全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (5): 616-623, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-01-31; 接受日期: 2008-02-29
基金项目: 863计划 (No. 2006AA 09Z413)
* 通讯作者。E-mail: zhang-gy@mail.ts inghua.edu.cn
.综述.
植物细胞程序性死亡中的类 caspases蛋白酶
陈宇亮 1 , 张飞雄1, 张贵友 2*
1首都师范大学生命科学学院, 北京 100037; 2清华大学生物科学与技术系, 北京 100084
摘要 细胞程序性死亡对于植物的正常生长发育及病理过程具有十分重要的生物学意义。现有的实验证据表明, 细胞程序
性死亡在动物和植物中有许多相似之处, 但也各有特点。在植物中, VPEs、metacaspases和saspas es等酶类在细胞程序
性死亡过程中发挥了关键性作用。该文详细比较了动、植物细胞程序性死亡的差异, 并阐述了VPEs、m etacas pases和
saspases三种类cas pases蛋白酶在植物程序性细胞死亡中所起的作用。
关键词 metacaspases, 细胞程序性死亡, saspases, 液泡加工酶
陈宇亮 , 张飞雄 , 张贵友 (2008). 植物细胞程序性死亡中的类 caspases蛋白酶. 植物学通报 25, 616-623.
细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)是
指细胞在一定的生理或病理条件下, 为了维持内环境稳
定并更好地适应生存环境而采取的一种由基因控制的、
细胞主动的并且有序的死亡(Wyll ie, 1980)。细胞程序
性死亡因其在多细胞生物的生长发育、器官形成、癌
症成因等方面的关键作用, 已经成为当今生物学研究领
域的热点之一。
细胞程序性死亡普遍存在于所有单细胞或多细胞的
真核生物中。人们通过对线虫的研究逐步揭示了细胞
程序性死亡的分子机制, 进而推动了动物细胞凋亡研究
的深入。相比之下植物细胞程序性死亡的研究起步较
晚, 但是, 随着研究的深入, 人们发现细胞程序性死亡在
植物的生长发育过程中普遍存在, 如在木质部、胚胎和
导管的形成以及一些植物的再生、种子发育和叶的老
化等过程中都会发生(Pennell and Lamb, 1997), 而且
在植物对外部环境刺激(如非生物胁迫或抵抗病原体感
染)的响应过程中也具有十分重要的意义(Lam, 2004)。
1 动物细胞凋亡和植物细胞程序性死亡
的异同
细胞程序性死亡通常采取细胞凋亡(apoptosis)的形式,
但是二者的涵义并非完全一样。通常人们并未加以严
格区分而将这两个概念等同使用(Vaux, 1999; Vaux
and Korsmeyer, 1999)。由于植物细胞程序性死亡形
式的多样性, 以及与动物细胞凋亡存在的明显差异, 在近
期有关植物研究的文献中, 人们更多地使用细胞程序性
死亡这一更为准确的概念进行表述。
1.1 动物细胞凋亡和植物细胞程序性死亡的相
似点
在动、植物细胞程序性死亡过程中有许多相似的特点,
因此人们把动物细胞凋亡研究中的许多研究方法和实验
手段普遍应用于植物细胞程序性死亡的研究中。
从细胞形态学上来看, 植物细胞程序性死亡过程
中出现类似动物细胞凋亡的一些特征(Danon et al. ,
2000 )。而从分子水平上来看 , 动物细胞的凋亡通
路是由一类具有高度保守性的 caspases 酶类介导的
(Cohen, 1997)。Caspases 酶类通过水解天冬氨酸残
基 C末端的肽键(P1残基), 激活下游的 caspases 酶或
分解细胞内相关的底物蛋白, 导致细胞结构和代谢的改
变, 最后引起细胞凋亡(Earnshaw et al., 1999)。因此,
caspases 酶类也被称为死亡蛋白酶。实验结果表明,
植物在病原体感染处理(del Pozo and Lam, 1998)、 化
617陈宇亮等: 植物细胞程序性死亡中的类 caspases蛋白酶
学处理(de Jong et al., 2000)、NO处理(Clarke et al.,
2000)以及热激处理(Tian et al., 2000)下发生的细胞程
序性死亡过程中均可以检测出类 cas pases 酶类的活
