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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
长柄链格孢四个二甲酰亚胺类杀菌剂胁迫
差异表达基因的克隆与序列分析
罗义勇1, 2 刘卫红 3 柳陈坚 1 毕薇 2 张克勤 2 杨金奎 2
( 1昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650224; 2云南大学生物资源保护与利用国家重点实验室培育基地和
教育部微生物资源重点实验室,昆明 650091; 3云南平正环保科技有限公司,昆明 650093)
摘 要: 为了阐明烟草赤星病病原真菌长柄链格孢 A lternaria longip es对二甲酰亚胺类杀菌剂 ( DCFs)抗性的分子机理, 前
期克隆了 16个 DCFs胁迫差异表达基因的部分 cDNA片段。为了利用基因敲除技术进一步分析这些差异表达基因的功能, 本研
究选取 4个差异表达基因,即 A lATP7、A lCIT1、A lGLUT和 A Hl SP88, 应用 DNA w alking技术对它们两侧的未知序列进行克隆。
DNA测序和 B last搜索表明, A lATP7基因开放阅读框为 712 bp,含 4个外显子和 3个内含子,编码 169个氨基酸; A lCIT1、A lGLUT
和 A Hl SP88基因未克隆到全长序列, 5c末端还有 200- 300 bp才到达翻译起始密码子 ATG;在这些 DNA序列中, A lCIT1基因长
1 214 bp,含1个内含子,编码 386个氨基酸; A lGLUT基因长 1 308 bp,含 1个内含子, 编码 417个氨基酸; A Hl SP88基因长 2 087
bp,含 2个内含子,编码 628个氨基酸。与其他丝状真菌的氨基酸序列同源性比对发现, A lATP7和线粒体 ATP合酶 D亚基、A-l
CIT1和柠檬酸合成酶、A lGLUT和主要易化子超家族 ( MFS)类型葡萄糖转运子、A Hl SP88和热休克蛋白 HSP88分别具有很高的
同源性。同时,还对 4个 DCFs胁迫差异表达基因的系统发育进行分析。基于这些蛋白功能的文献报道和前期的研究,推测 A.
long ipes存在着一种新的 DCFs抗性机制: A. long ipes利用MFS类型葡萄糖转运子将 DCFs排除到细胞外解毒,线粒体 ATP合酶和柠檬
酸合成酶参与能量供给,而热休克蛋白 AHl SP88可能在该机制中促进一些重要蛋白的正确折叠和修复过程中发挥重要作用。
关键词: 长柄链格孢 线粒体 ATP合酶 D亚基 柠檬酸合成酶 主要易化子超家族类型葡萄糖转运子 热休克蛋
白 H SP88
Cloning and Sequences Analysis of Four Differential Expression
Genes from A lternaria longipes in DCFs Stress
LuoY iyong
1, 2
L iuW eihong
3
L iu Chenjian
1
B iW ei
2
ZhangKeqin
2
Yang Jinkui
2
(
1
College of L ife Sciences, Kunm ing University of Science and T echno logy, K unm ing 650224;
2
Laboratory forConservation and Utilization of B io-R esources& K ey Laboratory for
M icrobial Resources of theM inistry of Education, Yunnan University, Kunm ing 650091;
3
Yunnan P ingzheng Environmental Technology Co. , L td. , K unm ing 650093)
收稿日期: 2010-10-19
基金项目:云南省应用基础研究自筹经费项目 ( 2010ZC056 ),昆明理工大学人才科研启动基金资助项目 ( 14118250) ,云南省中青年学术和技术
带头人后备人才资助项目 ( 2009C I052)
作者简介:罗义勇,男,博士,研究方向:微生物逆境生理与分子生物学; E-m ai:l yyongl_168@ yahoo. com. cn
通讯作者:杨金奎,博士,副教授, E-m ai:l jinku iyun@ yah oo. com. cn
Abstrac:t In order to clar ify the m o lecularm echanism of tobacco brown spo t disease pa thogen ic fung iA lternaria longipes resis-t
ance to dicarbox im ide fung ic ides( DCFs), 16 d ifferen tia l expression( DE ) cDNA fragm ents responding to DCFs stress have been cloned
in our prev ious wo rk. To further ana lyze the functions o f these DE genes by gene d isruption techno logy, 4 DE genes( A lATP7, A lCIT1,
A lGLUT and AHl SP88) we re se lected and the irDNA sequencew ere cloned using DNA w alk ingm ethod, respectively. The DNA sequen-
cing and blast search ing resu lts show ed that the opening read ing frame o fA lATP7 gene w as 712 bp in leng th, w hich contained four ex-
ons and three introns and encoded a pro te in of 169 am ino ac ids. The 5cend of A lCIT1, A lGLUT and AHl SP88 genes did not reach the
translation in itiation codon ATG, rem a in ing about 200 - 300 bp. In these DNA sequences, the A lCIT1, A lGLUT and A Hl SP88 genes
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
w ere 1 214, 1 308 and 2 087 bp in leng th wh ich interrupted by one, one and two in trons, respectively. In addition, theA lCIT1, A lGLUT
and A Hl SP88 genes encoded po lypeptides o f 386, 417 and 628 am ino ac ids, respec tive ly. H om ologous ana ly sis o f am ino acids show ed
tha t A lATP7, A lC IT1, A lGLUT and A Hl SP88 shared respectiv ely a high degree o f sequence iden tity tom itochondr ia lATPase D subun it,
citrate synthase, them a jor fac ilitator superfam ily(M FS) type g lucose transporter and hea t shock prote in HSP88 of other filam entous fun-
g .i M oreover, the phylogenetic trees o f 4 DE genes w ere constructed. Based on the reports of these pro te ins and our prev ious study, w e
speculated tha tA. longip es has a new DCFs- to le rantm echan ism: A. long ip es exclude the DCFs to the exte rnal ce ll usingMFS type g lu-
cose transporter to detox ify the DCFs, m itochondr ia l ATPase and c itrate synthase partic ipating in energy supp ly, and AHl SP88 play a
ro le in prote ins fo ld correctly and rem ediate dur ing this process.
