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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
基于雷帕霉素与 FRB结合的蛋白质间
相互作用的相关技术
李芹芹1 史道华2 杨牛牛1
(1福建中医药大学药学院，福州 350108;2南京军区福州总医院药学科，福州 350025)
摘 要: FKBP12-rapamycin复合物的结合位点(FKBP12-rapamycin binding，FRB)为雷帕霉素(rapamycin，RAP)与哺乳动
物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)结合的结构域，基于 RAP介导 FK506 结合蛋白 12(12 kD FK506-bin-
ging protein，FKBP12)与 FRB蛋白质相互作用相关研究技术的发展与应用，使人们对小分子介导的蛋白质相互作用有了更多
的认识。就研究 RAP作用于 FRB域及研究 FKBP12-RAP-FRB三元复合物形成的相关技术作一综述，为确认新的 mTOR抑制
剂的作用机制及认识其他蛋白质间相互作用提供参考。
关键词: FRB域 雷帕霉素 蛋白质间相互作用 技术
Advances in Technology Based on the Combination of Rapamycin and
FRB Domain Mediated Protein-protein Interactions
Li Qinqin1 Shi Daohua2 Yang Niuniu1
(1College of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108;
2Department of Pharmacy，Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command，Fuzhou 350025)
Abstract: FRB domain(FKBP12-rapamycin binding domain)is a binding site of rapamycin(RAP)which targets on mTOR(mam-
malian target of rapamycin)． As the research technologies has been used and developed based on the RAP mediated the FKBP12-FRB
protein interaction，more and more mechanisms were demonstrated in protein-protein interactions induced by small molecules． In this pa-
per，some technologies were reviewed on the study of RAP-FRB binding and FKBP12-RAP-FRB ternary complex formation which in-
tends to recognize the mechanisms of novel mTOR inhibitors and protein-protein interactions．
Key words: FRB domain Rapamycin Protein-protein interactions Technology
μ收稿日期:2011-03-21
基金项目:福建省自然基金资助项目(2008J0103)
作者简介:李芹芹，女，硕士研究生，研究方向:分子药理学;E-mail:binglan250978470@ 163． com
通讯作者:史道华，男，教授，硕士生导师，研究方向:心血管药理研究;E-mail:shidh@ yeah． net
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target
of rapamycin，mTOR)是一种丝氨酸 /苏氨酸激酶，
为多种疾病治疗的药物作用靶标，在调节细胞生
长和增殖中起着重要的作用［1］。FRB 结构域即
FKBP12-rapamycin 复 合 物 的 结 合 位 点 (FK-
BP12-rapamycin binding，FRB) ，为 mTOR 氨基端
2 015 － 2 114氨基酸残基之间的结构，是雷帕霉
素(rapamycin，RAP)产生抑制 mTOR 活性的结合
位点。RAP 部分结构(C1 － C15 和 C32 － C41)
与 FK506 结合蛋白 12(12 kD FK506-binging pro-
tein，FKBP12)结合形成二元(RAP-FKBP12)复合
物，药理作用与他克莫司(Tacrolimus，FK506)相
似，产生免疫抑制;RAP 还有三烯臂结构域(C16
－ C23 和 C23 － C31) ，可在 RAP-FKBP12 二元复
合物基础上与 mTOR 的 FRB 域结合，抑制 mTOR
活性，发挥抗肿瘤等作用［2］。基于 RAP 介导 FK-
