全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (6): 741-752, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-12-12; 接受日期: 2008-02-29
基金项目: 国家自然科学基金(No.30671284)和浙江省重大科技专项(No.2004C12020-3)
* 通讯作者。E-mail: w ang1972@zw u.edu.cn
.专题介绍.
稻米淀粉品质形成的关键酶及其分子生物学研究进展
王忠华1, 2*, 俞挺捷1
1浙江万里学院生物技术研究所, 宁波 315100
2浙江大学原子核农业科学研究所, 杭州 310029
摘要 稻米淀粉的形成是影响水稻产量和品质的决定性因素之一。因此, 开展稻米淀粉形成过程中所涉及关键酶的研究是
非常必要的。随着分子生物学技术的快速发展, 有关稻米淀粉品质的研究也越来越深入, 并取得了较大进展。该文对水稻淀
粉品质形成过程中的关键酶及其分子生物学研究进展进行了较为详尽的综述, 主要包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、
淀粉分支酶和淀粉去分支酶等, 并对该领域的发展趋势进行了展望。
关键词 基因克隆, 基因表达, 关键酶, 稻米淀粉品质
王忠华 , 俞挺捷 (2008). 稻米淀粉品质形成的关键酶及其分子生物学研究进展. 植物学通报 25, 741-752.
水稻(Oryza sat iva)是世界上最重要的粮食作物之
一, 世界上大约有一半以上的人口以稻米为主食, 因此各
国科学家纷纷开展对稻米品质形成机理方面的研究。
由于稻米淀粉是精米的主要成分, 稻米品质性状的形成
实质上可看作是籽粒中淀粉生物合成和积累的过程(蔡一
霞等, 2004), 而这一过程发生在稻米淀粉体中, 并在一
系列酶的催化作用下形成(图 1)。根据已有的研究来看,
籽粒淀粉形成过程中, 蔗糖合成酶(sucrose synthase,
S S )、A DP - 葡萄糖焦磷酸化酶( A D P - g l u c o s e
pyrophosphory lase, AGPP或 AGPase)、淀粉分支酶
(s tarch branching enzyme, SBE)、淀粉去分支酶
(starch debranching enzyme, SDBE)、淀粉粒结合
型淀粉合成酶(granule-bound s tarch synthase, GBSS)
和可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase, SSS)
等与稻米品质的关系十分密切, 其中淀粉分支酶是水稻
胚乳淀粉生物合成的关键酶, 它可催化 a-1, 6葡萄糖苷
键的形成, 在直链上产生分支而形成支链淀粉(Nakam-
ura and Yuki, 1992; Nakamura et al. , 1992b; 包劲松
和夏英武, 1999; 张峰等, 2001; 蔡一霞等, 2004; Tetlow
et al. , 2004; 刘奇华等, 2006; 张海艳等, 2006)。近年
来的研究发现, 淀粉去分支酶在淀粉颗粒形成中具有重
要的作用, 正常支链淀粉的分支模式是SBE和SDBE平
衡作用的结果, 植物糖原是在SDBE缺失或活性降低的
情况下, 只通过 SBE 催化作用而形成的(Nakamura et
al. , 1996a, 1996b; 钟海明等, 2007)。
本文对水稻淀粉生物合成和积累过程中的几个关键
酶及其分子生物学研究的最新进展进行综述, 以期为稻
米品质的进一步改良提供参考。
1 与淀粉合成相关的关键酶
1.1 ADP葡萄糖焦磷酸化酶
ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGPP)是淀粉合成途径中被最
为广泛鉴定的酶, 又称为 AGP 合成酶(全称为Glu-1-P
腺基转移酶, glucose-1-phosphate adeny ly t ransf-
erase)、ADP葡萄糖合成酶(ADP-glucose synthase)
或 ADP 葡萄糖二磷酸化酶(ADP-glucose diphosphor-
y lase)。它催化G-1-P(葡萄糖 1-磷酸)和 ATP 形成焦
磷酸和 ADP葡萄糖(ADP-glucose, ADPG)。AGPP是
一个异源四聚体, 由2个大亚基和2个小亚基组成, 它是
一个变构调节酶, 受3-磷酸甘油的正向激活和无机磷酸
的负向抑制(Preiss and Sivak, 1998)。Anderson等
742 植物学通报 25(6) 2008
(1989)研究发现, 在水稻胚乳中, 该酶的活性与淀粉积累
量呈正相关。它还与籽粒灌浆速率具有相关性(潘晓华
等, 1999; 杨建昌等, 2001), 是淀粉合成的限速酶, 并负
责将其从细胞质转移到造粉体中(Greene and Hannah,
19 98 ) , 但不影响淀粉的结构(朱昌兰等, 20 02 )。
Krishnan等(1986)对水稻叶片中的AGPP 进行了免疫
