全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
cDNAAFLP比较当归早薹基因转录
差异反应体系的建立
于光1 段金廒 1 宋秉生 2 何子清 2
( 1南京中医药大学,南京 210046; 2甘肃岷归中药材科技有限公司,兰州 730010)
摘 要: 建立了利用 cDNAAFLP技术对当归早薹相关的差异表达基因进行筛选的方法,优化了影响 cDNAAFLP试验
结果的关键因子, 包括选择性扩增模板量、酶离子浓度、dNTP浓度。结果表明, 以 1 L稀释 10倍的预扩增产物作为模板、
1 5 mm o l/LM gC l2、06 mm o l/L dNTP, 进行的选择性扩增反应获得 DNA片段分子量范围较广, 在 100- 1 000 bp长度范围中
均有扩增片段 ,是较为理想的选择性扩增的结果。聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了试验结果, 在优化条件下利用部分引物组合
可以较好地比较早薹当归在基因转录水平发生的差异。
关键词: 当归 早薹 cDNAAFLP 反应体系 表达差异
Optim ization of cDNAAFLP Reaction System for Early Bolting
Angelica sinensis ( O liv. ) Diels
Yu Guang
1
Duan Jinao1 Song B ingsheng2 H e Z iqing2
(
1
Nanjing University of ChineseM edicine, Nanjing 210046;
2
GansuM ingui ChineseM edicinalM aterials T echnology Co, L td. , Lanzhou 730010)
Abstrac:t In this study, the reaction sy stem of cDNAAFLP forAngelica sinens is was estab lished, template, dNTP, M g2+ o f se lective
amplification was optim ized. The stable reaction system w as established: 20L se lec tive amp lification reac tion system conta ining 1 L d i
lu ted pre amp lification products, 15 mmo l/LMgC l2, 06 mmo l/L dNTP. In this reaction system, amp lifica tion produc ts in the leng th range
about 100- 1 000 bp. cDNAAFLP products were resolved in a 6% denatur ing po lyacry lam ide sequenc ing gel run w ith 1 TBE e lectro
phoresis buffer.
Key words: Angelica sinensis ( O liv. ) D ie ls E arly bo lting cDNAAFLP Reaction System Gene expression differences
收稿日期: 20100613
基金项目:国家 !十一五 ∀科技支撑计划资助项目 ( 2006BA109B0501, 2007BA137B02 ) ,国家自然科学基金资助项目 ( 30801518)
作者简介:于光,男,讲师,博士研究生,研究方向:中药资源与分子生物学; Em ai:l yuguang@ n jutcm. edu. cn
通讯作者:段金廒,男,教授,博士,研究方向:中药资源学; Em ai:l du an ja@ 163. com
当归为伞形科 (Umbeliferae)当归属 (Angelica )
植物 Angelica sinensis( O liv. ) D iels的干燥根, 为大宗
中药材品种。始载于东汉 #神农本草经 ∃, 列为中
品,具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠之功效,为临
床妇科最常用中药之一, 自古就有 !十方九归 ∀之
誉,又因药食两用国内外需求量巨大。然而,当归在
主产地甘肃岷县等地种植过程中提前抽薹 (早薹 )
率高达 20% - 60%, 严重影响着当归的产量和品
质,制约着当归产业的健康发展。主产地甘肃省农
业相关部门对岷归早薹的成因,多从生态因子及营
养状况进行了一些相关研究 [ 1- 3] , 但未有深入和突
破,尚未取得有效防治措施。随着当归需求量的巨
增, 解决当归早薹问题对当归的产业化发展显得尤
为迫切。
从拟南芥、水稻等模式植物的研究进展发现,高
等植物的开花诱导过程受自身遗传因子和外界环境
因素两方面决定, 是开花基因在时间和空间上顺序