性。同时, 常用的 caspases 酶类抑制剂可抑制这类活
性。在用menadione诱导烟草原生质体细胞程序性死
亡的研究中发现, caspases 的抑制剂Ac-DEVD-CHO
和Ac-YVAD-CHO可以阻止DNA的断裂和PARP(poly-
(ADP-ribose) polymerase)的降解(Sun et al., 1999)。
1.2 动物细胞凋亡和植物细胞程序性死亡的差
别
动、植物细胞在细胞形态及生理功能上存在明显的差
异, 因而在动物细胞凋亡和植物细胞程序性死亡过程中
存在的差异也十分显著。
植物细胞被细胞壁包围, 发生程序性死亡的细胞必
须自己降解自身物质。van Doorn和Woltering(2005)
将所有细胞程序性死亡分为3种在形态学上不同的类型,
即凋亡、自噬(autophagy)和非溶酶体参与的细胞程序
性死亡(non-lysosomal PCD)。植物在发育中或非生物
胁迫下的细胞程序性死亡过程中采取自噬的方式
(Iakimova et al., 2005), 而在植物超敏反应中所发生的
细胞程序性死亡类似于非溶酶体参与的细胞程序性死亡,
也称类 -坏死性细胞程序性死亡(necros is-l ike PCD)
(Greenberg and Yao, 2004)。由于细胞凋亡最为典型
的特征是形成凋亡体并被其它细胞吞噬, 而植物细胞程
序性死亡并不具有这一特点, 因此一般认为细胞凋亡仅
限于后生动物的细胞程序性死亡。
同时, 动、植物死亡蛋白酶的细胞内定位是不同
的。在植物中, 液泡在程序性死亡中起重要作用, 液泡
膜的崩解是植物细胞程序性死亡中的关键步骤(Jones,
2001 )。
通过广泛的研究, 人们发现在分子水平上, VPEs
(vacuolar processing enzymes)和saspases均显示
出类似caspases酶类的蛋白活性, 但是VPEs蛋白序
列除活性位点外, 其它部分与 cas pases 酶类差别巨
大; 而 saspases甚至在活性位点上也与caspases酶
类不同。
2 植物细胞程序性死亡中的类caspases
蛋白酶
序列分析表明, 在拟南芥基因组中, 没有编码caspases
酶类的基因, 说明植物细胞程序性死亡过程依靠的是具
有 caspases酶活性的其它种类的蛋白酶。最近的研究
表明, VPEs、metacaspases 和 saspases 在植物细
胞程序性死亡过程中起到类似 caspases酶类的关键性
调控作用。
VPEs和metacaspases都属于半胱氨酸蛋白内切
酶类(Rotari et al., 2005; Sanmartín et al., 2005), 在一
级、二级结构以及功能上与动物细胞中的 caspases类
似, 推测它们可能与 c as pas es 起源于共同的祖先。
Saspase是最初从燕麦(Avena sativa)中鉴定出来的另
一种类caspases酶, 它们表现出对caspases底物的降
解活性。与动物中的 caspases 相比, 它们在其活性中
心都含有 1 个丝氨酸残基(Co f feen and W o lpe rt ,
2004 )。
2.1 VPEs
早在 1987年人们就发现在成熟南瓜种子中存在一种负
责蛋白贮存泡中贮存的蛋白前体加工成熟的酶(Hara-
Nishim ura and Ni shimura, 1987)。随后, 从蓖麻
(Ricinus communis)中纯化出这种酶(Hara-Nishimura
et al., 1991), 并命名为液泡加工酶(vacuolar process-
ing enzyme, VPE)。VPE的分子特征表明, 它是一类
独特的半胱氨酸蛋白酶, 属于C13家族(Hara-Nishimura
et a l. , 1993 ), 负责液泡中蛋白的成熟和激活(Ha ra-
Nishimura et al., 1991, 1993)。
在细胞中, VPEs 以无活性的蛋白前体形式在细胞
质中合成, VPEs 蛋白前体由一个短的N末端、成熟蛋
白酶片段和一个长的 C末端组成。转移进入液泡后, 蛋
白前体在酸性环境下通过自我催化的方式转变为成熟形
式(Ferri and Kroemer, 2001; Kuroyanagi et al., 2002)。
在拟南芥(Arab idopsis thaliana)基因组中有 4个编码
VPEs 的基因(aVPE、bVPE、gVPE、dVPE ), 根据