学分析, 结果表明叶片中AGPP是由2个不同的亚基(43
kDa和 46 kDa)组成, 而水稻胚中则只由 1个亚基(50
kDa)组成, 表明水稻叶片和胚乳中AGPP亚基的数量和
大小是不同的。
1.2 淀粉合成酶
淀粉合成酶是一个葡萄糖转移酶, 它以寡聚糖为前体,
ADPG为底物, 通过 a-1, 4糖苷键不断增加寡聚糖的葡
萄糖单位, 最终形成 a-1, 4糖苷键连接的聚糖, 聚糖又
作为淀粉分支酶的底物合成支链淀粉。依据它在淀粉
体中存在的状态, 淀粉合成酶可分为颗粒结合型淀粉合
成酶(G B S S )和可溶性淀粉合成酶(S S S ) (F os t e r ,
1996 )。
G BS S 又称为 A DP -G l u - 淀粉葡萄糖基转移酶
(ADP-glucose-s tarch glucosy l-t ransferase), 催化
ADP-Glu+{(1,4)-a-D-glucose}(N)为 ADP+{(1,4)-a-D
glucose} (N+1), 是直链淀粉合成过程中起主要作用的
酶, 由蜡质基因Wx 位点控制, 该位点的基因表达产物
(Wx蛋白)的分子量为 60 kDa左右, 其紧密结合在淀粉
粒上。据 Takeda和 Hizukuri (1987)报道, 与正常野生
型水稻相比, 缺失GBSS 的水稻胚乳中不含直链淀粉。
此外, GBSS 不仅涉及直链淀粉的合成, 而且还与分离
的淀粉颗粒中支链淀粉分支的延长有关(Denyer et al. ,
1996), 但GBSS在正常淀粉粒支链淀粉的延长中的确切
作用尚不清楚。
可溶性淀粉合成酶是另一大类淀粉合成酶, 它包括
除GBSS 以外的所有淀粉合成酶, 其同工酶种类很多,
根据其氨基酸序列可分为 4种: SSSI、SSSII、SSSIII
图 1 淀粉生物合成的主要途径
ADPG: 腺苷二磷酸葡萄糖; UDPG: 尿苷二磷酸葡萄糖; G-1-P: 葡萄糖 -1-磷酸; AGPase: A DP-葡萄糖焦磷酸化酶; UDPase: UDP-葡萄
糖焦磷酸化酶; GBSS: 淀粉粒结合型淀粉合成酶; SSS: 可溶性淀粉合成酶; SBE: 淀粉分支酶; SDBE: 淀粉去分支酶
Figur e 1 Major w ays to starch bio-synthes is
ADPG: Adenosine diphosphate glucose; UDPG: Ur idine diphosphate glucose; G-1-P: Glucose-1-phosphate; AGPase: ADP-glucose
py rophosphorylase; UDPase: UDP-glucose pyrophos rylase; GBSS: Granule-bound s tarch synthase; SSS: Soluble s tarch synthase;
SBE: Starch branching enzyme; SDBE: Starch debranching enzyme
743王忠华等: 稻米淀粉品质形成的关键酶及其分子生物学研究进展
和 SSSIV(Dian et al. , 2005; Fujita et al. , 2007)。有
关这些同工酶在淀粉合成中的作用研究都是来源于缺失
某一同工型的突变体或转基因植物, 而这些不同表现型
的植株似乎表明: 每种同工型SSS在支链淀粉合成中发
挥着特定的作用。如 SS SII形式的缺失导致支链淀粉
中间长度的链减少, 短链增加, 表明 SSSII在中间长度
链的合成中有专一作用, 而其它同工型酶不能互补这种
缺失作用(Craig et al., 1998)。目前每种同工型的可溶
性淀粉合成酶在淀粉合成过程中的确切作用仍不清楚。
Jiang等(2004)研究发现水稻SSSII由SSSII-1、SSSII-
2和 SSSII-3三部分组成, 三者的序列同源性为 51%-
64%, 与玉米(Zea mays )、豌豆(Pisum sat ivum)、小
麦(Triticum aest ivum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)
和马铃薯(Solanum tuberosum)相比, 具有 53%-73%
的同源性。另外, 他们还发现水稻 SSSII蛋白包括 1个
淀粉合成酶的保守区域。
1.3 淀粉分支酶
淀粉分支酶(SBE)又称Q酶, 在支链淀粉结构形成中有
重要的作用, 催化 a-1, 6糖苷键的形成, 并与可溶性淀
粉合成酶共同作用, 形成支链淀粉(Burton et al., 1995;
Smith et al., 1995)。SBE 在植物器官中含有多个同
工酶(Mart in and Smith, 1995)。Mizuno等(1992) 从
未成熟水稻种子中分离到 4种形式的淀粉分支酶, 分别
称之为 RBE1、RBE2 (RBE2A 和 RBE2B 的混合物)、
RBE3和 RBE4。其中 RBE1、RBE2A 和 RBE2B 是
主要类型, 但它们的分子量大小、N-末端氨基酸序列以
及与抗玉米分支酶(BE2I)的抗体免疫反应等都是相同的,
