全 文 ：植物学通报 2005, 22 (6): 753~760
Chinese Bulletin of Botany
①国家自然科学基金项目(30370234)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: rsgu@nsfc.gov.cn
收稿日期: 2004-11-18 接受日期: 2005-04-20 责任编辑: 于昕
专 题 介 绍
树木复幼的研究概述①
1裴 东 2谷瑞升②
1(中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091)
2 (国家自然科学基金委员会生命学部 北京 100085)
摘要 幼龄树木通常具有良好的生根能力、旺盛和通直的生长习性与较强的抗性, 然而随着树木的
成熟这些特性会逐渐丧失。复幼是使成熟树木重现某些幼态性状的过程。成熟树木的复幼和幼态保持
是林木生产、无性繁殖、遗传改良和生物技术在林木中应用中十分重要的科学问题。本文对树木的组
织和器官保持幼态的特性、顶端分生组织表达幼态的潜能、与复幼相关的生理、生化和分子生物学以
及复幼方法等方面的研究进行了概述, 并对今后的研究和需要解决的关键问题提出了意见和建议。
关键词 树木, 复幼, 成熟态, 生根
A Review on the Rejuvenation of Mature Trees
1PEI Dong 2GU Rui-Sheng②
1(Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091)
2(National Natural Science Foundation of China, Beijing 100085)
Abstract Rejuvenation is a key issue in the clonal propagation of trees and the application of
biotechnologys to trees. Normally, juvenile trees have a strong rooting capability, vigor, straight-
up growth and high pest resistance, which highly underline the tree’s production. However, with
development, the tree gradually loses these characteristics to enter a mature phase. Rejuvena-
tion is a reverse process of the tree’s development to turn the mature phase into the juvenile
phase. This paper describes research advances on juvenile character preservation in tissues or
organs during tree development; potential juvenile competence in apical meristem; understand-
ing the rejuvenation mechanism at the physiological, biochemical and molecular levels; and
rejuvenation methods. Some questions in rejuvenation research are raised and further research
emphases discussed.
Ked words Trees, Rejuvenation, Mature, Rooting
树木在生长发育过程中存在两个明显的