表达的结果 [ 4- 7]。 cDNAAFLP是从 AFLP( amp lified
fragment length po lymorph ism )衍生而来的 RNA指纹
识别技术,现已发展成为较为成熟的转录组研究技
2010年第 9期 于光等: cDNAAFLP比较当归早薹基因转录差异反应体系的建立
术,运用该技术可从转录水平鉴定 mRNA差异 [ 8, 9 ] ,
从而阐明基因调控在 RNA水平的表现,可对生物体
转录组进行全面、系统的分析; 并且获得的转录衍生
片段 ( transcriptderived fragments, TDF)一般集中在
蛋白质的编码区,可最大限度的提供基因编码区的
信息。本研究拟优化 cDNAAFLP方法,从而筛选早
薹当归和正常生长的当归在基因转录水平差异的反
应体系,旨在通过 cDNAAFLP方法揭示当归早薹的
调控机制,发现促发当归早薹的关键基因提供技术
支持。
1 材料和方法
11 材料
当归 Ang elica sinensis ( O liv. ) D iels的正常样品
和早期抽薹花蕾 (观察到抽薹现象 1周 )均采自甘
肃省岷县岷阳镇中药材种质园。采集时间, 2009
年 5- 6月份, 经纬度为 104%01&035 /34%25&857,海
拔 2 314m。
12 试剂
cDNAAFLP接头和引物均由上海 Sangon合
成。限制性内切酶、TA克隆载体购自上海 Sangon,
Trizo l试剂盒购自 Inv itrogen公司。 cDNA合成试剂
盒 ( P romegaUn iversalR iboclone cDNA Synthesis Sys
tem )购自 Promega公司。Taq 酶等购自 TaKaR a
公司。
13 RNA的分离与鉴定
采用 Tr izo l( Inv itrogen公司产品 )方法分离当归
样品总 RNA,用 DEPC水溶解, 1. 0%的琼脂糖凝胶
电泳检测 RNA质量。
14 反转录双链 cDNA的合成
以所提取总 RNA中的 mRNA为模板,按照 Pro
mega U niversa l R iboc lone cDNA Synthesis System试
剂盒 ( C4360)提供的方法合成双链 cDNA, 最后溶
于 DEPC水中。
15 cDNAAFLP方法的建立与检测
AFLP体系及程序参照 Yao [ 10 ]的方法并略有
改动。
151 酶切反应 合成的双链 cDNA用 E coR∋和
M se∋ (上海生工生物工程技术服务有限公司 )双酶
切, 37( 过夜, 65( 2 h。反应体系: 反转录双链
cDNA 200 ng, Buffer 4 L, M se∋ 03 L, E coR∋
025 L, 加 ddH 2O至总体积 10 L。
152 连接反应 酶切产物在连接酶的催化下和
接头 4( 过夜。EcoR I接头: 5&CTCGTAGACTGCG
TACC3&, 5&AATTGGTAGCAGTC3&;M se I接头: 5&
GACGATGAGTCCTGAG3&, 5&TACTCAGGACTCAT
3&。反应体系:酶切产物 5 L, Buffer 1 L,M se∋接
头 ( 50 mo l/L ) 05 L, E coR∋接头 ( 5 mo l/L ) 05
L,加 ddH2O至总体积 10 L。
153 连接产物预扩增 E coR I预扩增引物 E00:
5&GACTGCGTACCAATTC3&; M se I 预扩增 引物
M00: 5&GATGAGTCCTGAGT3&。预扩增程序: 94(
变性 3 m in; 94( 变性 30 s, 56( 退火 30 s, 72( 延
伸 1m in( 26个循环 ) ; 72( 延伸 5m in。反应体系:
模板 1 L, E coR∋ ( 100 ng /L)预扩引物 03 L,
M se∋ ( 100 ng /L)预扩引物 03 L, Bu ffer2 L,
dNTP( 10 mmo l/L ) 04 L, M gC l2 ( 25 mmo l /L ) 12
L, Taq酶 ( 5 U /L) 02 L, 加 ddH 2O至总体积
20 L。
154 预扩增产物选择性扩增 选择性扩增设立
模板浓度梯度、酶离子浓度梯度、dNTP浓度梯度。
扩增结果电泳检测, 优化选择性扩增反应体系。
E coR I选择性扩增引物: 5&GACTGCGTACCAATTC
NN 3&( N代表 ATCG中任意一种 ) ;M se I选择性扩
增引物 5&GATGAGTCCTGAGTNN3&( N代表 ATCG
中任意一种 )。选择性扩增程序: 94( 变性 3 m in;
94( 变性 30 s, 65( 退火 30 s (每次循环下降
07( ) , 72( 延伸 1 m in ( 13个循环 ); 94( 变性
30 s, 56( 退火 30 s, 72( 延伸 1 m in ( 24个循环 );
72( 延伸 5 m in。
155 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 选择性扩增产