只是RBE2A的分子量比RBE1和RBE2B略大, 表明它
们是相同的淀粉分支酶类型 , 因此统称为 B E 2 I。
Nakamura和Yuki(1992)也从发育的水稻种子中纯化到
2个淀粉分支酶同工酶: QE2I 和QE2II, 分子量分别为
80 kDa和 85 kDa。从蛋白酶解图谱和Western杂交
结果可以看出, QE2I和QE2II是由不同基因编码的产
物。Mizuno 等(1993)和 Kim 等(1998)对直链淀粉扩展
突变体(amylose extender, ae)进行了研究, 结果表明该
突变体缺乏 87 kDa RBE3同工酶活性, 而GBSS 和
RBE1同工型则没有改变。分离出 RBE3 cDNA, 其编
码氨基酸序列分析表明该蛋白最初是一个825个氨基酸
的前体, 其 N- 末端包含一段 65 个残基的转运多肽。
RBE3和 RBE1有许多序列是相同的, 特别是蛋白质分
子中心区域。但 RBE3 N-末端拥有一段 70个氨基酸残
基的序列, 并在 C-末端与 RBE1相比缺少一段约 50个
氨基酸的序列, 这种两末端结构上的差异也许可以解释
RBE1和 RBE3在淀粉合成中的功能差异, 即 RBE3主
要抑制支链淀粉长链B的增加。Nishi 等(2001)发现水
稻ae突变体RBE2B的活性大大降低, 导致胚乳中支链
淀粉的结构发生改变, 而 RBE1、RBE2A 等酶的活性
未受影响。由此表明, RBE2B 的功能不能由RBE1和
RBE2A来补偿, 并且RBE2B在短链转移中有特殊的功
能。RB E2B 活性随显性位点数量的增加而呈直线增
加, 这种基因的剂量效应可用来解释RBE2B 蛋白水平
对支链淀粉中短链比例的变化和淀粉含量及在尿素溶液
中淀粉糊化性状的影响, 同时对粒重也存在剂量效应。
RBE1的最适底物为直链淀粉和具有很少分支的多聚糖,
而RBE2对支链淀粉和高度分支的葡聚糖有较高的亲和
力, 这表明 RBE1和 RBE2在支链淀粉分子的构建中可
能发挥着不同的作用。
Martin和Smith(1995)以及Smith等(1995)认为, 同
工型淀粉分支酶在结构和功能上的差异决定了支链淀粉
簇状结构内部分支模式和链长的分配。根据淀粉分支
酶作用的底物和形成的分支链长可将同工型分为 BE I
(SBEB, B 型)和 BEII(SBEA, A 型)。A型偏向于短的
葡萄糖苷链, 而 B 型偏向于长的葡萄糖苷链(Guan and
Preiss , 1993)。B 型淀粉分支酶优先催化直链淀粉形
成分支, 在体内参与较长链和中等长度链的合成。对 B
型进行负调控或使其活性丧失, 对淀粉合成和组成的影
响很小, 说明 B型 SBE在淀粉合成中的作用很小, 可能
对 A 型起适当的补偿作用。
杨建昌等(2001)的研究结果表明, 水稻籽粒中3个酶
(ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶和淀粉分支酶)的活性
变化与籽粒灌浆动态相关联, 尤以Q酶的相关值最大,
对籽粒灌浆起着关键的调控作用。李太贵等(1997)认为
高温下早籼形成以腹白为主的垩白, 主要是由于包括Q
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酶在内的酶的绝对或相对缺乏引起的, 而糖源不足可能
不是主要原因。Nakamura和 Yuki(1992)对Q酶进行
了较为系统的研究, 认为各种淀粉分支酶活性平衡点的
变化改变了多聚葡萄糖的结构和颗粒形状, 从而影响稻
米的品质。
1.4 淀粉去分支酶
淀粉去分支酶(s tarch debranching enzyme, DBE)是水
解 a-1, 6糖苷键的酶。近年来, DBE 在支链淀粉结构
形成中的作用越来越受到关注。Bal l 等(1996)提出了
“Glucan t rimming”模型, 并以此模型解释了 DBE在淀
粉合成中的作用。他们认为SBE 催化生成的支链淀粉
分支是松散的, 而 DBE 的作用是剪切掉分支松散的糖
链, 抑制糖原的合成, 并留下紧密分布的分支。依据其
作用底物的不同, 去分支酶可分为异淀粉酶(isoamyl-
ase, ISA)和支链淀粉酶(pullulanase) 2种。其中支链
淀粉酶又称为 R酶、普鲁兰酶、a-限制性糊精酶或限
糊精酶, 它催化水解支链淀粉的a-1, 6分支; 而异淀粉
酶催化水解糖原的 a-1, 6分支, 但不能水解支链淀粉的
a-1, 6分支(Nakamura et al., 1996a; Kubo et al., 1999;
David et al. , 2000)。
到目前为止, 有关淀粉去分支酶在支链淀粉合成中
的作用有 2种假说。第1种是以Erlander(1970)为代表,
认为植物糖原是支链淀粉合成的中间产物, 经过去分支
酶的作用形成支链淀粉; 第 2 种是以Nak am ura 等
(1992a)和 Nakamura(1996)为代表, 认为分支酶和去分
支酶这2种酶的活性平衡对a-1, 6分支的频率或支链淀
粉的 a-1, 4侧链的链长分配具有重要的决定作用。这
2种假说都各有欠缺, 还有待于进一步研究论证。因此,