年龄时期, 即幼龄期和成龄期, 不同年龄时期
具有明显不同的发育特征。幼龄树木通常具
旺盛和通直的生长习性与较强的抗逆性, 特别
是具有良好的生根能力(Bonga, 1987)。然而
随着树木的成熟这些特性会逐渐丧失, 插穗形
754 22(6)
成不定根的能力逐渐下降。因此, 保持和恢
复树木幼态特性不仅对于林木生产和良种无
性繁殖具有重要的实践意义, 而且也是实现体
细胞再生和生物技术在林木上应用的重要前
提, 是林学和植物发育生物学中一个十分重要
的科学问题。自 Doorenbos (1954)发现人工
措施能够诱导常春藤(Hedera he l i x )复幼
(rejuvenation)以来, 树木复幼的研究受到极大
关注。科学家在此开展了大量的研究, 从器
官水平的表观特征到细胞水平的显微、亚显
微结构, 从生理代谢到分子水平的基因表达都
进行了探讨。尤其是试管培养技术的日渐成
熟使得复幼研究有了良好的实验体系, 因而对
复幼机制和方法的认识也不断深入。本文从
树木组织和器官保持幼态的特性、顶端分生
组织表达幼态的潜能、与复幼相关的生理、
生化和分子生物学以及复幼方法等方面对树
木复幼的研究进行了概述, 分析了研究中存在
的问题, 并讨论了今后的研究方向和重点。
1 树木复幼与表型特征的变化
复幼是指成熟或部分成熟态的器官、组
织和细胞成熟特征的消失和某些幼态特征的
重现。它分为局部复幼和完全复幼, 局部复
幼是指恢复形成不定器官, 如形成不定根和不
定芽的能力; 完全复幼是指恢复形成不定胚的
能力 (Bonga, 1987)。树木的成熟和幼龄标准
通常是以营养生长和生殖生长的转化以及不
定器官发生能力来划分的。开花及部分或完
全丧失不定根发生能力即为成熟的标志, 而保
持旺盛的营养生长、具有良好的不定根发生
能力即是处于幼龄状态。
比较发现, 幼龄和成熟态树木之间在表型
特征上存在明显差异, 通常表现为幼态树木比
成熟态树木的树干更为通直, 分枝多为锐角, 顶
端优势更为明显, 树形为圆锥状; 树皮平滑; 叶
片不分裂或锯齿程度浅, 叶片大而薄, 针叶树
种的针叶长, 叶片颜色较浅; 秋季落叶晚。成
熟态树木的树冠呈平顶状, 分枝成钝角, 枝条
节间短; 树皮厚而粗糙; 叶片深裂或锯齿深,
叶片小而厚, 叶脉稠密, 针叶树种的针叶短,
叶色较深。
幼龄和成龄树体分生组织结构也存在差
异。幼态树木顶端分生组织比较尖, 茎尖亚
顶端区域大, 细胞分裂区长, 分生细胞中核糖
体游离, 染色质不浓缩, 细胞核小, 由一层细胞
质包围。而成熟态树木, 顶端分生组织突起
而呈大圆顶, 分生细胞中核糖体与膜结合, 染
色质浓缩, 细胞核由内质网膜包围 (Bonga,
1987; Greenwood et al., 1989; Day et al.,
2002)。
树木的复幼及成熟可以直观地表现在树
体的表型特征上, 然而复幼和成熟并不意味着
所有幼态和成熟特征一致和同时改变, 而是各
自独立或相对独立地改变, 并且是个渐进的过
程 (Poethig, 2003)。树木某一特征的复幼并
不意味着其他特征也相应复幼, 例如一些难生
根的苹果(Malus pumila )无性系, 从其根系上
诱导产生的不定芽表现出了幼态特征, 有较强
的生根能力, 而二年生植株即可开花, 说明复
幼过程中成花和生根特性是各自独立的
(Robinson and Schwabe, 1977)。Greenwood
等 (1989) 在研究成熟过程中的落叶松(Larix
decidua)形态特征变化时发现, 随着年龄增长
有些特征的改变明显地表现出两个时间过程,
一是树高与年龄的对数在1~5年内变化较小,
之后却迅速下降; 二是单位主干横径的直立生
长指数和分枝数与年龄的对数在1~5年内迅
速下降, 而后变化较小等; 然而有些特征的变
化却比较平稳, 如叶片叶绿素含量、生根率
和主干纵向生长量等均与年龄的对数呈线形
相关; 外部形态特征的改变方式至少间接地