Key words: A lternaria long ip es M itochondrial ATPase D subun it C itrate synthase M ajor fac ilitator superfam ily type g lucose
transporter H ea t shock prote in HSP88
长柄链格孢 (A lternaria long ip es)侵染引起的烟
草赤星病是一种重要的烟草真菌病害。二甲酰亚胺
类杀菌剂 ( DCFs)具有杀菌谱广, 防治效果显著等特
点,被广泛应用于多个类群植物真菌病害的防治。
然而, 随着 DCFs使用时间的延长和施用量的加大,
植物病原真菌对该类杀菌剂出现了严重的抗药性问
题 [ 1- 4]。目前对真菌抗药性的分子机理有了一定的
了解, 但一些重要的问题未得到充分认识。据报道,
细胞内双组分信号转导系统中的组氨酸激酶 (HK )
上游 6组 92个氨基酸重复区内的突变是导致植物
病原真菌对 DCFs抗性的原因 [ 5- 7]。然而, 我们前
期的研究发现, HK基因的突变不是赋予 A. longipes
对 DCFs抗性的唯一因素 [ 8]。为了阐明除了 HK以
外还有哪些因子参与了 A. long ip es对 DCFs的抗性
过程, 利用 G eneFishing技术克隆得到了 16个 DCFs
胁迫差异表达基因, 并选取一个亲环蛋白基因 A lC-
yP1,通过基因敲除技术对其生物学功能进行了研
究。结果表明, A lCyP1基因与 A. longipes对 DCFs
的抗性机理没有直接关系 [ 9]。基于以上研究背景,
本研究选择 4个显著性差异表达基因 (A lATP7、A -l
C IT1、A lGLUT和 AHl SP88),利用 DNA wa lk ing技术
对基因两侧的未知序列进行了克隆, 以便于后续的
基因敲除试验。本研究首次成功克隆到了 A. longi-
p e线粒体 ATP合酶 D亚基 A lATP7基因, 柠檬酸合
成酶 A lC IT1基因,主要易化子超家族 (MFS)类型葡
萄糖转运子基因 A lGLUT和热休克蛋白 HSP88基因
AHl SP88的全长或部分基因序列 (各超过 1 100
bp) ,并将这些序列与其他丝状真菌的相应基因序
列进行同源性比较和系统发育分析, 对 A. longipes
中 4个蛋白的功能和 DCFs抗性机制进行推测。研
究结果为进一步阐明 A. long ip e对 DCFs抗性分子机
理奠定基础。
1 材料与方法
111 菌株和培养基
本试验所用材料为 A. longipes DCFs敏感菌株
C-00
[ 8 ]
,保存在云南大学生物资源保护与利用国家
重点实验室培育基地。马铃薯葡萄糖琼脂固体
( PDA )培养基用来培养 A. long ip es; 溶菌肉汤 ( LB )
培养基用于 E scherichia coli DH5A的培养。
112 基因组 DNA的提取
PDA培养基表面贴一层灭菌玻璃纸, 将菌落直
径为 5mm的 C-00菌块接种到玻璃纸上, 28e 培养直
至菌丝长满玻璃纸。用灭菌解剖刀将菌丝刮至研钵
中,液氮冷冻。利用 CTAB法 [ 10]提取基因组 DNA。
113 四个差异表达基因两侧 DNA序列的扩增
11311 5c和 3c端序列的 DNA wa lk ing扩增 根据
以前已经克隆获得的 A lATP7、A lC IT1、A lGLUT 和
AHl SP88基因的部分 cDNA序列,利用 Primer Prem-i
er 510( PREM IER B iosoft Internat iona,l USA )软件设
计用于扩增基因 5c和 3c端未知序列的特异性引物
(表 1)。利用 DNA wa lk ing speedupTM prem ix试剂盒
( Seegene, Korea)分别扩增 A lATP7、A lC IT1、A lGLUT
和 AHl SP88基因的 5c和 3c端的未知序列。具体操
作见试剂盒说明书。
11312 PCR产物克隆和测序 将 PCR产物克隆至
pMD18-T( TaK aRa, Japan)质粒中。以含有目的基因
的质粒 DNA为模板,应用载体两端的测序引物 RV
和 M13, 在 AB I 3730测序仪 ( Perkin-E lm er, USA )上
进行测序反应。为避免测序过程出现错误, 所有样
品均测序 3次。
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2011年第 5期 罗义勇等:长柄链格孢四个二甲酰亚胺类杀菌剂胁迫差异表达基因的克隆与序列分析
表 1 A lATP7、A lC IT1、A lGLUT和 A lHSP88基因两侧 DNA w alk ing扩增引物
引物 序列 ( 5cy 3c) 用途
ACP1 /2 /3 /4 ACP-AGGTC /ACP-TGGTC /ACP-GGGTC /ACP-CGGTC
A tp-T sp1 GACACTTAAAGGACGGACAGAT
ACPN ACPN-GGTC
A tp-T sp2 ATCGCCGAACTTCTCCTTGTAG
Un-i prim er TCACAGAAGTATGCCAAGCGA
A tp-T sp3 TTCTCCTTGTAGCCGGGAACG
扩增 A lATP7基因 5c端的未知序列
ACP1 /2 /3 /4 ACP-AGGTC /ACP-TGGTC /ACP-GGGTC /ACP-CGGTC
C it-Tsp1 TTCCCTCACATTCTCCTGACT
ACPN ACPN-GGTC
C it-Tsp2 CTTACAACTTTGCGCCAACCA
Un-i prim er TCACAGAAGTATGCCAAGCGA
C it-Tsp3 GTCGATGATGAGCTGGGGAAGG
扩增 A lC IT1基因 5c端的未知序列
ACP1 /2 /3 /4 ACP-AGGTC /ACP-TGGTC /ACP-GGGTC /ACP-CGGTC
G lu-T sp1 TTCGTTGTTCAAAAGGGTCTG
ACPN ACPN-GGTC
G lu-T sp2 AAAGGGTCTGCTCCTCCTCTGG
Un-i prim er TCACAGAAGTATGCCAAGCGA
G lu-T sp3 CTGCTCCTCCTCTGGGTAGTTG
扩增 A lGLUT基因 5c端的未知序列
G lu.-Tsp1 AAAGAGTCGGGCAAAGAACAG
ACP1 /2 /3 /4 ACP-AGGTC /ACP-TGGTC /ACP-GGGTC /ACP-CGGTC
G lu.-Tsp2 GCAAGTCTTCCGCCATCCTGA
ACPN ACPN-GGTC