其同源性和表达特性可以分为3个亚族(Yamada et al.,
618 植物学通报 25(5) 2008
2005)。通过RNA 凝胶印迹和组织化学分析显示aVPE
和gVPE在植株中表达, 属于植株型, 与植物衰老和抗逆
性有关。而 bVPE 在种子中表达, 属于种子型, 与植物
种子的成熟有关。dVPE在拟南芥种子形成的早期过程
中短暂特异地在形成种皮的 2层细胞中表达, 使这 2层
细胞发生程序性死亡, 形成种皮(Nakaune et al., 2005)。
dVP E 不属于以上 2 个亚族类型。
VPE 序列中含有可以插入细胞内膜系统的信号肽
(Kuroyanagi et al., 2002), 使其可以转运到内质网小体
(ER bodies, 也称 PPVs)或液泡中(Rojo et al., 2003)。
动物天冬酰胺内切酶(AEP)/legumain是植物VPE的同
源蛋白, 在动物细胞中负责组织蛋白酶 B、L和 H 3种
溶酶体水解酶的加工成熟(Sh iraham a-Noda et a l. ,
2003)。值得注意的是动物的溶酶体 / 晚期内涵体与植
物液泡在功能上是相似的, 而且在组织蛋白酶从受损的
溶酶体中释放出来时, 可以激活细胞质中 caspase的级
联活化, 导致细胞凋亡(Ferri and Kroemer, 2001)。
以杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达 gVP E 基因,
50 kDa无活性的 gVPE前体自我催化经一个 43 kDa的
中间体最终形成 40 kDa的成熟形式, 这个 C末端缺失
的中间体表现出和成熟gVPE相同的酶活性, C末端重组
体可以抑制 gVP E 活性, 表明 C 末端是一个自抑制片
段。将蓖麻 VPE 基因转入没有液泡蛋白水解酶活性的
酵母(pep4)中表达, 发生相似的激活机制(Kuroyanagi et
al., 2002)。对蓖麻 VPE 突变株的研究发现, 自催化反
应位点的半胱氨酸二聚体被甘氨酸替代后, 蛋白前体不
能加工为成熟形式(Hiraiwa et al., 1997)。C末端的水
解发生在一个双天冬氨酸位点, 这种切割方式在植物
VPE 中是相当保守的。而在突变株中, 半胱氨酸二聚
体的替代抑制了蓖麻VPE的自催化活性(Hiraiwa et al.,
1999 )。
作为植物的防御机制, 超敏反应(hypersens it ive
response, HR)是一个具有高度组织性的细胞程序性死
亡过程。近期的研究发现VP Es 在超敏细胞死亡中起
决定作用。VPEs在液泡介导的 TMV(tobacco mosaic
virus)感染的烟草(Nicotiana tobaccum)叶片细胞死亡中
表现出类 caspase-1活性; 而在 VPEs基因发生沉默的
烟草植株中, 受 TMV感染的叶片上没有可见的损伤, 并
且类 cas pase -1活性的减少量正比于 VP E 的减少量
(Hatsugai et al. , 2004)。VPEs 在超敏反应开始时迅
速出现, 而在可见损伤出现前表达减弱, 说明 VP E 是
HR早期过程中所必需的。同时, 在拟南芥 VPE无义突
变株中, V P E 和类 c a s p a s e - 1 都不表现活性
(Kuroyanagi et al., 2005)。
此外, 在衰老过程或逆境胁迫下的植物组织中, VPE
表达量也会上调, 而且具有组织特异性。将GUS 基因
与 VPEs启动子连接, 转入拟南芥或烟草植株, GUS活
性染色显示, 在不同组织中, 有不同类型的植株型VPE
基因表达(Kinoshita et al., 1999)。aVPE 在新生侧根
中、紧贴死亡外层细胞的内层细胞中表达, 而 gVPE 在
花粉发育的末期花粉囊中层衰老的细胞中表达。无论
aVPE 还是 gVPE 启动子都只在老化的组织中起作用,
在新生的且未受损伤的组织中不能启动下游基因表达。
而在干燥的种子中, 只有 bVPE 的表达。
VPEs和caspases的大部分蛋白序列差别很大, 在
结构上不相关, 但是在形成 caspase-1天冬氨酸水解活
性位点的关键氨基酸上 , 二者十分相似 , 表现出类
caspase-1活性, 而且在各种植物的 VPEs 间十分保守
(Hatsugai et al. , 2006)。
2.2 M etacaspase
序列同源分析表明在植物中存在包含caspases 的保守