反映了调节这种变化的某些内部机制, 说明
了成熟或复幼过程或许是部分基因片段的
钝化或激活, 一个基因或一组基因受控于一
个调节机制。
7552005 裴 东等: 树木复幼的研究概述
2 树木组织或器官具有维持幼态
的潜力
树体在发育过程中, 由于顶端分生组织在
结构和行为上的改变使得树体由幼龄期向成
龄期过渡, 然而形成的组织和器官又具有潜伏
或部分潜伏幼态特征的能力, 表现在分布于树
冠不同部位或分枝级数不同的枝条上的分生
组织幼态程度是不同的, 这也是树木抵御逆
境、适应自然的一种生存方式。一般认为根
是幼态的, 因而具有保持营养繁殖和再生植株
的能力。树干基部的分生组织比上部的幼化,
如树冠下部靠近主干的部位的枝条其分生组
织是比较幼态的, 而树冠顶端枝条及其分生组
织比较成熟 (Peer and Greenwood, 2001)。利
用同位素示踪方法也证实: 树干基部分生组织
有丝分裂活性低, 其中的细胞很少合成核糖核
酸和蛋白质, 其细胞核高尔基体、内质网都
很少, RNA、DNA及蛋白质的水平较低, 是
相对钝化的 (Poethig, 1990), 正是这些部位可
能成为保持分生组织相对幼态的细胞库。树
木维持幼态的特性已在诱导复幼中得到广泛
的应用, 如采用重剪或砍伐树木等方法迫使树
体从基部萌发枝条, 以达到复幼的目的; 采用
靠近根茎的枝条为插穗更利于诱导生根; 取树
冠基部的分生组织易于在试管中诱导复幼。
3 树木分生组织具有重复时间和
空间表达幼态的潜力
树木的成熟是随年龄的增长而增加的, 然
而一些研究表明顶端分生组织在年生长周期
内表达幼态的潜力是不一致的。在一百年生
巨杉(Sequoiadendron giganteum)复幼实验中,
萌芽前后取分生组织进行复幼诱导的成功率
大 (Monteuuis, 1987)。研究幼态和成熟态巨
杉顶端分生组织的生理生化指标发现, 与幼态
有关的 J-16蛋白质、核苷酸等在萌芽前后成
熟和幼态间表现出很小的差异, 但随着枝条的
伸长, 差异越来越明显 ( M o n t e u u i s a n d
Gendraid, 1987; Bon and Monteulus, 1991), 这
就从生理生化角度说明, 树木在萌芽期分生组
织有较强的表达幼态的潜能。
4 复幼的激素调节
激素是植物生长和发育的调节因子, 因而
在树体复幼过程中发挥着重要作用。实验证
实, 外用生长调节剂可促进成熟树木复幼, 如
喷施GA3可诱导成熟常春藤植株出现幼态特
征 (Hackett, 1985)。试管培养中, 附加细胞分
裂素或细胞激动素可以诱导多种木本植物产
生复幼的试管嫩茎 (von Aderkas and Bonga,
2000; 裴东等, 2002)。然而, 对外源生长调节
剂与内源激素的相互关系、内源激素调节复
幼的机制现在还不十分清楚。
藨对常春藤和茶 子(Ribes nigrum)无性系
砧木的研究发现, 在顶芽和根中, 幼态植株较
成熟态有较高水平的赤霉素类物质, 将根系去
除, 无论是幼态植株还是成熟态植株其茎、
顶芽以及叶片中赤霉素类物质含量会显著降
低, 所以根系对维持茎、顶芽和叶片中较高
水平的赤霉素和保持其幼态特征起重要作用
(Bonga, 1987)。对疣皮桦(Betula verrucosa)
的研究发现, 树体由幼态到开花的成熟态, 长
枝顶芽与腋芽中的激素水平存在明显差异, 幼
态树体顶芽中含有较高水平的促进生长激素
类物质, 而腋芽状况与之相反; 生长抑制类物
质脱落酸(ABA)水平在具有开花能力的四年生
植株中含量最高, 幼态植株和高于四年生的成
熟植株 ABA含量均较低 (Galoch, 1985)。
Perrin 等 (1997) 发现内源细胞分裂素水平与橡
胶树(Hevea brasiliensis)复幼有密切关系, 并
且认为内源细胞分裂素水平可以作为橡胶树
复幼的生化指标。我们的研究结果发现 IAA/
ABA比值可以较好地反应离体器官的幼化程
