全 文 ：麦类作物学报　2010 , 30(3):504-508
Journa l of T riticeae Crops
小黑麦籽粒灌浆过程中胚乳细胞程序性死亡
＊
李春艳1 , 2 ,陆振翔2 ,李诚1 ,李卫华1 ,曹连莆1
(1.石河子大学农学院 ,新疆石河子 832003;2.加拿大农业和农业食品部 Lethbridge 研究中心 , 加拿大艾伯特省 Lethbridge , T1J 4B1)
摘　要:为了解小黑麦胚乳细胞程序性死亡(PCD)的过程 , 观察了小黑麦籽粒灌浆过程中胚乳 PCD、淀粉积累
和相关内源激素乙烯和脱落酸的变化 , 并对 PCD抑制因子之一 Defender Against cell Dea th-1(DAD-1)进行了氨基
酸序列分析。结果发现 ,小黑麦胚乳发育过程伴随着 PCD过程 , 籽粒淀粉积累速率 、单个籽粒中 ABA 含量在整个
籽粒灌浆过程中呈单峰曲线变化 ,乙烯的释放速率从花后 15 d 持续下降;动植物 DAD-1 之间同源性较高。小黑麦
籽粒中淀粉的快速积累时期和胚乳 PCD 的快速发生时期相重合 , 胚乳 PCD可能影响了胚乳中贮藏淀粉的合成和
积累。
关键词:小黑麦;胚乳;灌浆过程;细胞程序性死亡
中图分类号:S512.4;S311　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1009-1041(2010)03-0504-05
Programmed Cell Death in Triticale Endosperm during Grain Filling
LI Chun-yan1 , 2 , LU Zhen-xiang2 , LI Cheng1 , LI Wei-hua1 , CAO Lian-pu1
(1.Col lege of Ag riculture , Shihezi University , Shihezi , Xinjiang 832003 , China;2.Lethb ridge Research Cent re , Agricu lture
and Agri-Food Canada , Lethb ridge , Alberta T1J 4B1 , C anada)
Abstract:In o rder to investig ate the prog ression of endo sperm prog rammed cell death (PCD)in t riticale ,
we observed the endosperm PCD , starch accumulat ion , the changes of ABA content and ethy lene produc-
tion rate.A ddi tionally , we compared the predicted amino acid sequences of animal and plant Defender A-
gainst cell Death-1(DAD-1), analysed the phy logene tic relat ionships of DAD-1.The resul ts indicated that
the development of t ri ticale endo sperm w as companied by the prog ression of PCD.The pattern o f starch
accumulation rate and ABA content based on single kernel show ed similar unimodal curves during trit icale
grain fi lling.The ethy lene production rate decreased af ter 15 DPA.The predicted amino acid sequences of
DAD-1 of par tial plant and animal w ere homologous.The period between init ial detection of PCD to i ts
rapid increase overlaps wi th the stages o f rapid starch accumulat ion during endo sperm development.The
timing and prog ression of PCD in triticale endo sperm may interfere w ith starch synthesis and accumula-
tion.
Key words:Trit icale;Endospe rm ;Grain fi lling;Prog rammed cell death
　　在禾谷类作物成熟籽粒中 ,胚乳是淀粉和贮藏
蛋白合成和积累的主要场所。胚乳发育的过程伴随
着胚乳细胞程序性死亡(Programmed cell death ,
PCD)[ 1] 。一般认为 ,当植物的细胞膜失去其完整性
时就已经死亡[ 2] 。PCD 在植物的生长发育 、形态建
成等方面有重要作用 ,在植物生长周期的各个阶段
均有发生 ,涉及性别决定 、绒毡层和胚柄细胞的退
化 、木质部分化 、根的发育与通气组织的形成等过
程[ 3-6] 。PCD过程受到基因有序活动的控制 ,涉及
众多因素 ,包括信号传导 、蛋白 、激素 、过氧化物 、无
机离子等化学成分[ 5] 。其中 ,乙烯(Ethy lene ,ETH)
和脱落酸(ABA)是胚乳细胞凋亡的关键调控因
子[ 7] 。植物细胞 PCD 的一些基因与动物细胞凋亡
