V
5 4 1 T T G T G T C C A A C CG T G A C C C C C T G C A G C T C C C G 1七 G C C G G A G A T GG G C G T C G A C A T C G T C A T I G入C T C G A C G G G TG T C T T C G T G G A C A A G A
1 8 1 V 5 N R p P L 0 L P W A 它 M G V D 1 V 1 E 5 T G V F V D K K
6 3 1 A G G G T G C G T C C A乃启C A T C TG A C G G C C G G C G C C及A G A几 G C T G C T GA T C A C C G C G C C C G G C A A G G G C C八G G G C A T C C A G A C C T A C C T C G T G G
2 1 1 G A S K H L T A G A K K V L 1 T A P G K G 它 G 1 0 T Y V V G
7 2 1 G T G T G A A CG A C C A G G A C T A C A C C C A C G C C爪C C C A C G A C A T T G T G T C C人A C G C r T C G T口C A C G A C C几T G TC C A I G G C T C C C T T C G T C A入G G
2 4 1 V N D 0 D Y T H A T D D 1 V 5 N A 5 C T T M C M A P P V K V
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L 它 D E F G 1 V K G T 林 丁 T T H 5 Y T G D 0 R L L D A 9 H RQ
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3 0 1
口 T G入 C C飞. G C G T C G C G C C C G G T C G G C G G C C C T C及A C及 1丁 G T G C C C A C C A C C A CC C G T G C G G C C C A G G C C G T G G C C C 1叮 G T C八T C C C T T C G A
D L R R A R 9 A A L N 1 V P T T T G A A 0 A V A L V 1 P S MQ
夕 9 1 T G A A G G G C共A G C T G A A CG G C T A C G C C C T G C G C G T G C C G A C C C C C A A CG T G T C G G T G T G C G A C G T G G T C G丁 C G几C C T C A A G几 G G C C G A C G T
3 3 1 K G K L N G Y A L R V P T P N V 5 V C D V V V E V K R P T p
1 0 8 1 T C A几 G C A G G A G G T C A A C G G C G C C T T C C T G九月启 G C C G C C C A G G G C C C G A T G A A G G G C A T C C T G A A G T A C T C G G A C G A G C C G C T GG 1. G T C G T
3 6 1 K E E V N G A F L K A A 0 G P M K G 1 L K Y 5 D E P L V 5 5
1 1 , 1 C T G A C T T C A A G G G C A T G G T T G A G T C GA C G G C C G T G G A CG T G T C C A T G A C C A CG G T G G T G G G丁 G A CA C G A了 G G T C A A G G T C C T丁 G C G T GG T
3 9 1 D F K G M V 召 5 T A V D V 5 M T T V V G D T M V K V L A 钟 Y
1 2 6 1 A C G A C A A C G A G T G G T C G T A T T C G C T G C G C G T T C T G C几 C C性 IC G C C G A G几 T C A T G GC C A A C A A G T G C C A G T爪 A口C G G C G CG飞,G C C G C C G A T G
4 2 l D 材 它 脚 5 Y 5 L R V L D L A E 1 M A N K W 它 *
1 3 5 1 A C C C T丁G CT T T G A T 九C l r T T A T C r A T C C T T C T G C A C T G T C C C C G G丁C C C T A C G C T
F ig
.
1 N u e le o t id e s e q u e n e e a n d d e d u e e d a m i n o
一
a e id s e q u e n c e o f P
. 似 o e ns is G ap A e D N A
3 R e s u l t s a n d d is c u s s i o n
3
.
1 H o m o l o g o u s G a PA P
r o b e fo r l i b r a r y s e r e e n i n g
A D N A afr gme
n t ( G6
一
1 2 ) o f t he e x p e e te d s i ze ( 1朋b p ) w a s g e ne r at e d fro m do ub le str an d e d p . ” 之口 e ns is
e D N A by CP R
u s in g d e g e n e r a t e Pir m ers
e o
re sP on d i
n g to re g i o n s e o n s e vr de un i
v er s al l y
.
