全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
防御素构效关系研究进展
王少然 杨雅麟 张军 王建华
(中国农业科学院饲料研究所 农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京 100081)
摘 要: 防御素是第一大类内源性抗微生物肽，具有广泛的抗菌谱作用，是生物体先天防御系统的重要组成成分。综
述了近年国际上对防御素的一级结构、二级结构、三级结构和四级结构及其构效关系研究的最新进展。
关键词: 防御素 分子结构 抗菌活性 构效关系
Advances on Structure-activity Relationships of Defensins
Wang Shaoran Yang Yalin Zhang Jun Wang Jianhua
(Key Laboratory of Feed Biotechnology of MOA，Feed Research Institute，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081)
Abstract: Defensins are endogenous antimicrobial polypeptides and have broad wide spectrum of antibacterial activity that play a
crucial role in the innate immune system． The primary，secondary，tertiary and quarternary structure of denfensins，and their structure-ac-
tivity relationships were reviewed．
Key words: Defensin Molecular structure Antimicrobial activity Structure-activity relationships
收稿日期:2010-11-05
基金项目:国家自然科学基金项目(30972125，30771574，30810303084，31001026) ，北京市自然科学基金项目(5062031，5093030)
作者简介:王少然，女，硕士研究生，研究方向:抗菌肽分子生物学;E-mail:shaoran581@ 163． com
通讯作者:杨雅麟，女，博士，助理研究员，研究方向:抗菌肽分子生物学;E-mail:yangyalin@ caas． net． cn
王建华，男，研究员，博士生导师，研究方向:微生物生物技术;E-mail:jhwangfribio@ yahoo． com． cn
防御素(defensins)是广泛存在于生物体中的一
种宿主防御肽(host defense peptide) ，构成机体抵御
病原微生物入侵的第一道防线，分子量 2 － 6 kD，富
含正电荷氨基酸残基，含 6 － 8 个保守半胱氨酸残基
(Cys)形成 3 － 4 对二硫键。1985 年，Selsted 等［1］首
次从人嗜中性白细胞分离纯化出 3 种阳离子小肽
HNP-1、HNP-2 和 HNP-3，将它们与以前从兔和豚鼠
分离的同类小肽一起命名为防御素。防御素为第一
大类抗菌肽，迄今共发现 566 种(http:/ /defensins．
bii． a-star． edu． sg /) ，约占已报道抗菌肽总数 1 /3。
依来源分 6 个家族:哺乳动物源、植物源、无脊椎
动物源防御素、类防御素、大防御素及其他防御素
(表 1)。图 1 为 6 个家族防御素的典型三维结构。
防御素具有抗菌作用、抗病毒作用和趋化作用、免
疫调节作用［2 － 5］等多种生物学功能，其中以高效
广谱抗菌功能最重要。研究发现，防御素对革兰
氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、被膜病毒、螺
旋菌以及恶性肿瘤细胞等多种微生物都具杀伤作