G lu.-Tsp3 TCCGCCATCCTGACTACCAAA
Un-i prim er TCACAGAAGTATGCCAAGCGA
扩增 A lGLUT基因 3c端的未知序列
ACP1 /2 /3 /4 ACP-AGGTC /ACP-TGGTC /ACP-GGGTC /ACP-CGGTC
H sp-T sp1 CTGCGTGCTCCTTCTGTTGCT
ACPN ACPN-GGTC
H sp-T sp2 TGCTTCTCCATGACCGCTTGT
Un-i prim er TCACAGAAGTATGCCAAGCGA
H sp-T sp3 CTCGATCTTGTCGTTGTAGCG
第 1次扩增 A Hl SP88基因的 5c端未知序列
ACP1 /2 /3 /4 ACP-AGGTC /ACP-TGGTC /ACP-GGGTC /ACP-CGGTC
H spo-Tsp1 AGAAGGTGAGGATCTTGGTCG
ACPN ACPN-GGTC
H spo-Tsp2 CTTGTTGAAGGCGGTCAGGTT
Un-i prim er TCACAGAAGTATGCCAAGCGA
H spo-Tsp3 CTGACTTCTCCCAGGTGAACTCG
第 2次扩增 A Hl SP88基因的 5c端未知序列
每一个 DNA w alk ing扩增包括 3次巢式 PCR; ACP1 /2 /3 /4、ACPN和 Un-i prim er分别是试剂盒里 3次 PCR的引物; TSP1、TSP2和 TSP3是根
据已知序列设计的分别与试剂盒里的 3次 PCR引物相对应的特异性引物
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
114 序列分析
首先, 将前期克隆得到的部分 cDNA序列和本
研究中利用 DNA walking克隆得到的片段拼接起
来,获得 A lATP7、A lC IT1、A lGLUT和 AHl SP88基因
各超过 1 100 bp长度的 DNA 序列。其次, 应用
B lastn软件,将这些序列在 GenBank数据库 ( http: / /
www. ncb.i nlm. nih. gov /BLAST / )中进行在线比对
分析, 获取与 A lATP7、A lCIT1、A lGLUT和 A Hl SP88
基因一致性最高的序列。在此基础上, 结合 DNAS-
tar软件 ( V ersion 51012, USA )分析得到这些序列是
否到达翻译起始密码子 ATG、内含子位置和数量以
及推导的氨基酸序列特征等信息。然后, 利用
DNAman软件 ( V ersion 51212, Canada) , 将 A lATP7、
A lCIT1、A lGLUT和 AHl SP88基因与其他丝状真菌
来源的相应基因进行核酸和氨基酸的序列同源性分
析。最后,利用 Predictpre in数据库 ( http: / /www. pre-
dictprotein. org / )中的 Prosite、PROFsec和 PHDhtm等
软件和 SMART 数据库 ( http: / / smar.t emb-l heide-l
berg. de / )在线预测 A lATP7、A lC IT1、A lGLUT和 AHl -
SP88基因氨基酸序列的二级结构特征、保守基序和
可能的活性中心和位点等。
115 系统发育分析
利用 C lustal_X软件 [ 11]对基因序列进行比对,
采用邻接分析法 [ 12] , 用 MEGA 311软件 [ 13]构建邻
接 ( N eighbo r Jo in ing, N J)树。
2 结果与分析
211 四个差异表达基因的 DNA序列扩增
根据前期获得的 A lATP7、A lCIT1、A lGLUT和
AHl SP88 4个基因的部分 cDNA 片段设计 DNA
wa lk ing扩增的特异性引物 (表 1) ; 以菌株 C-00的
基因组 DNA为模板, 利用 DNA walk ing speedupTM
prem ix试剂盒进行 PCR扩增。A lATP7和 A lC IT1基
因各进行 1轮 5c端 DNA walk ing扩增, A lGLUT基因
5c和 3c端各进行 1轮 DNA walking扩增, A Hl SP88基
因 5c端进行两轮 DNA wa lk ing扩增。对扩增获得的
条带进行克隆、转化和测序分析, 结果表明,
A lATP7、A lC IT1和 A lGLUT 基因 5c端各获得了
1 060、1 259和 624 bp的 DNA片段, A lGLUT基因 3c
端获得了 769 bp的 DNA片段, A Hl SP88基因 5c端
获得了 926和 1 018 bp的两个 DNA片段。将 DNA
walking扩增结果和前期获得的部分 cDNA片段序
列拼接起来, 最终获得 A lATP7、A lCIT1、A lGLUT和
AHl SP88基因分别为 1 157、1 391、1 417和 2 293 bp
的核苷酸序列。这些序列已提交到 GenBank数据
库中,序列号分别为 HQ171095- HQ171098。
212 四个差异表达基因的序列特征分析
对扩增得到的 4个差异表达基因序列在 Gen-
B ank数据库进行 BLAST搜索, 结果发现,与其他丝
状真菌相比, A lATP7和线粒体 ATP合酶 D亚基基
因、A lC IT1和柠檬酸合成酶基因、A lGLUT和 MFS类
型葡萄糖转运子基因、AHl SP88和热休克蛋白
HSP88基因分别具有很高的同源性。根据同源性最
高的 Pyrenophora tritici-rep entis线粒体 ATP合酶 D
亚基、柠檬酸合成酶、MFS类型葡萄糖转运子、热休
克蛋白 HSP88基因的 DNA和 cDNA序列,分别确定
A. long ip es中 A lATP7、A lC IT1、A lGLUT 和 AHl SP88
基因的 DNA和 cDNA序列,对 4个基因序列的特征
分析结果如下。
A lATP7:在获得的 1 157 bp序列中, 含有 712
bp和 445 bp的编码和非编码区。编码区含有 4个
外显子和 3个内含子;外显子 1- 4大小分别为 12、
396、72和 30 bp, 内含子大小分别为 131、56和 15
bp。A lATP7基因 cDNA序列全长 510 bp, 编码一个
长度为 169个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列比对分
析发现, A lATP7和其他丝状真菌 N eurosp ora crassa
( XP_965776)、A spergillus clavatus ( XP_001270172)、
P en icillium marneffei ( XP_002143366)和 P. tritici-re-