片段metacaspases。分子水平的系统进化分析表明,
植物、真菌和原生动物的 metacaspases 在进化上起
源于 cas pases。
拟南芥中的metac aspases 分为 2种类型。I型
metacaspases包括一个C端类 caspase蛋白水解酶结
构域(该结构域含有保守的组氨酸和半胱氨酸残基)以及
一个富含脯氨酸和谷氨酰胺的 N端, 这个脯氨酸结构域
中包含一个锌指结构, 该结构与植物超敏反应的负调控
因子LSD-1类似, 在真菌和原生动物中可以找到同源序
列。II型metacaspases 只存在于植物中, 没有脯氨酸
结构域, 但在其类似 caspases的 p20和 p10亚基之间
含有一段大约 180 bp的保守插入序列(Uren e t al . ,
619陈宇亮等: 植物细胞程序性死亡中的类 caspases蛋白酶
2000)。其中各种不同的metacaspases 在氨基酸序列
上具有从 56% 到 71% 不等的高度同源性(Watanabe
and Lam, 2005)。与 caspases进行序列比对, 不能找
出metacaspases 序列中直接水解天冬氨酸的位点, 因
此很难推测其激活下游靶蛋白的机制与 caspases是否
一致(Watanabe and Lam, 2004)。
最新研究发现, metacaspase-9在细胞内是经信号
分子 NO在其活性半胱氨酸位点, 通过巯基亚硝基化的
方式激活, 进而水解下游底物(Belenghi et al., 2007)。
而且, 它还具有抑制丝氨酸蛋白酶抑制剂1(serpin1)活性
的作用(Vercammen et al., 2006), 这一特点十分类似
于动物中的 caspases 酶。
I型metacaspases的N端含有导肽序列, 推测其可
能定位在线粒体或叶绿体内。II型metacaspases不含
信号肽或跨膜结构域 , 推测可能定位于胞质溶胶中
(Sanmartín et al. , 2005)。
对病原体感染的拟南芥叶片进行Northern分析, 结
果显示metacaspases (AtMCP1a-1c、AtMCP2b、
AtMCP2d)的表达迅速上调(Watanabe and Lam, 2005),
证明metacaspases 与超敏细胞死亡过程的激活有关。
在挪威云杉(Picea abies)的与胚胎发育相关的细胞
程序性死亡过程中发现一种 II 型metac as pas e基因
(mcII-Pa)编码类VEIDase酶(Bozhkov et al., 2005), 而
VEID是 caspases 的底物之一。VEIDase酶是挪威云
杉胚胎发育过程中必需的(B ozhkov et al. , 2004 )。
McII-Pa基因的沉默抑制了VEIDase的活性和胚胎发育
中必要的细胞程序性死亡, 进而阻碍了胚柄分化(Suarez
et al., 2004)。这一结果证明metacaspase在植物胚
胎发育相关的细胞程序性死亡中起关键作用。
值得注意的是, 番茄在受一种番茄灰霉病菌(Botrytis
c i ne rea )诱导的细胞死亡中, L eM CA 1(一种 I I 型
metacaspase)的转录水平迅速提高, 而悬浮培养的细胞
在喜树碱(camptothecin)或fumonisin B1诱导的死亡过
程中, LeMCA1转录水平却保持不变(Hoeberichts et al.,
2003), 表明不是所有的细胞死亡过程都伴随着同一种酶
的转录增强, 可能是不同的metacaspase在不同条件下
诱导细胞的程序性死亡。
对metacaspase的上游蛋白的研究发现, 在受紫外
线或过氧化氢诱导的拟南芥细胞程序性死亡中, RCD1
基因起关键的调控作用。在 r c d 1 突变株中 ,
metacaspase-8不能被激活(He et al. , 2007)。
也有报道指出 , 在 E . c o l i 中重组表达的 I I 型
metacaspases, 其催化水解的不是P1天冬氨酸残基,
而是 P1 精氨酸 / 赖氨酸位点(Ve rcam men e t a l. ,
2004)。因此metacaspases 是一类精氨酸 / 赖氨酸特
异的半胱氨酸蛋白酶(Ve rc am m en e t al . , 2004 ;
Watanabe and Lam, 2005), 其作用最适位点并非