度 (裴东等, 2002)。
756 22(6)
5 复幼与特异蛋白
关于成熟态与幼态树木间以及二者与复
幼植株间生理生化代谢的差异, 如酶活性、
蛋白质、核苷酸及酚类含量等方面已有大量
研究 (Hackett et al., 1991; Claudot et al., 1997;
Fernandez et al., 1999; 裴东等, 2003), 这些结
果多反映的是复幼或成熟的结果而不是原
因。另外 , 多数差异是树种特异的 ( v o n
Aderkas and Bonga, 2000)。在这些研究中值
得注意的是复幼特异蛋白质。
Bon 和Monteuuis (1991) 通过 SDS聚丙
烯酰胺凝胶电泳对巨杉幼态、成熟态和复幼
植株的茎尖蛋白质进行了全年不同时期分离,
发现16 kD片段的膜结合蛋白 (J-16蛋白) 始
终只存在于幼态材料中, 通过微型嫁接获得复
幼植株中也发现有这一蛋白。但是, 利用同
样的提取和纯化方法, Amo-Marco 等 (1993) 未
能在欧洲板栗(Castanea sativa)幼态枝条中发
现特异的J-16蛋白, 然而他们却在成熟组织中
发现了 38.0和43.6 kD两个特异的多肽条带,
这一结果与Brand和Lineberger (1992) 在疣皮
桦上的研究较为一致。Hackett等 (1991) 在
研究幼态和成熟态常春藤叶柄生根过程中的
多肽时发现, 幼态叶柄在生根诱导初期产生了
一个专一性多肽(pI约为9, 约25 kD), 成熟态
叶柄也有一个特异性多肽(pI约为 5.3 , 约
28 kD), 目前还不清楚这两个多肽的功能。
Besford 等(1996) 在欧洲甜樱桃(Prunus avium)
幼态茎尖上鉴定出过量表达的12 kD 蛋白质,
这一蛋白质同源于高等植物5-氨基乙酰丙酸
脱水酶。Garcia 等 (2000)在橄榄树(Olea
europaea)上发现35 kD蛋白质在成年组织中
高量表达。
特异性蛋白的研究不仅鉴定出复幼组织
的生化标记, 为复幼的早期鉴定提供依据, 而
且为复幼的蛋白质组学和功能基因组学研究
奠定了基础。
6 复幼与基因表达
对复幼过程中基因表达进行分析是研究
复幼分子调控的有效手段, 目前已获得了一些
结果 (Day et al., 2002)。
幼态组织具有较高的基因转录活性。对
常春藤茎尖愈伤组织及叶组织中RNA研究发
现, 幼态较成熟态的 RNA水平高。幼态巨杉
休眠期茎尖细胞中的RNA/DNA显著高于成
熟态, 而随着树木萌芽, 这种差异越来越小
(Monteuuis and Gendraud, 1987)。这一结果
与萌芽前后易于诱导成熟树木复幼相吻合。
RNA水平变化反映出了基因表达的活跃程度,
也反映出组织和细胞的代谢水平。
深入研究基因的转录和表达, 发现了幼态
和成熟态组织中确实存在基因表达差异, 但这
种差异是很小的。Hutchison和 Greenwood
(1991) 对落叶松幼态和成熟态植株中与光合有
关的cab和rbcs基因簇进行了仔细研究, 发现
在幼态植株新抽生的短枝叶片中稳定状态的
cab基因簇转录的mRNA水平较成熟态的高
约 40%。而 rbcs基因簇变化很小。进一步
建立成熟态和幼态短枝芽细胞的cDNA文库,
筛选幼态和成熟态的专性克隆, 发现每个文库
没有一个克隆在幼态或成熟态中表现出显著
差异, 说明了专性表达的转录水平是极低的, 测
定的精度是不够的。幼态常春藤叶肉细胞含
有花色苷, 为红色, 这是与成熟态不同之处。
Hackett等 (1991) 克隆了合成二氢黄酮醇还原
酶(DFR)基因, 证实具有活性的DFR是催化花
色苷合成的最后一步, 成熟态叶组织中没有
DFR转录的mRNA的积累。这一结果说明花
色苷合成在幼态和成熟态叶肉细胞的差异是
基因在表达DFR酶活性上表现出了差异, 且这
一差异是在转录水平上的。
Poething (1990) 提出了DNA甲基化调节
