全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-06-17
作者简介：周敏（1983-），女，在读硕士研究生，研究方向为生物大分子的结构、功能制备
通讯作者：王正祥，教授，博士生导师
α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.20）又被
称为 α-葡萄糖苷水解酶或葡萄糖基转移酶（GTase），
是一种 α-D-葡萄糖苷酶。 它可以从低聚糖类底物
的非还原末端切开 α-1，4 糖苷键释放出葡萄糖，或
将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成
α-1，6 糖苷键，从而得到非发酵性的低聚糖 [1，2]。 α-
葡萄糖苷酶来源广泛， 在人体糖原的降解和动植
物、 微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。
不同来源的 α-葡萄糖苷酶能催化水解包括糖蛋白、
双糖、多糖 、淀粉等多种碳水化合物的 α-1，1-、 α-
1，2-、α-1，3-、α-1，4-和 α-1，6-糖苷键 [3]。 其底物专
一性的差异取决于活性中心结合部位的氨基酸构
成。
α-葡萄糖苷酶是一种新型的酶制剂，主要应用
于生产低聚异麦芽糖（IMO），而 IMO 是人类肠道有
益菌群双歧杆菌的增殖因子，是集营养、保健、疗效
于一体的新型淀粉糖 [4]。 在啤酒酿造中加入 α-葡萄
糖苷酶，可使发酵性糖减少、非发酵性糖增多，降低
酒精度，改善啤酒风味 ，因此得到了国内外食品工
业界的关注。 近年来，有学者对不同来源的 α-葡萄
糖苷酶酶学性质进行了研究 [5，6]。 以实验室保藏的
黑曲霉 CICIM F0410 为研究对象，对摇瓶发酵所得
黑曲霉 CICIM F0410中 α-葡萄糖苷酶的酶学性质研究
周敏 王正祥
（江南大学工业生物技术教育部重点实验室 江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，无锡 214122）
摘 要： 研究了黑曲霉（Aspergillus niger）CICIM F0410 发酵粗酶液中 α-葡萄糖苷酶的酶学性质，发现该酶最适
反应温度为 55℃，最适反应 pH值 5.0，在 65℃以下保持酶活力相对稳定，且能在 pH 值（4.0~6.5）范围内保持相对较高的
酶活力。 以该菌株的染色体 DNA为模板，PCR扩增出大小为 3.1 kb的片段，经序列比对发现与 NCBI上已公布的黑曲霉
（Aspergillus niger）CBS513.88（登录号 XP_001402053）序列有 2 个碱基的区别：2272（A→G），3098（T→G），导致 2 个氨基
酸残基的变化：687（Asn→Ser）、983（Ser→Arg）。
关键词： α-葡萄糖苷酶 性质 黑曲霉
Studies on Enzymatic Properties of Alpha-glucosidase in
Aspergillus niger CICIM F0410
Zhou Min Wang Zhengxiang
（Culture and Information Center of Industrial Microorganisms of China Universities，The Key Laboratory of Industrial
Biotechnology，MOE，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract： This paper reported the enzymatic properties of an α-glucosidase in the coarse of Aspergills niger
CICIM F0410.The results showed that the enzyme had an optimum activity at 55℃ and pH 5.0. It was active below
65℃ after being incubated at pH 5.0 for 30 min and relatively stable at pHs ranging from 4.0 to 6.5. A bout 3.1 kb
gene was amplified by the method of PCR which took the genomic DNA of CICIM F0410 as template. After being
blasted at internet，it was founded that there were two different base pairs between CICIM F0410 and CBS 513.88
（gene ID XP_001402053）：2272 （A→G），3098 （T→G）which leading to the change of two different anmio acids 687
（Asn→Ser），983（Ser→Arg）.