pentis( XP_001936026)线粒体 ATP合酶 D亚基的序
列同源性分别为 6611%、6712%、7113%和 9519%
(图 1-A ) , 说明 A lATP7属于丝状真菌线粒体 ATP
合酶 D亚基超家族成员。A lATP7基因推导的氨基
酸序列特征分析表明, A lATP7分子量为 1818 kD,
等电点为 813, pH 710时的电荷为 111;酸性氨基酸
( D和 E ) 25个,碱性氨基酸 ( R和 K) 26个; 疏水氨
基酸 ( A、I、L、F、W 和 V ) 65个; 极性氨基酸 ( N、C、
Q、S、T和 Y) 40个。通过 Prosite软件预测, 发现推
导的 A lATP7氨基酸序列包括 1个 cAMP和 cGMP
依赖的蛋白激酶磷酸化位点, 2个蛋白激酶 C磷酸
化位点, 1个酪蛋白激酶 II磷酸化位点和 3个 N-豆
蔻酰化位点; 通过 PROFsec对 A lATP7蛋白质的二
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2011年第 5期 罗义勇等:长柄链格孢四个二甲酰亚胺类杀菌剂胁迫差异表达基因的克隆与序列分析
级结构进行预测, 表明该蛋白含 71101% he lix和
28199% loop。应用 PSORT ( h ttp: / /psor.t hgc. jp / )
蛋白亚细胞定位软件分析 A lATP7序列, iPSORT预
测 A lATP7没有线粒体定位的靶肽,而WoLF-PSORT
发现, A lATP7定位于线粒体的可能性为 50%。另
外, SMART软件预测 A lATP7具有起始于第 2个氨
基酸终止于第 153个氨基酸的线粒体 ATP合酶 D
亚基功能结构域 (M t_ATP-synt_D ) (图 1-A ), 说明
A lATP7基因是典型的线粒体 ATP 合酶 D亚基
基因。
A lCIT1:未克隆得到全长序列, 5c端约有 243 bp
才到达翻译起始密码子 ATG。在获得的 1 214 bp
序列中,含 2个外显子, 1个 54 bp的内含子和 3c端
176 bp的非编码区。从 5c端第一个碱基开始翻译,
A lCIT1基因 cDNA片段编码一个长度为 386个氨基
酸的多肽; DNAStar软件分析表明, 该多肽分子量为
4219 kD,等电点为 615。氨基酸序列比对分析发
现, A lC IT1和其他丝状真菌 N. crassa ( XP_956898)、
A. clavatu s ( XP _ 001276108 )、P. marneffei ( XP _
002149093)和 P. tritici-rep entis( XP_001933961)柠檬
酸合成酶的序列同源性分别为 8412%、9014%、
9310%和 9910% (图 1-C ), 说明 A lC IT1基因是 A.
longipes柠檬酸合成酶的编码基因。 SMART数据库
预测发现,推导的 A lC IT1氨基酸序列具有起始于第
1个氨基酸终止于第 370个氨基酸的柠檬酸合成酶
功能结构域 ( citra te_synt doma in ) (图 1-C )。通过
Prosite软件对 A lC IT1的氨基酸序列特征进行进一
步的分析,发现该序列除了含蛋白激酶 C磷酸化、
酪蛋白激酶 II磷酸化及 N-豆蔻酰化等位点外, 在
265- 277位点, 还含有 1个柠檬酸合成酶标签
( GYGHAVLRKTDPR ), 该标签位于 citrate_ synt do-
ma in的活性中心区,且 H残基是该标签的核心活性
位点 [ 14] (图 1-C ), 说明 A lC IT1具有典型的柠檬酸
合成酶特征,是 A. longipes的柠檬酸合成酶。
A lGLUT:未克隆得到全长序列, 5c端约有 215
bp才到达翻译起始密码子 ATG。在获得的 1 308
bp序列中,含 2个外显子、1个 54 bp的内含子和 3c
端 109 bp的非编码区; 除去内含子, 可以翻译成
417个氨基酸。氨基酸序列比对分析发现, A -l
GLUT和其他丝状真菌 N. crassa ( XP _957394)、
A. clavatus ( XP _ 001271347 )、P. marneffei ( XP _
002143512)和 P. tritici-rep entis ( XP_001940072) MFS
类型葡萄糖转运子的序列同源性分别为 5114%、
5319%、5416%和 9213% (图 1-D) ,说明 A lGLUT基
因编码 A. long ip es的 MFS类型葡萄糖转运子。A-l
GLUT氨基酸序列特征分析表明,其分子量为 4319
kD,等电点为 612。通过 Prosite基序搜索发现, A-l
GLUT序列除了含糖基化、酪蛋白激酶 II磷酸化、酰
胺化等位点外, 在 57- 82位点,还具有 1个糖运输
蛋白标签 2 ( LSGVGAGASVV IVPLY ISE ISPPGEK )
(图 1-D )。另外, PROFsec预测表明, A lGLUT 含
54192% he lix, 12195% sheet和 32113% loop; PHDhtm
预测 A lGLUT有 10个跨膜区;这些结果说明 A lGLUT
很可能是膜蛋白。应用 SMART数据库对 A lGLUT
氨基酸序列功能区进行预测, 发现该序列具有起始
于第 1个氨基酸终止于第 427个氨基酸的葡萄糖转
运子功能结构域 ( sugar_ tr doma in) , 且该结构域中
含有一个长为 380个氨基酸 ( 2- 381位 )的主要易
化子超家族 (MFS)保守区 (图 1-D) ,结合氨基酸序
列同源性比对分析结果, 进一步说明 A lGLUT 是
MFS类型的葡萄糖转运子。
AHl SP88:未克隆得到全长序列, 5c端约有 284 bp
才到达翻译起始密码子 ATG。在获得的 1 308 bp序
列中,含有 3个外显子、2个内含子和 3c端 206 bp的
非编码区。外显子 1- 3大小分别为 1275、309和 303
bp,内含子大小分别为 150和 50 bp。氨基酸序列比
对发现, A Hl SP88和其他丝状真菌 N. crassa ( XP _
961759)、A. clavatus( XP_001268997)、P. marneffei( XP
_002146283)和 P. tritici-rep entis ( XP_001935270)热休
克蛋白 HSP88的序列同源性分别为 6018%、6518%、
6611%和 9416% (图 1-B),表明 AHl SP88是丝状真菌
热休克蛋白 HSP88的同系物。AHl SP88氨基酸序列