物在 6%的聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳, 电泳结果
硝酸银染色。
2 结果与分析
21 RNA提取鉴定
利用琼脂糖电泳检测总 RNA质量。从图 1可
以看出所提取的总 RNA带型整齐一致, 表明所提取
的总 RNA纯度较高, 降解很少。电泳图谱中可见
RNA由 3条谱带组成, 它们分别是 28S、18S和 5S,
且 3条带很清晰,而 5S亮度较弱, 说明总 RNA质量
较好。
135
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
1.正常当归; 2.早薹当归
图 1 总 RNA电泳图
22 cDNAAFLP分析
221 琼脂糖凝胶电泳分析预扩增产物 琼脂糖凝
胶电泳鉴定预扩增产物 (图 2),结果显示预扩增产物
分布主要从分子量 100- 1 500 bp,符合预扩增要求。
1.正常当归; 2.早薹当归; M.分子量 2 000M arker
图 2 预扩增电泳图
222 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测选择性扩增产物
选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 (图
3)表明,以 1 L稀释 10倍的预扩增产物作为模板、
15mmo l/L M gC l2、06mmo l/L dNTP进行选择性扩
增反应获得 DNA片段分子量范围较广, 在 100 -
1 000 bp长度范围中均有扩增片段。
22 3 早薹和正常生长当归转录水平差异分析
根据优化的条件进行选择性扩增, 聚丙烯酰胺凝
胶电泳结果 (图 4)表明, 优化的试验方案可以进行
当归早薹基因转录水平差异的分析,随机选择了 3
对引物进行扩增,早薹和正常当归之间均有较好的
差异, 图中方框所指可见部分正常、早薹当归表达的
差异基因。
模板浓度梯度 ( 1. 01L; 2. 02L; 3. 05L; 41L;
52L) ; MgC l2浓度梯度 ( 61. 0 mm ol /L; 712mmo l/L;
815mm ol/L; 918 mmo l/L; 1020mm ol/L) ; dNTP浓
度梯度 ( 1101 mmo l/L; 1202 mmo l/L; 1304 mm ol/
L; 1406 mm ol /L; 15. 08mm ol/L)
图 3 选择性扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图
zt.早薹当归花芽; zc.正常当归顶端嫩芽
图 4 早薹和正常当归选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳图
3 讨论
植物抽薹是较为复杂的发育过程, 涉及多个基
因的协同表达。不同发育阶段特异基因的分离及鉴
定的研究早期是应用 cDNA文库筛选和差减杂交技
术, 这些技术都存在需要使用大量生物材料,假阳性
结果高等缺点 [ 11, 12 ]。1996年 Bachem等 [ 13]将 AFLP
技术应用于 mRNA的表达分析, 即 cDNAAFLP技
术, 在保留了 AFLP多态性丰富、稳定性高、无需了
解序列信息等优点的同时, 集中显示基因组表达序
列的多态性差异,且重复性好、准确可靠、效率高,可
对生物体转录组进行全面、系统的分析。现在 cD
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2010年第 9期 于光等: cDNAAFLP比较当归早薹基因转录差异反应体系的建立
NAAFLP在经济作物的遗传育种研究中,在植物的
抗逆性研究中,在未知功能基因的筛选中都得到了
广泛的应用 [ 14- 16 ] ,本研究首次将 cDNAAFLP技术
引入当归早薹研究中。
cDNAAFLP对于内切酶的要求是应该最大可
能地分析 RNA,最理想的酶切组合是识别 6 bp和 4
bp的酶切位点。本试验对于内切酶的选择基于从
GenBank中寻找已经发表的高等植物 cDNA, 筛选
后确定使用M se I和 EcoR I,以保证较大程度上检测
当归抽薹时基因的表达。本项工作优化了影响 cD
NAAFLP的重要因素, 建立了当归早薹相关基因筛
选工作的反应体系, 研究结果可以指导后续当归早
薹相关基因的筛选工作的开展。此外, 本研究首次
将 cDNAAFLP技术引入药用植物当归的研究中,对
于揭示当归早薹的分子机制具有重要的理论意义,
研究结果可以为当归早薹的防治提供科学支撑,指
导当归的种质改良。RNA的制备要注意污染和降
解,因此,一定要取新鲜的样品,试验操作过程中一
定要保持无菌的工作环境,操作要快,尽量低温。酶
切后的 cDNA片段与接头连接效率低也是常见的问
题,一般可以通过透析或乙醇沉淀去除磷酸盐来解
决。试验中发现的早薹当归在基因转录水平发生的
差异还有待于进一步的鉴定和分析。
参 考 文 献
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