D N A s eq u e n e i n g an d
s u b s e q u e n t B L A S T X se acr h i
n g e o n if rm de ht at
t hi s fr a g m en t h ad b e en a m P l iif e d fro m
a c h l o ro P la s t
一
G A PD H
e D N A
, a s e v i d e l l c ed b y t h e h i g h e r de g er e o f ide n t i yt w iht e h l o r o P last
一
G A P D H s e q u en e e s o f o ht e r o gr 耐 sm s .
3
.
2 e D N A e l o in n g a n d e h a r a e t e r i z a t i o n o f G a P A
S e v e n p u t a t i v e G A p D H e D N A e lo n e s ( G AP I
一
7 ) w e er i s o l a te d for m 8 5 以 H〕 p h铭 e ecr o m b i n an t s u s i n g ht e
h o m o l o g o u s G A P D H P or b e 6G
一
1
.
2
.
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o f d i fe er
n t le n g t h s d u e t o in e o m Pl e et c D N A
cN A Dc】 on in ga l〕d 义叼叱n C ec比川朗 e tr i洲吐 10 11o fh e tc拍 or o Pla s tg l yc。刊北 h yd e
~冬户叹灿把 由 h y血咨 ~五习 mP O, 勺m y
巴改洲 , “ 舀 9
s y n ht ise
s , al l se v en e lon e s e o n iat
n e d ht e G A卫D H hom ol og o u s P r o be s e q u e n e e s
.
a on
e G川4P e on 面 n s ht e
e o m Pl e t e e h l o or Pl as t
一
G A P D H e D N A o f P
. ” 勿 e sn is , e o能 sP o n id n g ot a 7 2 田旧 ino 一 ac id tar n s i t pe Pit de an d a 3 3 8
别 . in o 一 ac i d m a tU er p or et in ( iF g
.
1 )
.
T七e e al e u lat e d cse o n d a yr s tr’U e ut er o f ht e t r a n s i t PeP it de hs o w s a ih gh P or P o rt i o n o f 二d o m e o i l , w h ic h h as
b e e n su g g
e s et d (hZ
o u & R ag an
,
1 9 3 ) ot b
e a m aj o r e hacr
et ir ist e o f e hi o r 0 P last 腼 s i t ep Pit de s i n P lan t s . A
hi g hl y e o n
vser
e d 姗 n o 一 et r n l i n a l M e t一 lA a d iep p tide ( iF g . 2 ) , an e x etr m e l y ih gh e o n et nt o f h y d or x y l a m i n o ac i d s
( se
r an d T h r i n p iaxt cu
l ar )
,
an d a n et p o s it v e c h a r g e w hi e h aer im p
o
artn
t e h
acr ietr
s it e s o f e h l o or p last atrn
s i t
-
Pe Pit d e s aer fo
u n d i n o u r p er su m P t i
v e tr a n s i t ep tP i d e er g ion
.
S IinI l耐 it e s be t
wen edr
al g al an d P lan t G A PD H
e hi 咖 Pl as t一 e n v e l o ep t r a n s i t Pe Pt i d e s m ay agr u e fo r a s in g le e n do sy m b l o t ic o ir g i n o f e hi o or Pl a s t s .
G . l d 1 6 r l -
p o r P h y r .
C h o n d r U .
G r . 口 i l a t i a
S P i n a o i a
N i o o 七 l a n a
p l . U皿
名二
O O n 二 n 口 U 口
!擎薰藻蠢…巍)翼纂薰1 . , 。 , 。 , 。 。 。 。 。 。 。 . 。 。 。 。 。 。
G a l d i 一 r i 。
P o r p h y r a
C h o n d r u -
G r . O l l . r l 扭
S P i n a 0 1 a
N i o o t l . n a
P i . U .
么. a
C O n 二n . U .
. 口 . - .
T A p T -
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S N A p S
1398025`54
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.