特征分析表明, 其分子量为 7015 kD, 等电点为 511。
Prosite基序搜索发现, A Hl SP88序列除了含糖基化、
蛋白激酶 C磷酸化、酰胺化等位点外,在 241- 255位
点,还具有 1个热休克蛋白 HSP70蛋白家族标签 3
( IEMVGGCTRVPVLKS) (图 1-B ) , 说明 AHl SP88是
A. longipes的热休克蛋白家族成员; PROFsec预测发
现, A Hl SP88 含 43163% he lix、1614% sheet 和
39197% loop。另外, SMART预测 AHl SP88没有跨膜
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
区,具有 Hsp70功能活性区,且活性区起始于第 1个
氨基酸终止于第 563个氨基酸 (图 1-B) , 说明 AHl -
SP88是典型的热休克蛋白,其生物学功能可能与热
休克蛋白 H sp70密切相关。
A. A lATP7; B. A Hl SP88; C. A lC IT1; D. A lGLUT;相同和相似的氨基酸分别用黑色和灰色背景标记;下划线分别表示 A lATP7的 M t_
ATP-synt_D, A lC IT1的 citrate_synt, A lGLUT的 sugar_ tr, A Hl SP88的 H sp70功能结构域;白底纹黑方框分别表示 A lC IT1的柠檬酸合
成酶标签 (实心三角形指向该标签核心残基 H ), A lGLUT的 / GPLAGKYGRLRAM 0保守基序和糖运输蛋白标签 2, AHl SP88的热休
克蛋白 H SP70蛋白家族标签 3;黑底纹白下划线方框表示 A Hl SP88 N端与 ATP酶结合相关的保守基序: P. phosphate; C. connect; A.
ad enos ine
图 1 长柄链格孢四个差异表达基因分别与其他丝状真菌线粒体 ATP合酶 D亚基、柠檬酸合成酶、
MFS类型葡萄糖转运子和热休克蛋白 HSP88的氨基酸序列比对分析
213 四个差异表达基因的系统树构建
以酿酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae )为外群,
应用 MEGA 311进化分析软件, 基于 K imura双参数
模型, 将 A lATP7、A lC IT1、A lGLUT和 AHl SP88的氨
基酸序列和其他真菌来源的线粒体 ATP合酶 D亚
基、柠檬酸合成酶、MFS类型葡萄糖转运子和热休
克蛋白 HSP88的氨基酸序列分别进行 NJ树的构建
(图 2 )。结果显示, A lATP7、A lC IT1、A lGLUT 和
AHl SP88数据矩阵各有 13个物种;在 4个氨基酸树
间, 树枝的分布大体相同, A. longipes首先与同属于
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2011年第 5期 罗义勇等:长柄链格孢四个二甲酰亚胺类杀菌剂胁迫差异表达基因的克隆与序列分析
格孢腔菌科 ( P leosporaceae )的 P. tritici-rep entis聚为
一类, 然后与同属于格孢腔菌亚目 ( P leosporineae)
的 Phaeosphaeria nodorum 聚为一大类, 表明此氨基
酸树的拓扑结构与这 3个物种树的拓扑结构一致。
A. A lATP7; B. A lC IT1; C. A lGLUT; D. A Hl SP88;线条上的数字代表自展支持率;所有序列的 GenBank登记号都标记在图上
图 2 基于四个差异表达基因的氨基酸序列构建的 NJ树
3 讨论
为了探讨除 HK以外, 还有哪些基因或蛋白与
A. long ip es对 DCFs的抗性相关,本实验室前期利用
GeneF ish ing技术从不同抗性水平的 A. longipes中克
隆了 16个 DCFs胁迫差异表达基因 [ 15]。为了验证这
些基因是否与 A. longip es DCFs抗性存在直接的联系,
本研究选取 4个显著差异表达基因 ( A lATP7、A -l
C IT1、A lGLUT和 AHl SP88)作为研究对象,并计划通
过基因敲除技术对它们的生物学功能进行分析。前
期试验表明,利用同源重组技术对丝状真菌进行基
因敲除,需要获得 500 - 1 000 bp长度的左右同源
臂,因此应用 DNA walking方法克隆得到 A lATP7、
A lCIT1、A lGLUT和 AHl SP88基因各超过 1 100 bp
长度的 DNA序列 (未发表数据 )。利用生物信息学
方法, 对这些序列从核苷酸和氨基酸水平进行分析,
获得 A lATP7、A lC IT1、A lGLUT和 A Hl SP88基因相关
方面的第一手资料,为后续的生物学功能、表达调控
和分子进化研究奠定基础。
F1 F0-ATP合酶复合物 ( ATP合酶 )是一种主要
分布于线粒体内膜、叶绿体类囊体膜和细菌质膜上
的酶;它参与氧化磷酸化与光合磷酸化反应,催化合
成生物体的能量 /通货 0) ) ) ATP, 是生物体能量代
谢的关键酶。ATP合酶包括突出于膜外的 F1单位
和嵌于膜内的 F0单位,二者通过一个中央茎杆和一
个外围柄紧密联系。在大肠杆菌、叶绿体和牛心线
粒体中, ATP合酶分别由 8、9和 16种不同的亚基组
成。到目前为止,有关线粒体 ATP合酶 D亚基的研
究还比较少, 主要集中在牛心线粒体 ATP合酶上,
真菌线粒体 ATP合酶 D亚基功能的研究还未见报
道。 1987年, W alker和 Runsw ick[ 16 ]首次对牛心线
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
粒体 ATP合酶 D亚基序列特征进行了描述, 发现 D
亚基具有 160个氨基酸, N端的丙氨酸被 N-乙酰基
团封闭起来;体外试验研究表明, 成熟的 D亚基定
位于线粒体内膜上, 而序列分析表明没有任何靶序
列便于其进入线粒体。在我们的研究中, 蛋白亚细
胞定位分析表明, A lATP7没有信号肽和前肽,但其
定位于线粒体的可能性为 50%, 这种差异可能是由
于不同软件的算法不同造成的。基于牛心线粒体
ATP合酶 D亚基的序列特征、亚细胞定位和线粒体
ATP合酶相对保守的亚基组成和结构, 推测 A lATP7
可能定位于 A. long ipes线粒体内膜内侧。此外, 牛
心线粒体 ATP合酶 D亚基结构研究发现,边缘柄包
含单一拷贝的 OSCP、B、D和 F6亚基, 并且 OSCP与
B、D亚基联系起来,可能形成一个环绕中心转轴的
环形双螺旋结构 [ 17, 18 ]。通过体外晶体结构研究表
明,牛心线粒体 D亚基第 3- 123个氨基酸以 A-he-