用［6，7］。防御素作为抗菌新药的研究成为抗菌肽研
究热点。
表 1 不同来源的防御素种类数
防御素种类 数量
哺乳动物防御素 α-防御素 79
β-防御素 189
θ-防御素 5
植物 防御素 61
无脊椎动物防御素 昆虫防御素 118
非昆虫防御素 63
类防御素 6
大防御素 6
其他 43
2011 年第 4 期 王少然等:防御素构效关系研究进展
防御素代表分子的结构从蛋白质数据库下载(http:/ /www． rcsb． org /pdb，PDB 登录号分别为:HNP-1． 2PM1;HBD-3． 1KJ6;RTD-1．
1HVZ;Rs-AFP1． 1AYJ;Heliomicin． 112U;Plectasin． 1ZFU;DLP-2． 1D6B;Big defensin． 2RNG;TEWP． 2B5B) ，三维结构是应用 Protein
workshop软件生成
图 1 脊椎动物、植物、无脊椎动物、类防御素、大防御素和其他六类防御素的三维结构
1 防御素的一级结构及其与功能的关系
防御素一级结构即多肽链中氨基酸残基组成。
不同类型氨基酸残基对防御素抗菌功能实现作用不
同，可分为结构残基和功能残基。
1． 1 结构残基
结构残基是一类与防御素高级结构稳定性紧密
相关的氨基酸残基，该类氨基酸残基高度保守。Ni-
kolinka等［8］对 80 种来源于灵长类的防御素进行序
列同源性分析发现 Cys 残基高度保守。高含量 Cys
可能决定防御素 pH稳定性和热稳定性［9］。如帝企
鹅体胃内的防御素 Sphe-1 和 Sphe-2，在胃酸性 pH
值条件下仍保持抑菌活性［10］。鸭防御素 AvBD2 在
－20℃ －100℃和 pH3. 0 － 12. 0 的范围内依然对金
黄色葡萄球菌保持抑菌活性［11］。除 Cys 残基外，防
御素序列中某些甘氨酸残基(Gly)也高度保守。这
是由于防御素高级结构中存在的一些 Loop 结构，使
无侧链的 Gly 残基更易被选择。Finn 等［12］通过比
对来源于人、鼠和牛的防御素序列发现，保守的 Gly
残基有利于 Loop区转角结构的回折，从而保证了结
构稳定性。
1. 2 功能残基
与防御素抗菌功能密切相关的一类氨基酸残
基即功能残基，主要包括带电荷氨基酸残基和疏
水性氨基酸残基，它们决定防御素抗菌功能特异
性、盐离子敏感性。但这类残基对维持防御素构
型和构象的稳定性作用不大。如分别将人防御素
HBD-1 和 HBD-2 中的谷氨酸残基(Glu)和异亮氨
酸残基(Ile)位置互换之后，发现其扭曲结构未受
到影响［12］。
多肽链中带电荷氨基酸残基的数量决定了防御
素分子的净电荷数，进而影响其抗菌活性。Céline
等［13］以 5 种昆虫防御素为模板合成一系列杂合防
御素发现，带正电荷最高者抗菌活性最强。另有研
究表明，随着人防御素 HBD-1、HBD-2 和 HBD-3 净
电荷数从 + 4 到 + 6，再到 + 11，抗菌活性相应增
强［14］。同时，高正电荷使防御素对盐离子耐受能力
增强。如来源于帝企鹅胃带有 10 个净电荷的 β 防
御素 Sphe-2 在高浓度 NaCl下依然保持对金黄色葡
萄球菌和大肠杆菌的高抗活性［10］。带 11 个净电荷
的人防御素 HBD-3 也是盐不敏感型防御素，在生理
盐浓度下可抑制具多重抗性的金黄色葡萄球菌的生
长［15］。而净电荷数较少的人防御素 HBD-4 在低盐
浓度条件下(Na + 95 mEq /L，Cl － 90 mEq /L，K + 25
mEq /L)对绿脓杆菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度
(MIC)分别为(1. 3 ± 0. 6)μg /mL 和(9. 1 ± 3. 5)
μg /mL;而在高盐浓度条件下(Na + 137 mEq /L，Cl －
130 mEq /L，K + 4. 2 mEq /L)其对绿脓杆菌和大肠杆
菌的抑菌活性大大减弱，MIC 分别为 ＞ 500 μg /mL
和(147 ± 31)μg /mL［16］。带正电荷氨基酸残基的
加入会增强防御素抗菌能力，正电荷氨基酸残基数