2 A Ii g n m en t of ht
e 尸 . 少心肥玛众 G a PA I口n is t pe P石de iw ht tr a n s it pe P it d e s of 动an t an d 吻al G a PA c D N A s
G aP A c D N A fro m p
. 鳄勿 e ns is s h o w s a h i gh G C e o n te n t ( 7 7 % i n hte hit dr 一 b a se Po s i ti o n an d 6 1 % i n t o ta l )
i n ht e tarn
s i t
一
p e p t id e s e q u e n e e
, c o呷aer d w i ht i t s m aut er s u bo in t 一 e do in g eqS u e n e e ( 58 % C C i n ht e iht dr b as e
p o s iit o n an d 52 % ot t a l )
.
hT
e G C e o n et n t s o f ht e e n it er er g i o n o f ht e G a PA e D N A ( 64
.
2 % ) we er
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a v e
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GC
c o n et n t ( 6 5
.
2 % ) w h i c h w as o b tia n e d b y oP , 入了m E S T an al y s i s ( N i iak d o e t a l
.
2仪幻 ) .
M u lt iP le al i g n m e n t s o f ht e per d i e det m aut er
e h lo or Pl as t
一
G Ap D H s u b u in t at
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o 一 ac i d le ve l ( iF g
.
3 ) e le alr y
s h o w ht at fo u r h i g h l y e o n s e vr e d er g i o n s i n G Ap D H ( Haxn
s an d W at e sr
,
19 76 ) aer Per
s e n t in o u r e D N A e l o n e s
,
icn lu d in g ht e c o fac
t o r er g i o n s ( I
,
VI ) an d ht
e c at al y t i e er g i o n ( 1 )
.
A s e x pe e et d
,
ht e
“ S 一 lo P
, ,
er g i o n ( 1 )
o f
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. 产活口`邢 15 G a PA e D N A s h o w s e l e ar is威 liar yt t o ht e e hl or p la s t 一 lco ial z de ( N A D 十 一 G A P D H ) s tur e ut 司 ytP e ,
凡曲 e rm o re , G aP A e n N A l ac k s 山 e p or li n e ( p o s iit o n l a i n B aC i l lus s t ae or rh e n 刀哪〕h i lus G A P D H ) i n het “ S一 lo p ”
er g io n o f t h e de d cu e d P o ly P e P ti d e e h ia n
,
as d o e h l o or Pl as t G A卫D sH in P lan ts
. 丁h is er is du e e o n itr b u et s t o ht e
s衅 i if e i yt o f N A D 十 b i n id n g ot GAP D H h o loe n z yme s ( C o ht i e r e t a l , 19 90 ) . No e的 o x y 一 et 蒯 n al ex et n s i o n ,
s u e h as 15 Per s e n t i n Plan t G a p B g e n e s ( B ir n km an n e t a l
,
198 9 )
,
w as ob se vr de
.
玫v e ls o f a m in o ac id i d e n it yt b e tw e e n th e oP 甲入了m y e z o e ns is c yt o s o l ie G A P D H an d t h o s e i n o ht e r s PeC i e s aer
6 % ot ht
e lF o ir de 叩hy ic d ae hC or dn I’us icr sP us an d Car icl a iar g arC il is , 58 % ot 浇之己比iar su ihr uar ir a .
3
.
3 T h e op
s i t io n of P
.
y e z oe isn
s in ht e G A PD H t er e
Ne w OP 甲入少m G AP D H seq u e n e e w as ial g n ed 诚ht a v ia lab le G A卫D H s e q u e cn e s i n C记n B a kn , an d a g l o b al
Ph y l o g e n e ti e an al y s i s w as u n d e rt ak e n b as e d o n a d at a set
o f 29()
u n
am b i g uo
u s l y al i g n e d e ha r a c te sr
.
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e er s u lit n g
概 ( iF g . 4 ) er e o v e r e d ht e er lat io n s hi p s t冲 i e al o f G A卫D H p h y l o g e n y . T七e er d al g ae ( in e lu idn g p . 少e名。 e o is ,
G
.
o e
ucor
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.
e ir 胡 us an d 命 dl ic ir a ) an d Plan t e hl o or p l as t G A p D H g e n e s aer s h o wn ot h va e id v e gr e d as
s i s te r g or u P s for m
a e o
nuo
n an e e s ot r
.