lix为主, 并且通过 A-helix与 B和 F6亚基相互作
用 [ 19]。虽然 D亚基具体的功能还不清楚,但它是真
菌、植物和动物等线粒体 ATP合酶的组成部分, 参
与细胞的 ATP合成是毫无疑问的事实。
柠檬酸合成酶是三羧酸循环中的一种重要酶,
它能在没有金属离子辅因子存在的条件下催化乙酰
辅酶 A和草酰乙酸缩合生成柠檬酸。目前不同物
种来源的柠檬酸合成酶基因得到了克隆。早在
1994年, Ferea等 [ 20]就从模式丝状真菌 N. crassa中
克隆得到了一个柠檬酸合成酶基因 ci-t 1, 发现其定
位于线粒体中。后来的研究发现,在真核生物中,柠
檬酸合成酶有两种同工酶, 一种存在于线粒体基质
中,另一种定位于胞质中。本研究中, 从 A. longipes
中克隆得到了一个同源于 ci-t 1的基因 ) ) ) A lCIT1。
然而, 由于未完全获得 A lC IT1的 5c端氨基酸序列,
所以不能用软件预测 A lC IT1的亚细胞定位,但基于
A lCIT1和定位于线粒体中的其他丝状真菌柠檬酸
合成酶的高同源性特征 (图 1-C ) ,推测 A lCIT1应该
是 A. long ip es的线粒体类型同工酶。同时, 由于柠
檬酸合成酶是三羧酸循环的限速酶, 且三羧酸循环
是有氧呼吸生物提供能量的主要方式,所以 A lC IT1
应该与 A. long ipes的能量代谢和内源物质合成等诸
多生物功能有着密切的关系。
糖转运子家族是生物体细胞糖转运的主要媒
介, 目前真核真菌系统糖转运子的研究在 S. cerevisi-
ae中得到了广泛开展。酵母己糖转运子、哺乳动物
糖转运子和细菌糖转运子都是 MFS的成员, 它们都
定位于细胞膜上, 序列上显示出较高的同源性 [ 21, 22 ]。
MFS是生物体中两个最大膜转运子家族之一, 广泛
存在于细菌、古菌和真核生物中。MFS最初被认为
主要与糖的吸收有关,而后续的研究发现,药物流出
系统、三羧酸循环代谢物、有机磷酸酯:磷酸盐交换
器、低聚糖: H1反向转运渗透酶和细菌芳香酸渗透
酶都是 MFS成员, 说明 MFS的功能远远超出了最
初的设想。系统进化和结构分析发现, M FS中存在
17个明显不同的亚类,并且所有的 MFS渗透酶拥有
12- 14个 A-he lix跨膜区,其中在第 2和第 3个跨膜
区存在一个非常保守的基序, 该基序是系统进化分
类的主要依据 [ 23]。本研究从 A. long ip es中克隆了同
源于 MFS类型的葡萄糖转运子 A lGLUT 5c端缺失
215个左右碱基, 包括终止密码子的 1 308 bp长度
的 DNA序列。PHDhtm预测该序列有 10个跨膜区;
进一步的序列分析发现, 在第一个跨膜区上游存在
着 / GPLAGKYGRLRAM 0保守基序, 这些结果说明
A lGLUT部分序列的第一个跨膜区应该是 A lGLUT
全长序列的第 3个跨膜区; 另外,根据 Pao等 [ 23]的
分类标准,该 A lGLUT应该属于 17类中的 SP亚类。
据报道, S. cerevisiae中存在 34个糖转运子的同源
物,这些同源物中有 16个的功能目前还不知道,剩下
的与糖的转运和多药的抗性相关 [ 24- 26]。根据以上结
果,我们推测 A lGLUT可能介导 A. longip es的葡萄糖
转运以及通过外排机制授予对 DCFs的抗性。
热休克蛋白是一组在进化上高度保守的蛋白
质, 广泛存在于自然界原核、真核细胞中,在细胞生
长、发育、分化和基因转录, 蛋白质合成、折叠、分解
和细胞骨架功能等方面发挥重要生理作用。根据相
对分子质量,主要的热休克蛋白被分成 6个家族, 其
中 HSP70家族是最保守和最重要的一族, 在细胞中
发挥多种生物学功能,包括分子伴侣功能、参与肿瘤
免疫、抗细胞凋亡功能、提高细胞的应激耐受性和促
进细胞增殖等 [ 27, 28]。丝状真菌热休克蛋白 HSP88
最早在N. crassa中发现 [ 29 ]。HSP88能与小分子量
热休克蛋白 HSP30作用, 并且序列分析发现, 在其
氨基酸 N端具有 5个与 ATP合酶结合相关的保守
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2011年第 5期 罗义勇等:长柄链格孢四个二甲酰亚胺类杀菌剂胁迫差异表达基因的克隆与序列分析
基序 ) ) ) Phosphate 1、Connect 1、Phosphate 2、Adeno-
sine和 Connect 2[ 30]。本研究从 A. long ip es中克隆了
一个高度同源于 HSP88基因的热休克蛋白基因
AHl SP88的部分序列,序列分析发现,在其氨基酸中
含有一个热休克蛋白 HSP70蛋白家族标签 3, 说明
AHl SP88应该具有 HSP70家族大部分生物学功能,
如分子伴侣等;进一步研究发现, A Hl SP88氨基酸序
列 N端具有 4个和 N. crassa一样的 ATP合酶结合
位点 (图 1-B) ,另外的 1个位点应该存在于 N端未
获得的序列中, 这些结果说明 AHl SP88行使生物学
功能需要 ATP提供能量。
基于 A lATP7、A lC IT1、A lGLUT和 AHl SP88基因
构建的进化树形状大体相同以及 A. longipes、P. triti-
ci-repentis和 P. nodorum 3个物种进化树与传统物种
树的拓扑结构基本一致, 说明 A lATP7、A lC IT1、A -l
GLUT和 AHl SP88基因在用于物种间特别是目级分
类单元物种间的系统进化关系研究中具有一定的实
际意义。综上所述, 根据 A lATP7、A lCIT1、A lGLUT
和 AHl SP88基因生物学功能的文献报道、序列特征
以及微生物药物耐受机制的研究 [ 31] , 推测 A. longi-
p es可能存在着一种新的 DCFs抗性机制, 即在线粒
体 ATP合酶和柠檬酸合成酶参与能量供给的条件
下, A. longipes利用 MFS类型葡萄糖转运子将 DCFs
排除到细胞外,解除或降低 DCFs的毒性, 其中热休
克蛋白 HSP88可能在该机制中促进一些必须蛋白
的正确折叠和修复过程中发挥重要作用, 然而该假
设需要进一步的试验证据进行证实。
参 考 文 献
[ 1] Fu jim uraM, Och iaiN, Ich iish iA, et a.l Sens itiv ity to ph enylpyrrole
fungicides and abnorm al glycerol accum u lat ion in os and cut m utan t
s trains ofN eurospora crassa. Jou rnal of Pest icide Science, 2000, 25