树木阶段转化的假说。在动物和草本植物发
育和体细胞胚发生的研究中发现, DNA中胞嘧
7572005 裴 东等: 树木复幼的研究概述
啶甲基化与基因活化和钝化有着密切关系, 然
而在木本植物研究中关于树木成熟和复幼与
DNA胞嘧啶甲基化报道较少。在落叶松的研
究中发现, 幼态和成熟态枝条中提取的总DNA
甲基化没有明显差异 (Greenwood et al . ,
1989)。Baurens 等 (2004) 在比较马占相思
(Acacia mangium)成熟态和幼态试管微枝之间
DNA甲基化水平时, 虽然在总量上没有发现明
显差异, 但是通过甲基化敏感性扩增多态性分
析表明, 在所分析的C5mCGG位点中, 分别各
有 3个位点的甲基化在幼态和成熟态微枝中
是特有的。这一结果初步表明, 基因的甲基
化或许参与了树木的成熟过程。
细胞内质体编码的遗传信息对生物体成
熟或衰老的影响正越来越受到人们的重视。
Huang等 (1995) 利用DNA限制性片段长度多
态性分析技术在幼态和复幼北美红杉(Sequoia
sempervirens)苗的线粒体中鉴定出特异的4.0
和 3.6 kb BamHⅠ——限制性片段。对线粒
体进一步分析发现: 幼苗至少包括了6个小的
环状线粒体DNA, 其中有4个是幼态苗和复幼
苗特异的(Huang et al., 2003)。
尽管基因控制树木成熟和复幼已获得了
一些重要结果, 但要深入阐述其机理, 尚需要
开展大量的研究。表观遗传学机制在树木成
熟和复幼中的作用应当受到高度关注
(Brunner and Nilsson, 2004)。
7 复幼方法
7.1 试管内连续多次继代培养诱导分生组
织复幼
现已证实试管内连续多次继代培养可以
使许多成熟树木的分生组织复幼。例如 :
Cabernet Sauvignon葡萄(Vitis vinifera)在试
管内经过一系列继代培养, 试管嫩枝明显地表
现出幼态特征, 如缺少卷须, 螺旋状叶序等
(Bonga, 1987)。通过试管培养诱导复幼的树
种还有:海岸松(Pinus p inas ter )、北美红
杉、北美崖柏(Thuja occidentalis)、日本柳
杉(Cryptomeria japonica)、葡萄、黑梅
(Rubus anglocandicans)、苹果、欧洲越橘
(Vaccinium uliginosum)、桉树(Eucalyptus
sp.)、落叶类杜鹃(Rhododendron sp.)和核
桃(Juglans regia)等 (Hackett, 1985; von
Aderkas and Bonga, 2000; 裴东等, 2002)。
在诱导复幼过程中发现: 培养基中高浓度细胞
分裂素(6-benzylamino purine, BAP)、低浓度
糖和适当环境胁迫(如温度和渗透胁迫等)利于
复幼 (von Aderkas and Bonga, 2000)。新组
织化的分生组织可塑性较大, 利于诱导复幼
(Greenwood et al., 1989)。在诱导一百年生
巨杉复幼中发现, 树体萌芽前后取材, 并且取
材足够小是至关重要的环节。萌芽前后树体
幼态表达潜能最大, 另外周围组织细胞可能对
分生组织的复幼有抑制作用 (Monteuuis ,
1991)。
通过试管继代培养产生的复幼多数属于
部分复幼, 如越橘、桉树和落叶类杜鹃品种
的茎尖, 经过一定次数继代培养诱导复幼, 突
出表现是生根能力增强 (黄学林和李筱菊,
1995), 培养出的植株在田间2~3年可成花, 没
有表现出推迟成花年龄的效果 (Robinson and
Schwabe, 1977)。因此这种复幼只是在生根
能力和某些表观特征上发生了改变。
7.2 不定芽和胚状体的诱导
一些试验结果表明, 由成熟树木上的细胞
诱导产生的不定芽和不定胚, 形成的植株表现
出一定程度复幼, 如推迟成花年龄, 提高生根
能力。从成龄葡萄茎尖叶原基上诱导产生不