目与抗菌活性有线性关系。研究发现，在无抗菌活
性的防御素 HNPa 的 C-末端插入 2 个精氨酸残基
(Arg)的 HNPb和同时在 C端，N端插入 2 个 Arg残
基的 HNPe 的抗菌活性均显著提高，且 HNPe 抗菌
活性比 HNPb高 24 倍［17］。而删除大黄粉虫防御素
Tenecin 1 活性片段 TE-(34 － 43)和 TE-(33 － 43)C
端的 Arg残基，抗菌活性完全丧失［18］。这是因为带
正电荷氨基酸残基的加入使分子净电荷数增大，促
14
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
进了防御素分子与细菌细胞膜互作进而使膜破
裂［17，19］。相反，负电荷氨基酸残基的加入对防御素
抗菌活性具负效应，如在防御素 HNP-2 的 N端和 C
端分别插入 2 个天冬氨酸残基(Asp)合成 HNPa，其
抗菌活性几乎全部丧失［17］。Tanabe 等［19］发现，Arg
残基是小鼠潘氏细胞 α-防御素 Crp4 活性的决定因
素，将 Crp4 的 Arg残基进行电荷反向突变为 Asp 残
基后，其对所有受试菌株的杀菌活性均减弱或丧失。
疏水性氨基酸是另一类与防御素功能相关的残
基。防御素分子整体疏水性是决定其抗菌活性的重
要因素之一，疏水性氨基酸残基有助于提高防御素
抗菌活性。Klüver等［20］用色氨酸残基(Trp)分别替
代 N和 C端片段的特定氨基酸残基合成人防御素
HBD-3 衍生物 L3W和 L4W，发现其对 G －菌如大肠
杆菌、肺炎克氏杆菌、绿脓杆菌和 G +菌如金黄色葡
萄球菌、肺炎链球菌的 MIC明显低于天然 HBD-3 的
N和 C端肽段。但是疏水性氨基酸残基含量过高会
增强防御素分子与真核细胞膜互作，产生溶血性和
细胞毒性［21］。所以设计合适的整体疏水性对于筛
选安全而有效的防御素源抗菌分子十分重要。
2 防御素二级结构及其与功能的关系
防御素二级结构多含一个 α-螺旋结构和一对
反向平行的 β-折叠片层结构以及螺旋和折叠结构
之间的 Loop区。不同二级结构对防御素功能实现
的作用存在差异。
防御素分子中 α-螺旋具两亲性，即一面由疏水
残基组成，另一面由亲水性残基组成。该结构有助于
防御素分子锚定于靶生物细胞膜。在膜模拟介质中，
人防御素 HBD-3类似物 Def-A可将螺旋结构插入细
菌细胞膜，通过破坏细胞膜发挥抑菌活性［22］。且随
着防御素中 α-螺旋结构含量提高，抗菌活性相应加
强。据报道在 pH7. 5 －8. 0介质中的昆虫防御素结构
中 α-螺旋结构含量最高，抗菌活性也最强［23］。
β-折叠结构区域富含带正电荷残基。人防御素
HBD-3、HBD-1 和兔防御素 NP-2 的 C 端 β-折叠区
域的肽段具抗菌活性［24 － 26］。无翅红蝽防御素 PA
的 C端 β-折叠肽段包含了母本分子所有抗菌活性，
而毛白钝缘蜱防御素 OM-C 的 C 端 β-折叠肽段具
有比母本更广的抗菌谱，对受试的 G +菌和 G －菌均
具抗性，而母本分子 OM-C 只抗 G －菌［27］。但 β-折
叠结构的刚性强度对防御素结构和抗菌活性影响复
杂:一方面二硫键有助于分子中 β-折叠区域结构稳
定;另一方面含有弱刚性 β-折叠结构(含 1 个二硫
键)的牛防御素 BNBD-12 突变体 cy22 和 cy26 反而
比含有较强刚性 β-折叠结构(含 2 － 3 个二硫键)的
突变体 cy28、cy28’和 BNBD-12’的抗大肠杆菌活性
更高［28］。
Loop区构象和柔韧性对防御素抗菌性具决定
作用，高柔性 Loop 区促进肽与其靶受体互作［13］。
Romestand等［29］报道蚌类防御素 Loop区在与 G +菌
结合、抑制细菌生长及破坏细菌正常渗透压方面起
关键作用。
防御素 α-螺旋和 β-折叠均具两亲性，大多数抗
菌蛋白或多肽都含有两亲性的 α-螺旋或 β-折叠，此
结构特征有利于与微生物细胞膜互作，两亲性结构
和较高含量的净电荷数都是防御素实现抗菌功能的
必备条件［27］。Lee等［18］分别合成了防御素 tenecin1