Ou
r P h y lo g e ne it e t找无 s u Ppo rt s het P or P
o s i it o n ht at OP 甲h了ar , a m e m b e r
o f ht e B an g i al e s
,
15 e o n s i d e er d ot h va e d i v e飞de be fo er ht e iG gart in al e s an d m o s t o ht e r o dr e sr ( al l e x e即 t
C o mP
s o
po g
o n al e s an d s o me me m be sr
o f het oP pr h y ir d al
e s ; R ag an e t a l
,
199 4 ; S au n d e sr & E沙a ft , 19 7 )
.
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一
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.
11
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Or aC l l 扭 r i a
口 al i dr ei a
Po r P h yr a
Nlc o t i 一 n.
吕 .a
Ar a i d bo Pl a .
Pi au .
S i P nc a 工 a
el ha y mdo .o na ,
压 . 己 h e r i e h i a
8六.900ù67, .,JS自户8,日7C h o n d r u a
O 若 已 C i l 舀 r 名丘
G a l d i e r i a
P o r P h y r a
悦 1 e o t i a o a
名 e .
人 r a b i d o P . i e
P 1 a u m
s P i n a e i a
C h l a . y d o . o n 二旧 5 o h e r i e h i -
东盆V了
C h o n d r u a
口 r 压 C i l 口 r i 已
G a l d i e r i 目
P o : P h y r a
N 工 e o t i a n 已
Z e a
A r a b i d o P s i .
P孟 . U口
g P i n a e i a
C h l a 口 Y d o 仍 o n a .
E日 e 卜、 6 r i C h i a
1 5 8
1 5 8
1 5 8
1 5 8
1 5 7
1 5 8
1 5 7
1 5 8
1 5 ,
1 5 9
1 5 3
C h o n d r u 日
G r a 。 工 l a r 二 a
G a 王 d i e r i a
.
p o r P h y r a
N i e o t i a 。 舀
艺 e a
八 r a b i d o P日 1 5
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g P i n a e i a
C h l a m y d o , o n a s
E 日 C h e r i C h i a
2 3 ,
2 3 7
2 3 ,
2 3 7
2 3 `
2 3 7
2 3 6
2 3 7
2 3 6
2 3 8
2 3 3
C h o n d r u 日
G r . C i l a t i a
G a l d i e r i a
P o r P h y r a
3 1 7
3 1 ,
」 1 7
3 1 7
F ig
.
3 C o m Piar
s o n o f th e P
. 了改 (祀码众 e h lo or P la s t一 lco a liz e d G A PD H a im n于 a e id s e q u e n e e
w iht G A P D H se q
u e n e e s
for m
o t h e r o gr an i
s
m
s
p h y l o g e n e ti e an a l y s i s o f G PA D H
s e q u e n e e s h a v e
P or v e d to b e n o to ir o u s l y e o m P le x
,
er fl e e ti n g a
e o m P l ie a te d hi s to yr o f g e n e du P l ie at io n s
,
laet alr
tar n s fe sr
,
an d e n d o s y m b io t i e g e n e er p lac e m e n ts ( e
.
9
. , ,
eH
n z e e t a l
,
19 5
; L i a u d e t a l
,
1 99 7 ; lF g g e e t a l
,
199 )
.
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v e r , t h e er aer
s u b s tan ti al er g i o n s w ihit
n ht e
G A P D H t er e w hi e h aer g
e n e
alr l y
e o n s i s te n t w iht ter
s
i n fe er d for m
o 出 e r m o le e u la r s叫 u e n e e s ( hZ o u & R地 an ,
19 9 5 ; 凡 s t , 2 0 1 ) . B a se d o n an an al y s i s w iht in
R h o d o Ph y at an d g er
n P l an t
, o u r P h y lo g e n e it e ter e
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.