支链淀粉的合成和淀粉颗粒的形成是一个复杂且可调节
的过程, 它是 SS、SBE 以及淀粉其它代谢酶共同作用
的结果。
2 与淀粉合成相关的关键酶基因
前面已经提到, 稻米中的淀粉分为直链淀粉和支链淀粉,
两者的含量比例直接影响淀粉粒的结构和稻米品质。
稻米淀粉主要在淀粉体中合成, 并受到一系列关键性酶
的调控。这些酶包括 ADP 葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结
合型淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶和
淀粉去分支酶。目前普遍认为编码后 4种酶的基因与稻
米淀粉品质关系密切(Smith et al., 1997)。下面分别
阐述这 5种关键酶相关基因的克隆、分子特性及其表达
调控的研究进展。
2.1 ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因
Krishnan等(1986)用水稻 AGPP cDNA 作探针进行
Northern杂交, 结果显示叶片的AGPP mRNA (2.1 kb)
比胚乳组织的(1.9 kb)稍大一点, 由此表明水稻胚乳和叶
片 AGPP 都是组织特异性表达的。对水稻基因组进行
Southern分析, 结果表明水稻AGPP基因至少存在3个
拷贝。因此, AGPP是由一个小的基因家族编码的。从
限制性酶切片段差异而言, 此家族至少可分为 2 类。
Nakamura(1992)从水稻发育胚乳中鉴定出 6个 AGPP
多肽, 分子量皆为 50 kDa左右。研究结果还表明水稻
胚乳AGPP是由具有相似氨基酸结构的亚基组成的四聚
体, 它可能是一个多基因家族编码的产物, 这些不同形式
的AGPP在水稻胚乳淀粉积累过程中可能起到不同的作
用。Anderson等(1991)也分离到水稻胚乳特异性表达
的 AGPP, 并对其基因序列结构进行了分析, 结果发现
在 6 kb的序列中有 10个外显子和 9个内含子。他们还
对水稻种子发育的基因表达模式进行了分析, 结果表明
AGPP的mRNA转录物在开花后15天达到最高水平, 与
此时淀粉积累速率最高的现象相吻合(Anderson et al.,
1991)。这也证明基因表达限制了淀粉积累速率, 而且
AGPP是同时通过种子发育过程中转录水平调控和酶水
平的变构来调控淀粉合成的。
2.2 颗粒结合型淀粉合成酶基因
颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)催化合成直链淀粉, 而
Wx基因通过编码 GBSS来控制直链淀粉含量, 后者是
决定稻米蒸煮食味品质的主要因素(Aryes et al., 1997;
包劲松等, 1999; 吕英海和李建粤, 2005; 孙业盈等,
2005)。水稻Wx基因首先由Okagak i和Wessler(1988)
745王忠华等: 稻米淀粉品质形成的关键酶及其分子生物学研究进展
克隆, 随后Wang等(1990)报道了Wx基因的核苷酸序
列。Hirano和 Sano(1991)利用玉米Wx+DNA 克隆了
水稻Wx+基因, 并制备了水稻Wx+蛋白的抗血清, 研究
发现Wx+基因由许多外显子和内含子组成。推测的氨
基酸序列表明Wx+多肽由1个含 77个氨基酸残基的转
运多肽和 1 个含 532 个氨基酸残基的成熟蛋白组成。
W x + 基因的表达调控是组织和发育时期专一性的 ,
Northern 杂交显示Wx+基因在授粉后 13-18天表达量
最高, 此后则几乎不再表达。
Wang等(1995)研究发现, 在直链淀粉含量高的水稻
品种未成熟种子中, Wx基因只有一种分子量为 2.3 kb
的成熟转录物; 而在直链淀粉含量中等或偏低的水稻品
种的未成熟种子中, Wx基因除了成熟转录物外, 还有一
个分子量为3.3 kb的含有第1内含子的前体mRNA。而
在糯稻品种中由于无直链淀粉, 未观察到W x 基因的
mRNA转录本。Cai 等(1998)通过 RT-PCR和 DNA 测
序分析发现, 不同水稻品种中Wx基因第 1内含子存在
多种剪接位点, 这些不正常的剪接现象说明在剪接过程
中发生了故障, 因而影响剪接效率。对Wx基因第 1内
含子的 5供体旁邻顺序进行分析, 结果表明第1类(直链
淀粉含量高的水稻)品种中第1外显子和第1内含子连接
处是G(CAAGgtat), 第2类(直链淀粉含量中等或偏低水
稻)品种中则是 A(CAAgttat )。第 1内含子被剪接后, 在
第 2类水稻品种的第 1外显子和第 2外显子连接处产生
了一个新的起始密码子AUG, 而它的开放阅读框与编码
区中正常起始密码子的不一致。该单核苷酸多态性
(SNP)可以解释 89个非糯品种的 79.7% 的表观直链淀
粉含量变异(Ayres et al. , 1997)。上述研究表明, 不同
水稻品种中胚乳直链淀粉含量受Wx基因转录后加工,
尤其是第 1 内含子从前体 mRNA 的切除效率的调控。
Bligh等(1995)在Wang等(1990)发表的Wx核苷酸序列
中发现了位于前导内含子剪切点上游 55 bp处的一段