caspases特异的底物, 推测metacaspase在植物细胞
程序性死亡中的作用可能只是直接或间接地激活某些类
caspase蛋白酶。
尽管metacaspases和 caspases在结构和底物特
异性方面有所不同, 但多数证据表明metacaspases具
有 caspases 活性, 与植物细胞程序性死亡密切相关,
metacaspases的超表达或低表达都会影响植物胚胎发
育和超敏反应。
2.3 Saspase
Saspases 是一种具有 caspases 酶活性, 并以丝氨酸
(而不是半胱氨酸)为反应位点的类 caspases 酶类。目
前对其的研究较少, 仅局限于有限的几个物种, 最早是
在对燕麦的枯萎病研究中发现的。燕麦的枯萎病是由
维多利亚旋孢腔菌(Cochliobolus vic toriae)产生毒素
victorin, 然后诱导敏感株发生细胞程序性死亡, 在这个
过程中发生 Rubisco大亚基的降解。研究者在这一信
号通路中纯化出 2种具有 caspases酶活性的丝氨酸蛋
白酶—— s as pase -1 和 s as pas e-2(Cof feen and
Wolpert, 2004)。这 2种丝氨酸蛋白酶在氨基酸序列上
与植物类枯草杆菌蛋白酶具有同源性。这2种酶在最适
反应条件、活性、分子量和 MA LDI-TO F 质谱图等方
面有高度相似性, 推测可能来自于相同基因翻译产物的
不同修饰。这 2种酶的活性可被 caspases酶特异性抑
制剂 Ac-VAD-CMK所抑制, 并可以水解多种 caspases
酶的特异性底物。研究发现在正常的燕麦细胞提取物
中可以检测出100% saspases酶活性, 而在 victorin诱
620 植物学通报 25(5) 2008
导完整细胞的过程中, saspases被释放到细胞外液, 启
动细胞程序性死亡。据推测在正常细胞中 saspases可
能存在于内质网或高尔基体内, 或者与细胞膜或膜外基
质结合, 进而抑制了其水解活性, 而saspases的释放则
激活了细胞程序性死亡过程。
P69是一种受病原体诱导产生的丝氨酸蛋白酶, 在
番茄受细菌感染诱导的细胞程序性死亡中, 可以水解一
种胞外蛋白 LRP(Leu-rich repeat containing protein)
(Tornero et al., 1996)。LRPs 在很多实验中被证明是
一种与植物疾病抗性相关的信号分子, 推测燕麦
saspase可能是通过水解LRPs激活植物细胞程序性死
亡的信号通路。
3 展望
植物细胞程序性死亡与动物细胞凋亡一样, 在发育或病
理过程中起着重要的作用, 是植物生长发育的必需组成
部分。但是目前对于植物细胞程序性死亡的关键酶类
尚无定论, 对几种类 caspase酶类的研究也各有不明之
处。尽管最新的研究显示, VPEs 控制着植物液泡的各
种功能, 如液泡相关的超敏细胞死亡和衰老及植物细胞
的伤害反应, 可能是植物细胞程序性死亡的关键调控酶
类, 但是 VPEs 作用的下游靶蛋白还不清楚, 仅有推测
植株型VPEs的靶蛋白可能包括液泡中的衰老和伤害诱
导产生的蛋白。同时, 有关 VPEs 在序列上与 caspa-
ses完全不同, 而在活性位点上却十分相似的原因也不
清楚。Metacaspases虽然在序列上与 caspases有相
似性, 是真菌类细胞程序性死亡的调控酶类, 但现有研究
表明, 植物中的metacaspases 所具有的是精氨酸 / 赖
氨酸特异的蛋白水解活性。因此目前还不清楚植物
metacaspases是否控制细胞死亡的激活, 是否在功能
上与典型的 caspases 酶类等价。此外, saspase作为
燕麦细胞程序性死亡的关键酶类, 如何发挥作用, 是否在
植物体中具有普遍性以及其与半胱氨酸蛋白酶类有何关
系等问题也不清楚。
最近 Bosch等人发现在罂粟科植物虞美人(Papa-
ver rhoeas)的花粉自交不亲和诱导的细胞程序性死亡中,
有类 caspase-3/DEVDase的表达, 这是在调控细胞程
序性死亡中最为关键的酶。同时自交不亲和也激活了
VEIDase 和 LEVDase的活性(Bosch and Frank lin-
Tong, 2007)。另外, 在热激引起的烟草悬浮细胞程序
性死亡过程中, 也发现有类caspase-3的表达(Vacca et
al., 2006)。有学者建议将植物体内类 caspases 酶类
根据其底物特异性分为 Y V A Da s e、D E V D a s e、