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n c e s :
B ir n幻旧 a n n H , C e rf f R ,
G a姆 o f e h ] o r 0 Pl a st
C o ht i e r C
.
C 】e r m o n t s ,
S al o m o n M
,
et 以 二 19臼 ) , C lo in n g a n d s e q u e n e e an a ly s l s o f e D N A s e n e冈 In g het c y t o so l i e p r eCusor
Of su b u in st G aP A an d
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一
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.
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, 13 : 8 1 一 男 .
B i l ladr P
, 。 t a l
.
,
l , 则〕 . R Ob in g ht e e oe n z y me s pe e i if e i t y of g l y c e r a lds h y d e s
一
3
一
Pho s Ph a et de h ydr o g e
anse
s
.
P lan t M o l B i o
c D NAc l。 画n g田目 绷 ~
c卜功` 勿七画n o o f此 c l h伪叩 It s al go y爪山 h( y七` 3户叹灿记 山 hd y比罗n s a en 切n o P 甲勺他 ,理友 , 留“ 1
R e P
,
12
: 叼 6 一 53 7 .
F as t N M
, 橄is gn er J C , Ro s D S , et 以 . , 2 0 1 . Nu c】已盯一 e nc 司ed 、 lP a s t i序 t留 g e ted g e n e s su gg eS t a isn gl e c 0 n u n o n ior ign fo r A Pi c 0 m P1e x a n a n d
伪朋 fl a g e 】late Pl a ist ds . M o l B i o l E v of , 18 : 4 18 一 42 6
.
R g ge R M
,
cs ho be rt M
,
B ir n肠m an H
, 以 以 . , 1侧哭〕 . lG y e e r目d e h yd e 一3 . p hos Pha 比 山 by d印g e n姗 g en id v e r s i t y in eu ba e t e ir a a n d e u kary ole s :
ve id en ce ofr i
n it 习一 an d inte 卜 ki
n g dom g en
tr an
s fe 「 . M o l iB of E vo l , 16 : 4 29 一 4幻 .
OF ht
e r ig l l
一
G ilm ore L A
, 呱 e h e l s P A M , l卯 3 . vE o l u it o n o f g ly e o ly is s . R O g B i o Ph y s . M of B iof , 59 : 105 一 2 3 5 .
H田 ir s J l , W a t e r s M , 10 76
.
G ly c e r al d e h yd e
~
3
一
pb o sp h a t e d e h y d r o g e
anse
.
In : B o y e r DP (曰 ) 几 e enz y m e s , v ol l 3 . c^ ad e而 c rP e s s , Ne w y ork , l -
14
.
H e n Z e K
,
B adr A
.
W e t t e m M
,
e t 以 . , 19 9 5 . A n u e lear g en of e u b a c t e ir al iOr g i n in E u g le na gr a c il s 化 fl ec ts e叮itP e e n do s y m b i o se s d吐n g Pr o t i st
e vo liut on
. 氏优 . N a目 A e ad S ic . U S A , 92 月 12 一 9 126 .
L e E K
,
S eo S B
, 儿 m T H , et al . , 2以幻 . A朋】y is of e x P re s se d 5 0 1业 cne agt s of oP 甲h” a 笋场叱川 15 . M o l C el s , lO : 3 3B 一 34 2 .
iL au d M F
,
B啊 dt U , sc h e rZ I n g e r M , et 心 . , 19 7 . E vo 抽d o n印T ior ign of c ry P勿~ ad 而 C ro a lg a e ; two no vel 喇。 m p las 口 yC to so 】一 s户父币c G A P D H
ge ne s as po t e n 眨ia m ar k e rs of anc
e s tr a] en do sy m b i o n t aD d ho s t c el c o m po n e nts
.
J M of E vo l
,科 : 52 8 一 53 7 .