CT微卫星序列(microsatelli te)。他们设计了 1对引物
“484/485”, 对该CT重复序列进行PCR扩增, 在不同水
稻品种中共发现 6种(CT)n多态性。Ayres等(1997) 用
该引物对近 80年来育成的 92个美国水稻品种Wx位点
上(CT)n的多态性进行了分析, 以研究现代美国水稻品种
中Wx 基因的来源和谱系。在这 92 个品种中, 他们共
检测到8种(CT)n多态性, 并发现(CT)n标记和直链淀粉
含量存在显著相关性, 微卫星等位基因可以解释非糯品
种中 82.9% 的表观直链淀粉含量变异。四川农业大学
万映秀等(2 00 6 )利用微卫星标记 R M 1 90 和 4 84 /
W2R2ACCI标记分析了 50个水稻非糯品种Wx基因的
等位性变异, 结果发现这 2个标记可将供试材料划分为
1 0 种等位基因变异类型。进一步分析结果表明 ,
RM190揭示的Wx基因多态性可以解释直链淀粉含量
变异的59.3%; 484/W2R2ACCI揭示的Wx基因多态性
可以分别解释直链淀粉含量及胶稠度变异的 56.1% 和
24 .6%; 而 2 个标记共同可解释直链淀粉含量变异的
72 .4%。
Shimada等(1993)分离出水稻Wx基因外显子 4和
外显子 9之间的一个 1.0 kb片段, 使之与 PBI221质粒
的 CaMV 35S启动子和GUS基因反向连接后再用电击
法导入水稻原生质体中, 结果发现在愈伤组织中即可检
测到GUS 活性, 由此表明融合基因反义部分也获得表
达。另外, 他们还发现再生的转基因水稻植株中也检测
到GUS活性, 并产生了几个水稻种子直链淀粉含量明显
减少的植株。即使是四倍体, 直链淀粉含量还有轻微下
降, 这说明即使内含子序列包含在内, 反义基因也能使目
标基因的表达水平下降。此外, 人们还发现水稻Wx基
因在胚乳、花粉、胚囊和糊粉层中都能表达, 且低温
对其表达有促进作用(Umemoto et al., 1995)。陈丽等
(1997, 1999)依据反式作用原理初步探讨了Wx基因的
特异性表达机理, 结果在其 5非编码区发现许多顺式作
用元件, 并分离了与之结合的核调控蛋白。他们在 5端
上游找到1个增强Wx基因表达的区段(-861 bp--640
bp), 它包含 5段与核蛋白因子结合的序列, 即Hinfla-2、
Hinflc -1、Hinflc -2、Hinfld和 Rsale, 其中后两者的重
叠序列为 AACGT, 而 1个含 AACGT 3次重复的区段
(-839 bp--809 bp)即为Wx基因的顺式作用元件, 随
后他们还利用该顺式元件构建“鱼饵”质粒, 通过酵母单
杂交的方法从水稻 cDNA 文库中筛选到 13个核蛋白基
因的阳性克隆。唐威华等(2000)又分离并纯化出 1个与
富含AT的DNA区段相结合的HMG(high mobili ty group
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prote in)型核蛋白。
已有研究证明, 水稻Wx基因的转录能力与Wx 蛋
白含量及直链淀粉含量关系密切。Wang等(1995)发现
Wx基因有 2种转录本, 其片段大小分别为 2.3 kb和
3.3 kb。据此将Wx基因转录本分为 3种类型: j 高直
链淀粉含量的籼稻品种产生成熟的 2.3 kb mRNA; k
中、低等直链淀粉含量的籼、粳稻品种除产生 2.3 kb
mRNA外, 还产生第1内含子未被切除的3.3 kb的前体
mRNA; l 糯稻只产生痕量 3.3 kb的前体mRNA。然
而, 葛鸿飞等(2000)研究发现, 糯稻也具有从转录本中剪
接第 1内含子的正常能力, 其缺乏直链淀粉是由于第 1
内含子中某些碱基发生突变的结果。这与 Iss hi k i 等
(2000) 的报道一致, 即Wx基因第 1内含子 5端保守序
列中的GT 突变成 TT 是造成中、低等直链淀粉含量品
种的W x 基因第 1 内含子剪接效率低的原因。
为了深入探讨Wx基因的表达调控机理, 人们对降
低水稻直链淀粉含量的 dull突变基因如何抑制基因的表
达进行了研究。目前已发现9种不同的水稻du基因, 已
经定位的都不在第 6染色体上(Wx基因所在的染色体),
其中du-1和du-2基因使Wxb转录剪接效率大大降低, 而
对Wxa前体mRNA的剪接无太大影响, 这说明 du-1和
du-2是控制W xb 转录剪接效率相关基因的突变基因
(Isshiki et al. , 2000)。据此可以分离、克隆不同的基
因及其核调控蛋白, 再依据反式作用原理剖析Wx基因
的时间和组织特异性表达机理, 从而为在分子水平上改
良稻米品质提供理论依据。
2.3 可溶性淀粉合成酶基因
可溶性淀粉合成酶(SSS)与GBSS、淀粉分支酶(SBE)
相互作用分别合成直链淀粉和支链淀粉, 并影响淀粉的
链长和分支频率。Baba和Tanaka(1993)用阴阳离子交
换层析法从水稻未成熟种子的可溶性提取物中分离出 3
种分子量分别为 55 kDa、57 kDa和 57 kDa 的 SSS,
每一种又进一步用亲和层析法纯化。用由GBSS 制备
出来的抗血清与上述 3种蛋白进行Western杂交, 结果