VEIDase、TATDase和 Saspase几种类型(Woltering,
2004), 这种分类方法目前已得到广泛采用(Boren et al.,
2006; Bosch and Franklin-Tong, 2007)。根据这种分
类方法, VPE 属于 YVADase类, metacaspase属于
VEIDase类, 并由此可以认为植物细胞程序性死亡过程
可能是几种酶共同作用的结果。
另外, 对于生长发育或外部刺激信号如何进入植物
细胞程序性死亡级联过程并调控激活类caspases, 以及
如何有序地促进细胞死亡的具体过程还不清楚。尽管
植物类 caspases在功能和进化上与动物 caspases相
似, 但是动、植物中的 caspases 不仅调控功能不同,
而且在亚细胞结构中的定位也不相同。因此, 类
caspases 酶类在植物中的真正功能还是一个悬而未决
的问题。总的来说, 有关植物细胞死亡蛋白酶的研究尚
处于起始阶段。
但是随着细胞 PCD检测手段以及动植物基因组测
序研究的进展, 以及将动物细胞凋亡研究中的部分成果
和方法应用于植物 P CD 研究, 人们有望深刻揭示动、
植物细胞凋亡调控机制的差异以及植物细胞死亡蛋白酶
控制植物在自身及外界的死亡诱导信号刺激下, 调控细
胞程序性死亡的特殊途径。
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623陈宇亮等: 植物细胞程序性死亡中的类 caspases蛋白酶
(责任编辑: 刘慧君)
Key Caspase-like Enzymes in Programmed Cell Death in Plants
Yuliang Chen1, Feixiong Zhang1, Guiyou Zhang2*
1Co lle ge of L ife Scien ces, Capital Normal Un iversit y, Bei jin g 1 0003 7, Chi na
2De partme nt of Bio log ica l Scie nce s a nd Bio technol ogy, Tsin ghu a University, Beij ing 10 008 4, Chi na
Abs tract Caspases are essential to programmed cell death (PCD) in animals. Vacuolar processing enzymes (VPEs) , metacaspases
and saspases w ith caspase-like protease activity play an important role in plant PCD. This paper summarizes the differences in PCD
betw een animals and plants and discusses the poss ible f unc tion of caspase-like enzymes in plants.
Ke y w ords me tacasp ases, p rog ram med ce ll d eath, saspases, vacuol ar pro cessing en zym es
Chen YL, Zha ng FX, Zha ng GY (200 8). Key ca spa se-like en zym es in pro gra mmed ce ll dea th in p lan ts. Ch in Bull Bo t 25 , 61 6-62 3.
* Author for correspondence. E-mail: zhang-gy@mail.tsinghua.edu.cn
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本书是一本系统、全面地介绍我国芳香植物资源及其利用现状的书籍。内容分总论和各论两大部分。总论部分除介
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芳香植物资源进行调查的基础上, 分科分属对我国所有的上千种芳香植物一一进行了介绍。内容包括种名、别名、拉丁学
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