Key words： α-glucosidase Property Aspergillus niger
2009年第 1期
粗酶液进行了酶学性质分析研究，同时克隆并分析
了该菌 α-葡萄糖苷酶基因（aglU）序列，为下一步的
分子生物学研究提供参考。
1 材料和方法
1.1 菌株与质粒
黑曲霉（Aspergillus niger）CICIM F0410、宿主菌
大肠杆菌 （Escherichia coli）JM109 由江南大学中国
高校工业微生物资源和信息中心 （http：//cicim-cu.
sytu.edu.cn）保藏 ，克隆载体 pMD19-T 购自大连宝
生物工程有限公司。
1.2 培养基
大肠杆菌 E.coli JM109 菌株的培养使用 LB 培
养基； 糖化酶生产菌株 F0410 的培养使用 TZ 培养
基 （每升含有 3 g 牛肉膏、10 g 蛋白胨、2 g 酵母提
取物、2 g NaCl、20 g 淀粉、17 g 琼脂，pH5.8）； 种子
培养基为改良过的查氏培养基，pH 值为 5.8； 摇瓶
发酵培养基（每升培养基中含 20 g 棉籽粉、10 g 酵
母粉、30 g 葡萄糖，pH5.5）
1.3 主要试剂
T4 DNA 连接酶 、 各种限制性内切酶均为 BBI
产品；Taq DNA 聚合酶、 氨苄青霉素购于上海生工
生物工程公司；PCR 产物纯化试剂盒、 胶回收试剂
盒为上海华舜生物技术有限公司产品；引物由上海
生工生物工程公司合成；α-MG 为 Fluka 公司产品，
HPLC 纯度>99.7%；血糖试剂盒为河北保定临床试
剂有限公司产品；离心超滤浓缩纯化柱为美国密里
博公司产品。
1.4 A.niger CICIM F0410 染色体 DNA 的提取
参见文献[7]。
1.5 A.niger CICIM F0410 α-葡萄糖苷酶基因克隆
根据 GenBank 上报道的黑曲霉 α-葡萄糖苷酶
基因两端的保守序列设计合成如下引物。 aglU1：5′-
atGgATCCATATGGGCGAGCCAGTCACTCTTATCCAC
C-3′，aglU2：5′-atggatcCTACCATTCCAATACCCAGTT
TTCCG-3′。
引物 aglU1 和 aglU2 的 5′端都含有 BamHI 酶
切位点， 以 A.niger CICIM F0410 的染色体 DNA 为
模板， 用 Taq DNA 多聚酶进行 PCR 扩增， 扩增在
0.2 ml PCR 薄壁管中进行。 25 μl 反应体系中加入
0.8 μl 模板 ，2 μl （2.5 mmol/L）dNTPs，上下游引物
（50 μmol/L） 各 0.5 μl；10 ×Taq DNA polymerase
buffer2.5 μl；Taq DNA polymerase 0.3 μl； 灭菌超纯
水补至 25 μl 体系。 PCR 反应条件为 95℃预变性 5
min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，68℃ 3.5 min，30 个循环 ；
68℃最后延伸 10 min。
1.6 α-葡萄糖苷酶的序列测定
将 PCR 扩增出的基因片段连接到 pMD19-T 载
体上，送交上海生工生物工程有限公司测序 ，将测
序结果用 ABI 公司的 Sequence Scanner V1.0 软件
进行分析。
1.7 发酵粗酶液的制备与处理
发酵液定时取样， 选取 α-葡萄糖苷酶分泌最
佳条件时刻 72 h 制得发酵液， 装入离心超滤浓缩
纯化柱，10 000 r/min 10 min 离心收集上清液，除净
发酵液中残留的葡萄糖，进行后续酶学性质研究工
作。
1.8 α-葡萄糖苷酶活力的测定方法
以 α-甲基葡萄糖苷为底物， 取 2%的底物、0.2
mol/LHAc-NaAc 缓冲液各 （pH5.0）2 ml，40℃预热5
min 后， 加入待测酶液 1 ml 混匀， 计时保温 60 min
后 ， 加入 2 ml、0.1 mol/LNaOH 溶液终止反应 。 取
0.1 ml反应液用葡萄糖试剂盒法测定葡萄糖含量[6]。
酶活定义： 在上述反应条件下，1 h 生成 1 μg
葡萄糖为一个活力单位。
1.9 粗酶液中 α-葡萄糖苷酶的酶学性质分析
1.9.1 酶的最适反应温度和温度稳定性测定 pH