( 1) : 31-36.
[ 2] Luo YY, ZhuML, Y ang JK, et a.l A sp reading colony form edm ethod
for rap id evaluat ion of d icarboxim ide fungicides res istan ce level of
field tobacco b row n spot d isease. Annals ofM icrob io logy, 2009, 59
( 1) : 173-177.
[ 3] Pomm er EH, Lorenz G. R es istan ce ofB otrytis cinerea Pers. to d icar-
box im id e fungicides-a literature review. C rop Protection, 1982, 1
( 2) : 221-230.
[ 4] Rosenb erger DA, M eyer FW. Posth arves t fung icides for app les: d eve-l
opm en t of resistance to benomy,l vinclozolin, and ip rod ione. P lan t
D isease, 1981, 65( 12) : 1010-1013.
[ 5] AvenotH, S im on eau P, Iacom -iV as ilescu B, et a.l Characterization of
m u tat ions in the tw o-com ponen t h ist id ine kinase gene A bNIK 1 from
A lternaria brassic icola that confer h igh d icarb oxim ide and phenylpyr-
role res istance. C urren tGen et ics, 2005, 47( 4 ): 234-243.
[ 6] M a ZH, Luo Y, M ichail ides T. M olecu lar characterizat ion of the tw o-
com ponen t h is tid ine k inase gene fromM on ilin ia f ru cticola. PestM an-
agemen t S cien ce, 2006, 62 ( 10) : 991-998.
[ 7] Yosh im iA, T suda M, Tanaka C. C lon ing and characterization of the
h ist id ine k inase gene Dic1 from Coch liobolus he terostrophu s that con-
fers d icarb oxim ide res istan ce and osm otic adaptation. M olecu lar Ge-
n et ics and G enom ics, 2004, 271( 2) : 228-236.
[ 8] Luo YY, Yang JK, ZhuML, et a.l Characterizat ion ofm utations inA l-
HK 1 gene from A lternaria long ipes: im pl icat ion of lim ited fun ct ion of
tw o-com ponen t h ist id ine k inase on con ferring d icarboxim ide res is-t
ance. Jou rnal of M icrob iology and B iotechnology, 2008, 18 ( 1 ):
15-22.
[ 9] 罗义勇,祝明亮,路则宝, 等.长柄链格孢 A lCyP1基因克隆及其
在渗透胁迫适应中的作用.浙江大学学报: 农业与生命科学版,
2011, 37( 2 ): 133-141.
[ 10] Zhang D, Yang Y, Cast lebury LA, et a.l A m ethod for the large scale
isolat ion of h igh transform at ion ef ficiency fungal genom ic DNA.
FEMS M icrob iology Letters, 1996, 145 ( 2) : 216-265.
[ 11] Thom pson JD, G ibson TJ, Plew n iak F, et a.l Th e CLU STAL _X w in-
dow s in terface: flex ib le strategies for m ult ip le sequen ce al ignm ent
aided by quality analysis tools. Nucleic A cids R esearch, 1997, 25
( 24) : 4876-4882.
[ 12] S aitou N, N eiM . Th e neighbor-join ing m ethod: a new m ethod for re-
con struction phylogent ic trees. M olecu lar B iology and E volu t ion,
1987, 4( 4 ) : 406-425.
[ 13] Kum ar S, Tam ura K, N eiM. MEGA3: In tegrated softw are form olec-
u lar evolu t ionary genetics analys is and sequen ce alignm ent. Brief
B ioin form at ics, 2004, 5( 2 ) : 150-163.
[ 14] K arpu sasM, Bran chaud B, Rem ington S J. P roposedm echan ism for
the cond ensation react ion of citrate synthase: 1. 9-stru cture of the
ternary com p lex w ith oxaloacetate and carboxym ethyl coen zym e A.
B iochem istry, 1990, 29 ( 9) : 2213-2219.
[ 15] 罗义勇.烟草赤星病病原真菌对二甲酰亚胺类杀菌剂的抗药性
分子机理研究 [ D ].昆明:云南大学, 2009: 84-85.