定芽, 形成的小植株在形态和开花能力上都表
现出幼态特性, 从一些成龄树种如苹果、橄
榄树及枸骨叶冬青(Ilex aquifolium)的枝干基
部球芽上诱导产生不定芽以及一些难生根苹
果无性系的根系上诱导产生的不定芽, 发育形
成的枝条表现幼态特征, 有较强的生根能力
(Hackett et al., 1992)。
758 22(6)
参 考 文 献
7.3 利用生长调节剂诱导复幼
现已证实赤霉素可以诱导下列成熟树木
出现幼态特征: 常春藤、黑木金合欢(Acacia
melanoxylon)、柑橘(Citrus reticulata)、梨
属( P y r u s )、椰子( C o c o s n u c i f e r a )、桑
(Morus nigra)以及一些李属(Prunus)的种。
脱落酸可以促进一些经环剥处理的树木
开花和成熟 (Monteuuis, 1987)。在常青藤上
ABA具有抵消GA3诱导复幼的效果 (Hackett,
1985)。
乙烯具有促进植物由幼态向成熟态转
化。在一密闭培养容器内加入释放乙烯的介
质, 增加乙烯含量, 可以促进黄花菜(Hemero-
callis sp.)小植株由幼态向成熟态转化, 而加
入乙烯吸附物质高氯酸汞)及乙烯合成抑制剂
(AVG)可以阻止这一转化 (Smith e t a l . ,
1989)。
生长素及细胞分裂素直接应用诱导树木
复幼的研究较少, 在试管培养中诱导树木复幼
需要适宜的细胞分裂素与生长素浓度及配比,
并且高浓度细胞分裂素利于幼态特征的出现
(van Aderkas and Banga, 2000)。
7.4 重剪和砍伐树木等方法促发萌条或根
蘖来诱导复幼
Libby等 (1972) 在辐射松(Pinus radiata)
上证实, 通过重剪或其他方法刺激萌发枝条, 取
这类枝条进行扦插得到的幼苗与实生幼树有
极相似的表现。在树木繁殖实践中, 利用重
剪或砍伐树木等方法促发萌条或根蘖已成为
获得易生根插穗的常用措施 (黄学林和李筱菊,
1995)。
7.5 将成熟树木的茎尖嫁接在幼龄树上诱
导复幼
将成熟态常春藤的枝条嫁接在实生幼树
上, 从形态和生理上诱发了复幼, 并且嫁接微
型化,最好只有一个单芽, 有一定温度保证,可以
提高诱导效果(Hackett, 1985)。将试管培养的
成熟态北美红杉和柑橘无根苗的茎尖在无菌
条件下反复嫁接于刚萌发的实生砧木上, 可以
诱导复幼, 表现为生根能力逐渐提高 (Huang et
al., 1992)。先将成熟态树木的树条嫁接于幼
龄砧木上, 生长一段时间后, 取顶芽进行试管
培养可以使一些难复幼的树种如一些针叶树
种复幼 (Revila et al., 1996)。这一技术路线
可以作为诱导复幼的有效措施加以应用
(Danthu et al., 2002)。Thimmappaiah 等
(2002)已经成功地建立起了成龄腰果(Anacar-
dium occidentale)试管微枝嫁接复幼的技
术体系。
8 问题及展望
纵观树木复幼研究的进展, 可以看出, 至今
开展的工作多数针对的是复幼的结果, 而不是
原因, 一些方法虽然可以成功地诱导复幼, 但
对复幼机制还缺乏认识。对一些问题, 如: 成
熟树木复幼是由组织或器官中残留幼态细胞
的原位诱导, 还是由组织化细胞脱分化所引起;
是由遗传因素决定, 还是表观遗传因素决定等
等, 至今仍不清楚。利用试管培养技术, 通过
继代诱导, 反复嫁接于幼态组织等措施, 为难
于诱导复幼的树种提供了可行的方法。从分
子水平特别是基因表达和调控方面认识复幼
机制已经显示出良好的研究结果。我们相信:
随着研究水平的提高、实验体系的完善, 特
别是杨树全基因组测序完成, 一定会对复幼机
制有更深入的认识, 诱导的方法也会更趋简
单、有效、可行, 并将在林业生产中得到广
泛应用。
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