5.0 时 ，在不同温度条件下 （35℃～75℃，每 5℃为一
个梯度 ）测定 AglU 的酶活力 ，得到温度-酶活力曲
线，确定酶的最适作用温度；测定酶的温度稳定性
时，在 pH5.0 条件下，将酶液在不同温度下保温 30
min， 测定残余酶活力， 以未处理的原酶液活力为
100%，得到温度-稳定性曲线。
1.9.2 酶最适作用 pH 值和 pH 稳定性的测定 在
40℃反应条件下， 用不同 pH 缓冲液（3.4、4.0、4.5、
5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0） 配 制 2% （W/V）α-
MG 底物溶液 ，测定 AglU 的酶活力 ，得到 pH-酶活
力曲线，确定该酶的最适作用 pH；室温下 ，将酶液
在不同 pH 条件下分别保温 30 min， 测定残余酶活
力，以未处理的原酶液活力为 100%，计算得 pH-稳
定性曲线。
周敏等：黑曲霉 CICIM F0410中 α-葡萄糖苷酶的酶学性质研究 131
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
1.9.3 化学试剂对酶活力的影响 不同金属离子
对酶活力的影响在标准条件下测定，以未处理的原
酶液活力为 100%。 实验中用到的金属离子为 K+、
Mg2+、Al3+、Ca2+、Mn2+、Fe2+，化学试剂为 EDTA（终浓
度均为 0.5 mmol/L）。
2 结果
2.1 A.niger CICIM F0410 α-葡萄糖苷酶基因克
隆与序列分析
以 A.niger CICIM F0410 染色体 DNA 为模板 ，
以 aglU1、aglU2 为引物 ，PCR 扩增出 3.1 kb 左右的
片段（图 1），与预计基因大小相符。 将此 PCR 产物
与载体 pMD19-T 连接 ，转化 E. coli JM109，筛选获
得阳性克隆。 测序结果表明， 该基因片段与 NCBI
中报道的 CBS513.88 的 α-葡萄糖苷酶有两个碱基
的区别：2272（A→G），3098（T→G）导致两个氨基酸
残基的变化，687（Asn→Arg）、983（Ser→Arg）。
2.2 粗酶液中 α-葡萄糖苷酶的酶学性质研究
2.2.1 CICIM F0410 的发酵进程曲线 采用既定
的培养基及发酵条件对黑曲霉 CICIM F0410， 进行
摇瓶发酵，250 ml 摇瓶装液量 50 ml， 一株 3 瓶，每
隔 24 h 取样测定 -葡萄糖苷酶活力。 由结果可以看
出，发酵时间在 72 h 时 ，该菌的 -葡萄糖苷酶活力
相对较高，选取该时段制备的酶液进行后续酶学性
质研究工作。
2.2.2 温度和 pH 对酶活力稳定性的影响 温度
对酶的影响见图 3。 结果表明，该酶的最适反应温
度 55℃；相同温度条件 ，在不同 pH 缓冲体系中测
定 AglU 的酶活力， 以酶活力最高者计为 100%，得
到 pH-酶活力曲线（图 4）。结果表明，该酶的最适反
应 pH为 5.0。 将酶液在不同温度下分别保温 30 min，
测定残余酶活力 ， 以未处理的原酶液活力计为
100％， 得到温度-稳定性曲线 （图 5）。 结果显示，
AglU 在高温下不稳定， 在 65℃以下能保持相对稳
定状态。 室温下，将酶液在不同 pH 条件下分别保
温 30 min，测定残余酶活力 ，以未处理的原酶液活
力为 100％， 得到 pH-稳定性曲线 （图 6）。 结果显
示，AglU 在 4.0~6.5 之间保持稳定。 得出结论为该
图 1 CICIM F0410 aglU 片段的扩增
1.1λDNA PstI 酶切分子量标定 ；
2.PCR 扩增的 α-葡萄糖苷酶片段
图 2 CICIM F0410 发酵进程曲线
图 3 温度 -酶活力曲线
图 4 pH-酶活力曲线
11 501
5 077
2 838
1 159
132
2009年第 1期
酶能在比较宽的 pH 范围内稳定在，且能在中较低
温条件保持稳定。
2.2.3 化学试剂对酶活力的影响 化学试剂对酶
活力的影响如表 1 所示，Fe2+、Mn2+、Al3+对该菌株产
α-葡萄糖苷酶酶活有抑制作用，Mg2+有较明显的激
活作用； 而 K+、Na+、Ca2+、EDTA 对该酶酶活作用效
果不明显。
3 讨论
通过对实验室保藏的黑曲霉 CICIM F0410 发