表明 3种蛋白的氨基酸序列同源性很高(除 55 kDa蛋白
在 N末端缺少8个氨基酸残基外), 由此推断这 3个蛋白
是同一基因的产物。用合成的寡核苷酸作为探针从未
成熟种子中分离出 cDNA克隆, 序列分析初步推测其编
码氨基酸序列中含有作为淀粉和糖原合成酶的ADPG结
合位点的 lys-X-gly-gly保守序列, 由此可以认定这个蛋
白就是水稻未成熟种子中的 S S S。该酶的前体含有
626个氨基酸残基, 包括 N末端的由 113个氨基酸残基
组成的转运多肽。成熟 SSS 与GBSS 和 Escherichia
coli糖原合成酶的序列相似性很低, 但3个酶中的许多区
域包括底物结合位点是高度保守的。斑点杂交分析表
明编码SSS的基因为单拷贝, 并在叶片和未成熟种子中
表达。Northern杂交结果显示在开花后 5-15天, SSS
mRNA含量最丰富, 其mRNA的积累方式与SBE相同。
这些结果说明 SSS和GBSS在淀粉合成中起不同的作
用。随后, Tanaka和 Baba(1995)以该 cDNA 片段为探
针获得了 SSSI基因组克隆。通过比较 SSSI cDNA 与
其基因组克隆时发现, 前者转录物(2.7 kb)比后者外显子
总长(2.5 kb)大 200 bp, 这可能是因为SSSI 基因的 5
端非编码区还有 1个外显子。两者在转运肽内都含有保
守序列 lys-ser-gly-gly, 该序列是淀粉合成酶结合ADP-
葡萄糖的位点。
有关可溶性淀粉合成酶基因在淀粉合成中的具体作
用及其机理尚不清楚。但人们已经开始了有益的探索,
如 Jiang等(2004)研究发现, 水稻可溶性淀粉合成酶 II由
3种基因编码, 其中 SSSII -1在胚乳、叶片和根中都表
达, SSSII-2只在叶片中表达, SSSII-3则主要在胚乳中
表达。基因序列分析表明后两者同源性很高。他们还
发现基因SSSII-3与Umemoto等(2002)报道的SSSIIa
及高振宇等(2003)报道的糊化温度ALK 基因是同一基
因。该基因在不同水稻品种间有一定的序列差异, 特别
是基因编码区内存在碱基替换现象, 导致了氨基酸序列
的改变, 其结果可能造成了 SSSII酶活性的变化, 进而
影响支链淀粉的中等长度分支链的合成, 使淀粉晶体层
结构改变, 最终表现为糊化温度(g e l a t i n i z a t i o n
temperature, GT)的改变, 这也是籼、粳亚种间支链淀
粉结构不同的主要原因。Fujita等(2006)利用逆转座子
Tos17插入法获得了 4种 SSSI不同程度缺失的水稻突
变体。他们发现, 这些突变体胚乳中支链淀粉链长分布
747王忠华等: 稻米淀粉品质形成的关键酶及其分子生物学研究进展
的变化程度与SSSI活性的降低程度呈正相关, 即活性
丧失的越多, 支链淀粉链长变化幅度越大。他们还发
现, 尽管SSSI活性完全丧失, 但并不影响种子的形状和
大小、淀粉颗粒及胚乳的晶体结构。由此他们推断支
链淀粉链的形成可能是由 SSSI、SSSIIa和 SSSIIIa协
同作用完成的。最近, 该课题组采用逆转座子Tos17插
入和化学诱变相结合的方法成功筛选出SSSIIIa完全缺
失的水稻突变体(Fujita et al., 2007)。与 SSSI缺失相
比, 该突变对淀粉含量与结构的影响很大, 由此表明
SSSII Ia对水稻胚乳的发育是非常重要的。
2.4 淀粉分支酶基因
水稻淀粉分支酶(RSBE, 又称Q酶)能切开a-1, 4糖苷键
连接的葡聚糖并将短链通过a-1, 6糖苷键连接到受体链
上形成支链淀粉。因此, 它在淀粉的生物合成中起着非
常重要的作用。Mizuno等(1992)用玉米BE2I cDNA作
为探针分离到水稻的 BE2I cDNA 克隆。研究结果表明
水稻 BE2I基因最初编码含 820个氨基酸残基的前体蛋
白, 包括N末端的由64或66个残基组成的转运多肽; 成
熟 BE2 I含有 756 (或 754 )个氨基酸残基, 分子量约为
86.7 kDa(或86.5 kDa)。Northern杂交结果显示, BE2I
mRNA 在开花后 7-15天大量积累, 以后迅速下降, 而
BE2I蛋白的积累要明显延迟, 但 RBE3蛋白的积累比
BE2I要早一些。这种表达方式与Wx基因一致, BE2I
和 W x 基因的表达均在种子发育中期达到最高。对
BE2I基因的结构进行分析, 发现BE2I基因有14个外显
子和13个内含子, 其侧翼区域都含有许多启动子的共有
序列, 它们可能是这个基因的启动子; 许多重复序列和
G-box基元也在启动子区出现, 由此表明反式作用因子
参与了 BE2I基因表达的调控(Kawasak i et al. , 1993)。
Nakamura和Yamanouchi(1992)报道了QE2I的cDNA
序列, 全长为 2 758 bp, 包含 1个长度为 2 460 bp的开
放阅读框架。他们还将QE2I基因定位于第 6染色体上
的标记R1167 和G 342 之间, 并证明其是单拷贝的
(Nakamura et al. , 1994)。Kawasaki 等(1996)在研究