N i七ia dO I
,
A翻灿 z u E , N ak aj ima M , et al . , 2 X( X) . G e ne r a t ioD nf lo , 154 e x P r e s “ 月 ` e qu e n c e tag s fr o m a l e afy g am et o Ph y te of a n 口n n e r ed al ga
尸心 , 妙。 笋吃配心 15 . D N A R se . 7二 22 3 一 2 2 7 .
R a g an M A
,
B词 C J , 侧 c e E L , et 以 . , l , 刊 . A mo le c u lar ph y l o g e yn of het n l日 n en der al gae ( Rh团 o p h ayt ) b a s e d on het n cu laer ~ u
一叻 un it r RN A
ge en
.
P氏兄 , N at 】cA ad Sci
.
U S A 9 1 : 7 276
一 7公刃 .
s a u o d e rs G W
,
E汪a ft G T , 19 7
.
A mo l
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r s户戈 it v e o n red al 邵1 e vo liut o n : F oc u s o n 山 e FI 硕 d即p hy c ida e . lP an t s y st . E v o l . 11 ( s u IP . ) : 115
一 138
.
ist n er J w
,
w ` 叨d J R , 19 9 3 . M o lce ul ar a Dal iys s 卿司 s c尽 p it c 曲ersl ty in oP , 而卿 (孙川叩 h ayt ) . J hP cy ol , 29 : 队场 一 51 7 .
Z h o u Y H
,
R a g叨 M A . 19 9 3 . e D N A e l o i ng an d e ha了 a e t e ir z iat o n of ht e n u e lear g en e e n c团 i n g e hl o ro P last gl yc e n日de h y d e s . 3申ho sP h ate de hy dr o g e n 趾记
细m ht e n l a了 I n e r ed al g a G racl l a朋
~
a
.
C u r G e n et 2 3
: 叨3 一 . 刃 .
Z h o u Y H
,
aR g an M A
,
19 9 5
.
T七e nu cl e ar ge ne 阳d c D N sA e cn 记 i n g c yt o os li c gl y ce iar de h y由 -5 3 ~ p bo s两ate d e hdy or ge o 别沈 云。 m hte m 别n n e r团 al ga
`
~
al ir a
~
a : d ion gn
,
ch a国a c te ir atZ ion
a n d 户 yt o g e n iet c 朋 al y is . uC r G e n et , 2B : 32 4 一 3 32
·
条斑紫菜叶绿体甘油醛 · 3 一磷酸脱氢酶
的 c D N A 克隆和序列分析
马凌波, 张凤英
(中国水产科学研究院东海水产研究所农业部海洋与河 口渔业重点开放实验室 , 上海 2《x x联〕
摘 要 :利用 已知甘油醛 一3 一磷酸脱氢酶 ( G A P D H )的特征性保守 区域合成探针 , 并对条斑紫菜 ’ c DN A 文库进行
筛选 ,获得 了一个编码叶绿体甘油醛 一3 一磷酸脱氢酶 ( G aP A ) 的全长 c D N A 克隆 ( G A 4P ) 。 G A p咯包含 了全长的
叶绿体甘油醛 一 3一磷酸脱氢酶的 c D N A 序列 , 编码 72 个氨基酸 的信号肤和 3 8 个氨基酸的成熟蛋白 。 将获得
的 G a pA 蛋白的氨基酸序列与其它物种的 G A p D H 序列进行多重序列 比较后 , 发现条斑紫菜的 G a p A 氨基酸序
列都包含 了 4 个高度保守 的结构域 。 条斑紫菜 G a p A 的 c DN A 序列中 oc 含量很高 (64 . 2 % ) , 与紫菜 sE T 分
析中得到的结果 (65 . 2 % )近似 。 通过 G A P D H 的分子系统发育分析 ,对红藻的分类地位进行了初步探讨 。 条
斑紫菜叶绿体甘油醛一 3 一磷酸脱氢酶的 c D N A 序列已登记到 C记n B a n k 数据库 , 序列号为 : A 2Y 73 81 90
关键词 :条斑紫菜 ; G A p D H ; c D N A 克隆 ;系统发育