的 α-螺旋和 C端 β-折叠肽段，抗菌活性分析发现，
净电荷较低的 α-螺旋肽段(+ 1)不具抗菌活性，而
带有 5 个净电荷的 β-折叠区域肽段具有比母本分
子更广的抗菌谱，对真菌、G +菌和 G －菌均具一定杀
伤作用，而母本分子 Tenecin1 只对 G +菌有抗性。
3 防御素三级结构及其与功能的关系
防御素三级结构包含一个典型的 CSαβ 结构，
即二硫键稳定的 α-螺旋和 β-折叠结构。整个分子
呈“篮子”状:“篮子”开口端是由 C 和 N 端氨基酸
残基组成的极性面，底部是两亲性结构的非极性部
分［17］。尽管防御素一级结构存在较大差异，但蛋白
晶体结构分析发现其空间结构相似度较高，这依赖
于防御素分子中保守的半胱氨酸残基形成的二硫键
构成的支架，支撑了这种序列的高度可变性［8］。
二硫键是防御素共有特征，其对防御素抗菌功
能的作用机制尚不清楚。对某些防御素来说改变二
硫键连接方式或氧化还原状态并不影响抗菌功能。
研究发现，将 HBD-3 的 3 个二硫键连接方式 1-5，2-
4 和 3-6 改为 1-6，2-5 和 3-4，其抗菌活性未受影
响［24］。Maemoto等［30］通过“Ala 突变”成对半胱氨
酸构建了鼠防御素 Crp4 的一系列二硫键变异体，抗
菌活性均未丧失。另有报道，二硫键是某些防御素
抗菌功能的必需因素。如 Lee 等［31］通过二硫键的
24
2011 年第 4 期 王少然等:防御素构效关系研究进展
氧化还原研究发现，该结构的存在对昆虫防御素
Tenecin1 发挥抗菌作用至关重要。类似结果在昆虫
防御素 Gomesin 二硫键的氧化还原研究中得到证
实［32］。但二硫键对防御素的趋化性是必要的。Wu
等［33］发现人防御素 HBD-3 中的二硫键对趋化性中
结合和激活受体必不可缺，不含二硫键的 HBD-3 线
性肽的趋化性丧失。Mandal 等［34］分别对含 1 对、2
对和 3 对二硫键的防御素 HNP-1 进行功能鉴定，结
果表明二硫键对其趋化作用起关键作用。
二硫键的存在对防御素分子正确折叠和空间结
构稳定起重要作用。Schibli等［15］研究证实，用 DTT
还原人防御素 HBD-3 中的二硫键会导致其三级结
构破坏。缺少 1 对二硫键的人防御素 hBD-1
(Ser35)的三级结构不稳定，在水溶液中呈无规则卷
曲状态［35］。二硫键还可以使小分子防御素紧密连
接以抵抗蛋白酶降解。研究发现，氧化型人防御素
HD-5 前体能抵抗胰岛素酶降解，而用 DTT 还原二
硫键后，结构稳定性下降，对胰岛素酶敏感性增
强［36］。另据报道，小鼠 α-防御素具有的抗蛋白酶降
解能力也源于分子内二硫键［30］。
4 防御素四级结构及其与功能的关系
防御素单体间二聚化可形成二聚体，即四级结
构。研究表明，氧化型防御素分子浓度达微克级时，
单体间存在二聚化趋势，推测二聚体可能是一种更
稳定的存在形式［8］。防御素四级结构的形成，使防
御素电荷表面和疏水表面的结构发生变化，进而影
响抗菌功能。
防御素二聚化形式有两种:一是利用单体间带
正负电荷氨基酸形成盐桥，通过非共价交联的盐键
形成二聚体。Schibli 等［15］分析发现人防御素 hBD-
3 由其第 27 和 28 位 Glu 与相邻单体中 17 位和 32
位 Lys通过盐桥形成二聚体。以二聚体形式存在的
HBD-3 对金黄色葡萄球菌的抗菌活性优于单体［37］，
还可在生理盐浓度下发挥作用［15］。另一种二聚体
的形成方式是通过 2 个单体分子的 Cys形成分子间
二硫键，以共价交联方式形成二聚体。Nikolinka
等［8］通过将防御素 tBD的一个 Cys突变成 Ser，发现
两个突变 tBD之间可通过剩余的一个 Cys共价连接
形成二聚体，其抗菌活性在同等条件下高于单体。
Campopiano等［38］研究含 5 个 Cys 残基的 β-防御素
Defr1 发现，两单体间可通过未配对的 Cys之间形成
二硫键完成二聚化。
两种连接方式形成的防御素二聚体在稳定性、
抗菌活性和盐离子耐受力方面均优于单体［8，15］，