水稻粉质(fro-2)突变体时发现, f ro-2位点位于第4号染
色体上, 其导致开花后 10 天的未成熟发育种子编码
SBE的基因表达大为下降。但 RBE1作图结果表明该
RBE1基因位于第 6号染色体上, 表明野生型 Floury-2
是通过反式作用调控RBE1基因表达的。但在 f ro-2突
变体种子中同时也发现编码其它酶如RBE3和GBSS的
基因表达也下降, 虽然 fro-2突变体未成熟种子的RBE1
基因表达水平很低, 但突变体和野生型叶片中的 RBE1
基因表达并无差异, 表明 Fro-2基因可能在种子发育的
特异阶段调节一些参与淀粉合成的基因的表达。
为了研究RBE1和RBE3基因在功能和表达调控上
的差异, 研究人员分别筛选了其相应的突变体。Mizu-
no等(1993)研究发现, 水稻ae突变体中的ae基因(位于
第 2染色体上)就是 RBE3基因的突变基因(启动子区的
碱基发生突变)。Harrington等(1997)利用 RFLP 分子
标记图谱技术将SBEII I定位于第2染色体上, 其两侧为
CO718和RG157标记, 并检测到多拷贝杂交模式, 这表
明该位点上可能存在着串联重复基因。Satoh等(2003)
采用N甲基N亚硝脲(N-methy l-N-nit rosourea, MNU)处
理可育的雌配子获得 BE I 缺失突变体。遗传分析表明
该突变体受一对隐性基因控制, 被命名为 sbe1。有趣
的是, 该突变体表现出正常的胚乳表型, 并且其淀粉含
量与野生型相同, 但支链淀粉的结构明显发生改变。当
长链聚合度为 37及短链聚合度介于 12-21之间时, 突
变体中的支链淀粉含量显著下降; 而当短链聚合度为10
时, 其含量显著增加。由此表明, BEI可以特异性地合
成 B1 和 B2-3链。
2.5 淀粉去分支酶基因
淀粉去分支酶除在种子发芽过程中水解支链淀粉的 a-
1, 6分支外, 还参与植物淀粉的合成。它在淀粉合成中
的作用模型为: 淀粉合成酶在淀粉粒表面以短糖链为底
物进行延伸, 当糖链延伸到一定长度后淀粉分支酶才起
作用, 即通过“剪”、“贴”过程形成分支链, 随后淀粉
去分支酶剪切各分支链到适合的长度, 再次作为淀粉合
成酶的底物。这样一轮循环后淀粉颗粒就向前延伸了 1
轮, 且为下轮做好准备(Ball et al. , 1996)。
水稻去分支酶(DBE)分为 2类, 即 R酶(又称极限糊
精酶)和异淀粉酶。Nakamura等(1996a)首先分离到水
748 植物学通报 25(6) 2008
稻 R酶基因的 cDNA克隆, 随后以该 cDNA为探针筛选
到 R酶的基因组克隆。与大麦(Hordeum vulgare)等的
R酶基因进行比较发现, 不同作物间R酶基因的大部分
外显子都是高度保守的(Francisco et al. , 1998)。1999
年他们又获得了水稻异淀粉酶基因的 cDNA 克隆, 该
cDNA克隆与玉米Sugary-1异淀粉酶基因的序列同源性
很高(Kubo et al. , 1999)。水稻糖质(sugary-1)突变体
的胚乳有 2个不同区域: 植物糖原域和淀粉域。糖原域
内 a-1, 4链的 A链增加而 B链降低, 该域的淀粉分支结
构消失。进一步分析发现, 该突变体中异淀粉酶和 R酶
的活性都显著降低, 不过前者在整个胚乳中几乎完全缺
乏活性, 而后者只在糖原域中活性降低。这说明它们都
参与了淀粉合成, 但异淀粉酶基因在决定支链淀粉分支
结构时起主要作用, R酶基因则通过弥补异淀粉酶基因
功能而影响淀粉的分支结构。同时还发现水稻 Sugary-1
基因即为编码水稻异淀粉酶的基因(Nakamura et al. ,
1996b, 1997; Kubo et al. , 1999)。现已知 Sugary-1
基因位于第 8号染色体上(Yano et al. , 1984), 因此
sugary-1突变体中的损伤基因不可能是位于第 4号染色
体上的 R 酶基因, 但是 R 酶活性也降低, 这就暗示
Sugary-1基因产物可能通过某种反式作用调控着R酶基
因的表达。这种反式调控机理还需进一步探明。
3 研究展望
随着分子生物学和各项检测技术的发展以及扫描电镜、
高效液相色谱、淀粉粘滞谱速测仪和质地分析仪等仪
器在稻米品质分析中的广泛应用, 人们对稻米淀粉粒的
形态结构、排列方式、淀粉粒发育过程中的各种生理
变化及其与稻米品质表现之间的联系, 尤其是其中一些
关键酶在不同条件下的活性变化及其主要调控功能有了
初步的了解, 特别是对某些关键酶在水稻籽粒灌浆及稻
米品质调控中的作用将会有更深入的了解, 从而可望有
效推动稻米品质的遗传和生理研究, 提高优质稻米的选
育效率, 促进籽粒灌浆并改善稻米品质。这对于指导今
后的稻米改良研究工作具有较大的现实意义。如东北
农业大学沈鹏等(2006)选用稻米蒸煮食味品质有显著差
异的 4个粳稻品种, 对水稻籽粒灌浆过程中淀粉合成关
键酶的活性变化及其与蒸煮食味品质的关系进行了研
究。结果发现, 不同品质类型的水稻品种间籽粒直链淀
粉和支链淀粉含量在灌浆前、中、后期有差异, 这种
差异主要表现在灌浆不同时期的淀粉积累速率上。他
们还发现, 在籽粒灌浆过程中, 不同品质类型品种中的