[ 16] W alker JE, Runsw ick M J. ATP syn thase from bovine m itochondria
the characterization and sequen ce analys is of tw om em brane-assoc-i
ated subun its and of th e corresponding cDNAs. Jou rnal ofM olecu lar
B iolology, 1987, 197( 1 ) : 89-100.
[ 17] C olinson IR, Sk ehel JM, Fearn ley IM , et a.l Th e F1 F0-ATPase com-
p lex from b ovin e h eartm itochond ria: th em olar rat io of th e subun its
in th e sta lk reg ion l ink ing the F1 and F0 dom ain s. B iochem ist ry,
1996, 35( 38 ): 12640-12646.
221
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
[ 18 ] Gab allo A, Zanott iF, Papa S. S tructu res and in teractions of p roteins
involved in the coupl ing function of th e protonmot ive F1 F0-ATP
syn thase. C urren t Protein and Pep tid e Science, 2002, 3 ( 4 ) :
451-460.
[ 19 ] D icksonVK, S ilvester JA, Fearn ley IM, et a.l On th e s tru cture of the
s tator of the m itochondrial ATP syn th ase. The EMBO Journa,l
2006, 25( 12) : 2911-2918.
[ 20 ] Ferea T, Con treras ET, Oung T, et a.l Characterization of the c it-1
gene fromN eurospora crassa encod ing them itochond rial form of ci-t
rate syn thase. M olecu lar and GeneralG enetics, 1994, 242( 1 ) : 105-
110.
[ 21 ] M aidenMCJ, DavisEO, B aldw in SA, et a.lM amm alian and bacter-i
al sugar tran sport p roteins are hom ologou s. Natu re, 1987, 325
( 6105 ): 641-643.
[ 22 ] H enderson PJF. Sugar transport proteins. Curren tOp in ion in Stru c-
turalB iolo logy, 1991, 1 ( 4) : 590-601.
[ 23 ] Pao SS, Pau lsen IT, S aier Jr MH. M ajor facil itator sup erfam ily. M -i
crob io logy andM olecu lar B iology Review s, 1998, 62( 1 ) : 1-34.
[ 24 ] Andre B. An overview ofm emb rane tran sport protein s in Saccharo-
m yce s cerevisia e. Yeast, 1995, 11 ( 16) : 1575-1611.
[ 25 ] Nou ran iA, W esolow sk-i LouvelM, Delaveau T, et a.l M u litp le drug
res istan ce ph enom enon in the yeast Saccharomyces cerevisia e: in-
vo lvem en t of tw o hexose transporters. M olecu lar andC ellu lar B iolo-l
ogy, 1997, 17 ( 9) : 5453-5460.
[ 26] W ieczorke R, K ram pe S, W eiersta llT, et a.l Con current knock-out
of at least 20 tran sporter gen es is requ ired to b lock uptake of hexo-
ses in Saccharom yces cerevisia e. FEBS Letters, 1999, 464 ( 3 ):
123-128.
[ 27] K iang JG, TsokosGC. H eat shock protein 70 kDa: m olecu lar b iolo-
gy, b ioch em istry, and phys iology. Pharm acology & Therapeu tics,
1998, 80( 2 ): 183-201.
[ 28] Shan er L, Morano KA. A ll in the fam ily: atypicalH sp70 chaperones
are con servedm odu lators ofH sp70 activity. C ellS tress and Chaper-
ones, 2007, 12( 1) : 1-8.
[ 29 ] P lesofsky-V ig N, Bramb l R. Characterization of an 88-kDa heat
shock protein ofN eurospora cra ssa th at in teracts w ith H sp30. The
Journal ofB iologicalC hem istry, 1998, 273( 18 ): 11335-11341.
[ 30] Bork P, Sand er C, Valencia A. An ATPase doma in comm on to p ro-
k aryotic cel l cycle proteins, sugar k inases, act in, and hsp70 heat
shock proteins. Proceedings of the NationalA cadem y of S ciences of
the Un ited S tates ofAm erica, 1992, 89( 16 ) : 7290-7294.
[ 31] M cK eegan KS, Borges-W alm s ley M I, Walm sley AR. M icrob ial and
viral drug resistance m ech an ism s. Trend s inM icrob iology, 2002, 10
( 10) : S8-S14.
(责任编辑 马鑫 )
(上接第 208页 )
复性途径。对表达的 h IL-4包涵体复性条件和方法
进行研究,尝试稀释复性和透析复性等方法,发现稀
释复性更适合 hIL-4包涵体, 经过复性后, hIL-4复
性率可达到 15%以上。蛋白纯化后经生物活性鉴
定发现,复性的重组 hIL-4生物比活性可达到 5 @
10
6
U /mg以上, 等同或者优于国外的同类产品。
参 考 文 献
[ 1 ] Yodota T, Otsuka T, Mosm ann T, et a.l Isolat ion and characterizat ion
of a hum an in terleuk in cDNA clon e, hom ologous to m ou se B-cell
st im ulatory factor 1, that expresses B-cel-l and T-cel-l st imu latory ac-
t iv it ies. Proc NatlA cad SciUSA, 1986, 83( 16 ): 5894-5898.
[ 2] Rook GAW, H ernandez-Pando R, Dhed a K, et a.l IL-4 in tub erculo-
sis: im p lications for vaccine d es ign. Trends Immuno,l 2004, 25( 9 ):
483-488.
[ 3] M art in R. In terleuk in 4 treatm ent of psorias is: are p leiotrop ic cyto-
k in es su itab le therap ies for autoimmune d iseases?. T rends in Phar-
m acological Sciences, 2003, 24( 12) : 613-616.
[ 4] 查磊,应晓敏,曹源,等. B ioSun210:一个综合性的辅助分子生物
学实验设计软件.军事医学科学院院刊, 2006, 30( 5 ) : 461-464.
[ 5] 黄欣,赵忠良,曹雪涛.人白细胞介素 4在大肠杆菌中的优化表
达.中国免疫学杂志 1999, 15 ( 9) : 405-407.
(责任编辑 马鑫 )
222