其中以共价交联方式二聚化的防御素分子优于盐
键方式的二聚化产物［38］。研究发现，通过共价交
联方式形成二聚体的 Defr1 对 G +菌，如绿脓杆菌、
大肠杆菌;G －菌，如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌及
真菌白色念珠菌的最小杀菌浓度(MBC)均低于以
盐桥方式进行二聚化的 Defr1 Y5C。其中 Defr1 在
300 mmol /L NaCl下依然对绿脓杆菌保有约 30%杀
菌活性，而 Defr1 Y5C 在 25 mmol /L NaCl 下对绿脓
杆菌仅保持约 12%杀菌活性［38］。二聚体形成一方
面使两单体的疏水部分靠近，形成更大的疏水斑，有
利于发挥更强的抗菌作用;另一方面由于带电荷氨
基酸残基的相互靠近，形成了更大的离子表面，使分
子抗菌能力、对高盐离子耐受能力得以增强［15］。
5 结语
防御素结构功能关系是改造和设计理想抗菌分
子的理论依据。表 2 总结了前人关于防御素各级结
构功能关系的研究结果，包括一级结构中带电荷氨
基酸残基和疏水性氨基酸残基、二级结构中两亲性
的 α-螺旋和 β-折叠结构以及稳定三级和四级结构
的分子内及分子间二硫键等因素对抗菌功能的影
响;在新药分子设计中，既要通过对净电荷数、疏水
性、两亲性及二硫键的修饰突变达到改善防御素抗
菌活性、稳定性和盐离子耐受能力等目的，也要从模
板防御素特性和设计目的等方面综合考虑，优化分
子结构，契合目标功能要求。
防御素作为抗菌肽的新药研发的优势表现在:
(1)分子小且结构稳定，是研制多肽新药理想的分
子骨架和模板; (2)直接作用于病原体细胞膜发挥
抗菌功能这一特殊机制使靶细胞不会对其产生抗
性，为治疗耐药病原菌感染带来希望; (3)进攻靶膜
的物理性、与胞内靶位点结合的生化特异性、二硫键
主导的 α-螺旋、β-折叠、Loop 区的协同抗菌机制等
一系列特征，使其在抗菌肽中得以率先揭示抗菌机
制;(4)较温和的化学性质使其比其他强离子型抗
菌肽更易于人工合成或转基因操作，并率先进入临
床试验和应用阶段。
34
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
表 2 防御素结构与功能的关系
结构特征 对抗菌功能的影响 参考文献
一级结构
结构残基
功能
残基
带电荷氨基酸
疏水性氨基酸
Cys
通过形成二硫键控制防御素分子骨架形成，稳定高级
结构
Gly 存在于转角结构中，对功能无影响
净电荷 提高抗菌活性，和对盐离子耐受能力
Arg 促进与膜互作，增强抗菌活性
Asp 降低分子净电荷，削弱抗菌活性
Trp 增强整体疏水性，强化分子抗菌和溶血性
［8 － 11］
［12］
［10，13 － 16］
［17 － 19］
［20 － 21］
二级结构 α-螺旋 有助于分子锚定于微生物膜上 ［22 － 23］
β-折叠 与微生物的脂质膜相互作用 ［24 － 28］
Loop区 有利于肽与其相应的受体相互作用 ［13，29］
三级结构
空间“篮子”状结构 与防御素的作用机制有关 ［8，17］
分子内二硫键
稳定高级结构，抵抗蛋白酶消化，影响趋化性，对不同防
御素的抗菌功能的影响不同
［15，24，30 － 36］
四级结构
通过盐桥进行二聚化;通过
分子间二硫键进行二聚化
增强抗菌活性和对盐离子的耐受能力 ［8，15，37 － 38］
总之，基于已知的防御素构效关系，以天然防御
素分子为母本，科学设计定向突变体，运用基因工程
技术研制和生产防御素类新药，无疑是抗菌新药创
制的新途径，具有重要药学意义;尤其是 2010 年
8 － 10月份相继在南亚等国［39］和我国首次发现了无
药可治的超级细菌，面对病原菌耐药性的威胁，打破
新药研制严重滞后于耐药性发展的被动局面成为健
康优先课题，此时尝试以上新药研发技术思路的现
实意义不言而喻。
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(责任编辑 狄艳红)
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