BP12 与 FRB 间相互作用的研究基础上，近年来
双分子荧光互补技术［3，4］、共振能量转移技术［5］
等检测蛋白质间相互作用的新技术得到了长足
的发展。
2011 年第 9 期 李芹芹等:基于雷帕霉素与 FRB结合的蛋白质间相互作用的相关技术
1 FRB域结构与功能
FRB结构域位于 mTOR氨基端 2 015 － 2 114 氨
基酸残基之间，大小为 11 kD［6］。X 单晶衍射结构
显示 FRB 由 4 个 α 螺旋通过短环联结形成四螺旋
簇样三级结构，α1、α4-螺旋的交叉点附近 6 个氨基
酸(Trp2101、Tyr2104、Tyr2105、Phe2108、Tyr2038 和
Phe2039)的芳香基团构成了浅表的疏水性结合区。
该域若缺失或突变如 Ser2035→ Ile /Thr 或 Tyr2105
→Ala 或 Trp2027→ Phe，均可阻止 RAP-FKBP12-
FRB三元复合物形成，导致 mTOR 激酶活性降低，
产生 RAP耐受。体外研究表明，FRB域为 mTOR激
酶活性调节及细胞周期抑制作用的必需位点［7］。
Edwords等［8］研究表明，mTOR 的 FRB 结构域具有
内在的不稳定性及配体依赖性，当与配体稳定结合
后表达增强，抑制 mTOR活性作用。
2 RAP结合 FRB的技术
随着 FRB 结构的确证，RAP 介导 FKBP12 与
FRB蛋白间相互作用已成共识。基于此作用方式
研究小分子介导蛋白质相互作用的相关技术引起了
众多学者的关注。
2． 1 RAP与 FRB域直接结合的技术
多数研究表明，RAP结合 mTOR的 FRB域须先
与胞内 FKBP12 结合，但亦有研究发现在缺乏 FK-
BP12 的情况下，RAP也可以结合 FRB 域，但亲和力
很低［2］。FKBP12-RAP-FRB 三元复合物结构的 X-
衍射研究显示，FKBP12 和 FRB 之间可与 RAP 结合
的空间位置很小［9，10］，故 RAP直接结合 FRB的亲和
力较低。Shor等［11］通过生化检测方法也发现，RAP
及其同系物 CCI-779 抑制 mTOR 活性是否依赖 FK-
BP12，与给药剂量有关。Leone 等［12］利用核磁共振
波谱法发现了可直接与 FRB 结构结合的一类小分
子配体，与 RAP 竞争相同的结合位点，但并非均有
抑制 mTOR 活性的作用。经核磁共振与 AIRs-BDP
(ambiguous interaction restraints-based docking proto-
col)联用技术发现，抑制 mTOR 活性的小分子化合
物与 FRB结合的位点同磷脂酸(mTOR 特异性激动
剂)或 RAP结合 FRB的位点高度匹配［13，14］。
2． 2 研究 FKBP12-RAP-FRB 三元复合物形成的
技术
蛋白质相互作用(protein-protein interactions，
PPIs)受细胞外环境刺激及胞内多条信号通路的影
响，小分子化合物可综合胞内外环境变化从而介导
蛋白质相互作用。研究小分子化合物介导的蛋白质
相互作用对于了解细胞中信号转导及确认药物作用
靶标具有十分重要的意义［15］。应用 RAP 介导 FK-
BP12 与 FRB 蛋白质相互作用的相关研究技术，为
验证与检测其他多种蛋白质相互作用的新技术提供
了可靠的操作平台。
2． 2． 1 活细胞 PPIs检测技术 活细胞的 PPIs检测
方法主要有荧光共振能量转移(fluorescence reso-
nance energy transfer，FRET)和蛋白碎片互补分析
(protein complementation analysis，PCAs)。 Chen
等［16］构建融合荧光蛋白，利用福斯特共振能量转移
(FRET)方法在 Hela 细胞中检测 RAP介导 FKBP12
与 FRB相互作用的平衡解离常数(Kd) ，从而验证
了 FRET技术在研究活细胞中蛋白质间相互作用的
亲和力是有效的。Rosenfeldt 等［17］应用生物发光共
振能量转移(bioluminescence resonance energy trans-
fer strategy，BRET)分析技术，研究了融合 C 端介导
信号隐花色素裂解的 FKBP12 和融合 N端感光域的
FRB蛋白间发生的结合作用，结果显示该技术在研
究植物调节二聚化作用系统中亦具有效性。有学者
进一步改良了 BRET 技术，研究 FKBP12-RAP-FRB
三元复合物的形成在单个活细胞和在体动物中的分
子成像，促进了高通量高敏感 BRET 分析技术的发
展［18］。此外，Galarneau 等［19］利用 TEM-1β-内酰胺
酶的 PCAs，在哺乳动物细胞中采用体外色度法与体
内荧光分析结合的方法，定量分析了 RAP 介导 FK-
BP12 与 FRB的相互作用。另有学者基于正电子成
像技术(PET)裂解报告分子(单纯疱疹病毒 1 型胸
苷激酶)的 Thr265 与 Ala266 氨基酸，应用 PCAs 定
量分析哺乳动物细胞中蛋白质相互作用以及在活体
动物身上进行微 PET 成像分析，并且引入点突变
(V119C)后，可显著增强 PCAs 分析时胸苷激酶的
互补性。这一技术在研究 RAP 介导 FRB 与 FK-