酵液中 α-葡萄糖苷酶的酶学性质进行了分析，，研
究发现该酶的最适反应温度为 55℃， 在 40℃～60℃
活性相对较高，热稳定性范围较窄，在 75℃以上该
酶基本已失去活力，并随热处理时间的增长呈递减
状态。 这与杰能科生产的最适温度为 60℃的 L-500
转苷酶、日本天野株氏会社生产的最适温度为 65℃
的转苷酶相比有一定差异 [8]。该酶的最适反应 pH值
为 5.0， 与工业产糖化酶的最适 pH 值相近 。 在
pH7.0 以上的缓冲条件下反应时，该酶的相对酶活
力迅速下降， 表明在酸性条件下酶活力稳定性较
好。
本实验克隆了黑曲霉 CICIM F0410 中的 α-葡
萄糖苷酶基因，通过序列测定和比对发现与已公布
的黑曲霉 CBS513.88 的 α-葡萄糖苷酶基因序列存
在两个位点的差异 ：2272（A→G）、3098（T→G），导
致两个氨基酸残基的变化：687 位的天冬酰胺残基
变成丝氨酸残基、983 位的丝氨酸残基变成了精氨
酸残基。 据报道 [9]，氨基酸残基组成可能与酶的热
稳定性有关。 Bradley[8]等对枯草芽孢杆菌 25S、枯草
芽孢杆菌 H-17 中 α-葡萄糖苷酶氨基酸组成的研
究表明，酶分子中的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及亮氨
酸等疏水性氨基酸数量的增加有助于提高其热稳
定性，这可能是由于疏水相互作用的加强导致酶分
子的立体结构更加紧密的缘故 。 目前尚未见有关
CBS513.88 菌株 α-葡萄糖苷酶的酶学性质研究。 通
过序列测定、推衍得到黑曲霉 CICIM F0410 的 α-葡
萄糖苷酶氨基酸残基序列，为今后运用各种生物信
息学软件分析此菌株中 α-葡萄糖苷酶的空间构型
及活性中心提供了前提条件。
随着分子生物学的迅猛发展，越来越多的研究
者开始研究不同来源的 α-葡萄糖苷酶的异源表达
并获得较好性状的重组酶、以利于工业化生产。 J.
Hugenholtz[10]等从硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfata
ricus）克隆出热稳定性高的 α-葡萄糖苷酶基因并将
其在乳酸乳球菌中得到表达。 刘军 [11]等成功地构建
了含嗜热栖热菌 （Thermustherm ophilus）的 α-葡萄
糖苷酶基因的重组质粒，并在大肠杆菌 E.coli BL21
（DE3）中得到表达，重组酶的最适反应温度为 95℃。
本研究对黑曲霉 CICIM F0410 中的 α-葡萄糖苷酶
基因进行了克隆和序列测定，为今后该基因在其他
宿主菌中的异源表达及其重组酶酶学性质研究打
下了基础。
图 5 温度稳定性曲线
图 6 pH 稳定性

 mmol/L  %
 - 100
K 0.5 105.9
Ca 0.5 101.5
Na 0.5 101.2
Fe 0.5 80.1
Al 0.5 99.6
Mn
EDTA
0.5
0.5
17.6
103.7
Mg
0.5 120

表 1 化学试剂对葡萄糖苷酶酶活力的影响
（ 下转第 137页）
周敏等：黑曲霉 CICIM F0410中 α-葡萄糖苷酶的酶学性质研究 133
2009年第 1期
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（ 上接第 133页）
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图 5 部分 HCPT 结合肽与 HCPT 结合构象图
注：图中虚线表示氢键
转化子的数量不够，由于质粒基因文库的克隆数比
较大，必须筛选足够多的克隆才有可能得到阳性克
隆，通常需要筛选 2 000~3 000 个克隆。
3 结论
不吸水链霉菌基因文库的构建为克隆梧宁霉
素生物合成基因簇奠定了基础。本实验室欲以本菌
株抗性基因作探针杂交筛选基因文库，步移克隆生
物合成基因簇， 通过序列测定和基因功能分析，进
一步在分子水平上定向改变菌株的次级代谢途径，
以得到高产菌株 ，提高梧宁霉素的效价 ，降低其成
本，使之得到推广使用。 虽然本实验暂时未能在此
基因文库中筛选出阳性克隆，但能为以后的研究工
作奠定一定的基础。
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