ADPG焦磷酸化酶和可溶性淀粉合成酶活性出现峰值的
时间无差异, 但劣质品种的淀粉分支酶活性峰值出现时
间明显早于优质品种, 而且优质品种在灌浆中、后期仍
然保持较高水平的分支酶活性。A DP G 焦磷酸化酶、
可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶的活性与直链和支链淀
粉含量、味度值、快速粘度分析(rapid visco analysis,
RVA)谱特性间的相关性和程度因灌浆时期不同而发生变
化。在整个灌浆过程中, 可溶性淀粉合成酶活性与味度
值间的相关性均不显著 , 但灌浆前期和中、后期的
ADPG焦磷酸化酶和淀粉分支酶的活性与味度值间呈显
著或极显著相关。由此表明, 选择灌浆前期酶活性低或
灌浆后期酶活性高的材料, 将有利于提高稻米蒸煮食味
品 质 。
在过去的10年里, 淀粉生物合成方面的研究取得很
大突破。同时, 部分控制淀粉合成相关酶的主效基因已
得到分离和鉴定。但由于参与淀粉合成的酶数目众多,
包括GBSS、SS S、SBE 和 DB E 等, 其对应的基因
有 17 个之多(Nakamura, 2002)。由此可见, 淀粉的组
成和结构性状十分复杂, 要对其实现遗传调控确实相当
困难。加之目前对各个基因位点上的复等位基因及其
遗传效应的估计还不是十分清楚, 从而阻碍了水稻优质
育种工作的步伐。今后需进一步加强对稻米品质相关
基因的克隆、分子特性及其表达调控的研究, 更好地利
用分子标记辅助选择及转基因技术来提高水稻优质品种
选育效率。例如, 目前稻米品质基因工程所利用的主要
是GBSS 和 RBE 基因, 而很少利用其它淀粉合成相关
基因, 为加快优质稻米分子育种的步伐, 有必要尽快实
现转基因的多元化。对于稻米品质生理研究, 许多报道
都只是针对稻米最终品质指标性状的分析, 而对于品质
形成过程及其机理的研究则相对较少, 尤其是对于籽粒
灌浆过程与稻米品质形成之间的关系, 目前还缺乏深入
749王忠华等: 稻米淀粉品质形成的关键酶及其分子生物学研究进展
的认识。这一问题的解决, 将使我们可以从同化物输入
这一灌浆源头抓起, 调节和改善与灌浆过程有关的各个
环节, 从而有效改良稻米品质。
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Research Advances in the Key Enzymes Involved in Rice Starch
Quality Regulation
Zhonghua Wang1, 2*, Tingjie Yu1
1In sti tute of Bi ote chn olog y, Zhe jia ng Wanl i University, Ni ngb o 3 151 00, Chi na
2In sti tute of Nu cle ar Agricul tural Sci ences, Zhe jia ng Uni versity, Hang zho u 3 1002 9, Chi na
Abstr act The compos ition, s truc ture and accumulation of rice starch are key fac tors aff ecting grain quality and yield. Therefore,
the key enzymes involved in the f ormation of rice starch need to be studied. With the development of molecular biology techniques,
research into r ice s tarch quality has made ex tensive progress . This review summarizes the progress of these key enzymes,
including ADP-glucose py rophosphorylase, starch synthase, s tarch branching enzyme and de-branching enzyme, and their roles
involved in rice s tarch biosynthes is. Prospects for f uture research are also discussed.
Ke y words ge ne clon ing , g ene exp ressio n, key enzyme s, rice starch qu ali ty
Wa ng ZH, Yu TJ (2008 ). Research a dva nces in th e ke y e nzymes involved i n rice sta rch qu alit y regu lati on. Ch in Bull Bo t 25 , 74 1-752.
* Author f or correspondence. E-mail: w ang1972@zw u.edu.cn
(责任编辑: 刘慧君)