BP12 等多种蛋白质相互作用中得到了应用［20］。
然而 FRET也存在一些缺陷，主要是检测敏感
性和动态范围有限。PCAs 的主要不足是存在假阳
性和假阴性。Fernández-Suárez 等［21］建立了一种全
新的方法检测细胞内 PPIs，应用酶 －底物耦合，目的
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
蛋白融合 E． coli酶生物素连接酶(BirA) ，另一蛋白
融合 BirA的受体肽(AP)底物，如果两个蛋白有相
互作用，BirA 将催化 AP 的位点特异性生物素化作
用。利用 BirA-AP 耦合的专一性，构建融合蛋白
FKBP-AP和 FRB-BirA，经过体外纯化并通过抗生蛋
白链菌素(streptavidin)染色，RAP可使 FKBP-AP 的
生物素化增加 5 倍。鉴于可利用此种方法在活细胞
上进行标记，且生理作用未受干扰，因此该方法可用
于检测瞬时发生的蛋白间相互作用。
2． 2． 2 研究蛋白质动能的技术 小分子控制蛋白
质的二聚化系统已被广泛用于蛋白质动能的研究。
Kapitein等［22］为检测活细胞内部动力蛋白的活性运
动，利用 FKBP-RAP-FRB三元复合物系统研发了一
种体外过氧化氢酶体运输分析技术，提供外源性和
内源性驱动蛋白，肌动蛋白和肌球蛋白运动可诱导
募集反应来驱动特异性的物质运输，从而检测出胞
内动力蛋白的活性。滴定和洗脱试验进一步显示由
RAP 介导的二聚化作用引起肌动蛋白募集反应具
有剂量依赖性和不可逆性。Xu 等［23］提出在酵母菌
中有条件地控制目标蛋白核转运的方案。在此技术
中，FKBP12 融合了一个可作为核定位信号(nuclear
localization signal)或出核转运序列(nuclear export
sequence)的蛋白，FRB则融合了荧光蛋白，RAP介导
这两种融合蛋白的异二聚化。由于这种相互作用是
有选择地发生于核定位信号或出核转运序列控制下
的目标蛋白，因此目标蛋白可在核中直接进出。此种
化合物介导的二聚化作用中，蛋白质的错位分布是可
逆的，与其他系统相比该技术需要永久变异的目标蛋
白，并且药物作用 15 min内允许蛋白质错位分布。
另有学者研究报道了特定蛋白快速可逆调节的
方法。内源性糖原合酶-3β(GSK-3β)基因融合 FRB
后导致 GSK-3β 的稳定性降低，产生一系列等位功
能缺失，RAP 促使 GSK-3β-FRB 结合 FKBP12 蛋白
从而快速稳定 GSK-3β-FRB，恢复蛋白活性;当存在
竞争性结合 FKBP12 的分子时，复合物的稳定性又
可被快速逆转［24，25］。有学者设计了一种新的配体
调节肽(LiRP)系统，细胞渗透性小分子可调控 LiRP
与细胞内活性肽的结合。当配体缺乏时，FKBP-肽-
FRB-GST与 LiRP 融合在一起表达，可与目标蛋白
自由结合;当配体 RAP 或其同系物存在时，支架蛋
白的构象变化将阻止肽类和目标蛋白间的相互作
用。LiRP系统可用于短时调节细胞及组织中蛋白
质功能的研究［26，27］。
2． 2． 3 其他技术 胞内核磁共振谱分析筛选小分
子间相互作用文库(SMILI-NMR) ，用于研究化合物
干扰或增强两种或多种生物分子复合物间相互作用
的能力。有学者筛选出一个小的二肽文库，能取消
FKBP-FRB 蛋白复合物参与的细胞周期停滞，并在
二肽的鉴定中表明了 SMILI-NMR 方法的实用性及
有效性［28］。Cre重组酶虽然广泛应用于试验动物的
基因组调控，但缺乏有效的时序控制可使 Cre 重组
酶活性降低。有学者利用 FKBP12-RAP-FRB 异二
聚化作用系统对 Cre重组酶的调节进行了研究，Cre
重组酶裂解后分别融合于 FKBP12 和 FRB，RAP 引
起异二聚化作用可使 Cre活性恢复。体内外分析也
表明，配体诱导的异二聚化作用是一种有效调节
Cre活性的方式［29］。基于 photonic 晶体(PC)传感
器高通量分析鉴定蛋白质间相互作用，可通过一
种 D-biotin-tris-NTA(BTN)多聚化合物使 His6-标
签蛋白固定在 PC 传感器的表面，观察波峰值的
改变检测蛋白质与其相应配体的结合。Heeres
等［30］利用此种技术将 His6 标记的 FKBP12 固定
于 PC 传感器表面，发现由 GST 标记的 FRB 蛋白
仅在 RAP 存在时与 FKBP12 结合，表明 RAP 介
导这两蛋白间的相互作用。
3 结语
综上所述，FRB域为 RAP发挥药理作用的结合
位点，从研究 RAP 结合 FRB 域有关的实验技术中，
逐步发展了一系列可检测其他蛋白质相互作用的实
用技术，经典的 FKBP12-RAP-FRB 三元复合物的形
成为这些实用技术提供可靠的保证。新技术的不断
发展不仅为研究药物与 FRB 域的结合方式及研究
mTOR抑制剂新药的确切机制提供了新的方法，而
且为认识其他小分子介导的蛋白质相互作用提供了
重要的技术手段。
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(责任编辑 狄艳红)
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