基因具有同源性。d ad-l 是最保守的 PCD抑制基因
＊收稿日期:2010-01-14　　　修回日期:2010-03-13
基金项目:加拿大农业部小黑麦工业化应用研究专项基金项目(AAFC;AARI)。
作者简介:李春艳(1982-), 女 ,博士研究生 ,主要从事麦类作物遗传育种研究。 E-mail:lichunyan82@yah oo.cn
通讯作者:曹连莆(1939-),男,教授 ,博士生导师 ,主要从事麦类作物遗传育种研究。
李卫华(1969-),女,博士 ,副教授 ,主要从事麦类作物遗传育种研究。 E-m ail:liw eihua1199@tom.com
之一[ 8] 。国外对玉米 、小麦等的胚乳细胞 PCD已有
报道[ 1 , 9] 。Evans Blue染色显示玉米胚乳 PCD从胚
乳中上部开始向边缘扩散 ,花后 16 d(生长在大田
里)细胞开始死亡 ,到花后 40 d时 ,几乎所有胚乳细
胞都已经死亡;小麦胚乳 PCD 的发生部位是随机
的 ,花后 16 d(生长在温室 , 22℃)开始就能检测到 。
韦存虚等认为水稻胚乳发育也伴随着 PCD 的过
程[ 10] 。如果能探明诱导胚乳发育过程中 PCD 发生
的机理 ,通过人为因素延长籽粒灌浆期 ,可以提高谷
类作物籽粒产量和质量[ 1] 。目前 ,虽然在胚乳 PCD
研究方面积累了一些资料 ,但报道的植物种类不多 ,
其机理尚不清楚 。小黑麦作为一种新型的具有优良
产量潜力和适应性的作物 ,在欧美地区已被提出作
为淀粉工业化利用的平台之一[ 11] ,但目前有关小黑
麦的研究十分有限。本研究观察了小黑麦胚乳发育
过程中淀粉积累 、胚乳 PCD 及相关内源激素的变
化 ,旨在为小黑麦产量和品质的遗传改良提供理论
基础 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
两个小黑麦(X Trit icosecale Wittmack)品种
AC U ltima和 Blue Alta 种植于加拿大农业部 Le-
thbridge 研究中心(LRC-AAFC)温室 ,生长条件为
20℃、18 h光照(250 μmol·m-2 · s-1)和16℃、6 h
黑暗 。
1.2　淀粉含量测定
开花期选择同一日开花的穗挂牌标记。于开花
后 6 d每隔 3 d取一次样 ,剥取籽粒 ,于 70℃烘箱烘
至恒重 ,磨粉 ,用于淀粉含量的测定 。测定方法参照
试 剂 盒 说 明 (Starch A ssay Ki t , K-TS TA ,
Megazyme , Wicklow , Ireland)。
1.3　Evans Blue染色法检测细胞死亡
Evans Blue染液可将失去细胞膜完整性的死细
胞染成蓝色 ,而活细胞不着色[ 9] 。从开花后第 6 d
开始取样 ,每隔 3 d取样 1次 ,以锋利的单面刀片分
别沿籽粒纵方向切成两半 ,得纵剖面样品;沿横向切
成数段 ,得横断面样品。染色参照 Young 等[ 7] 的方
法。将样品置于 0.1%的 Evans Blue的水溶液中浸
染 2 min
1.4　胚乳细胞基因组 DNA片段化检测
取不同开花天数的小黑麦穗中上部 ,生长一致
的籽粒 ,手工剥除种皮和胚 ,按试剂盒(Q IAGEN ,
No.69104 , Canada)说明提取籽粒胚乳基因组
DNA 。紫外可见分光光度计检测基因组 DNA 的质
量和浓度。每个 DNA 样品上样量为 15 μg ,1.8%
琼脂糖凝胶电泳(1 X TA E),凝胶经 EB(e thidium
bromide)染色观察 ,用扫描仪 Typhoon 9400(GE
Healthcare)扫描图像。
1.5　激素含量测定
取不同开花天数的小黑麦穗中上部生长一致的
20 ～ 30个籽粒 ,将鲜样液氮速冻 ,置于-20℃冰箱
中保存待测 ,参考 Bollmark[ 12]和 He 等[ 13] 的方法用
间接酶联免疫法测定籽粒中脱落酸(ABA)含量 ,乙
烯含量测定参考 Young等[ 7] 的方法 ,三次重复 。
1.6　数据统计及分析
数据统计应用 Excel 2003。通过 C lustal W 得
到多序列比对结果 ,Mega 4.0构建系统进化树 。
2　结果与分析
2.1　小黑麦籽粒发育过程中淀粉积累动态
两个小黑麦材料(AC Ult ima 和 Blue A lta)的
总淀粉积累速率在整个灌浆期均呈单峰曲线变化 ,
花后 6 d开始迅速增长 ,峰值出现在花后 15 ～ 18 d ,
此后开始逐渐下降(图 1)。AC Ultima 的淀粉积累
速率峰值的出现要早于 Blue Al ta ,而 Blue A lta 的
平均积累速率要高于 AC Ult ima 14.9%。
图 1　小黑麦 AC Ultima 和 Blue Alta籽粒灌浆过程中
总淀粉积累速率的变化
Fig.1　Accumulation rate of total starch in ACUltima
and Blue Alta during grain filling
2.2　小黑麦籽粒发育过程中胚乳 PCD 及基因组
DNA片断化检测
Evans Blue 染色法结果发现 ,开花后 6 d ,珠心 、
种毛周围和种皮细胞基本被染成蓝色 ,少数胚乳细
胞被染成蓝色(图 2 A1 、A2)。随着胚乳的发育 ,种
皮开始逐渐变薄 ,花后 9 d ,被染色细胞逐渐增多(图
2 B1 、B2)。从花后 12 d籽粒的横切和纵切面可以
看出 ,大部分胚乳被染成蓝色(图 2 C1 、C2)。花后
18 d ,整个胚乳基本被染成蓝色 , 胚开始迅速发育
·505·第 3 期　　　　　　　　　　　　　李春艳等:小黑麦籽粒灌浆过程中胚乳细胞程序性死亡
(图 2 D1 、D2),淀粉积累速率开始下降(图 1),且即
将进入平台期 ,此后 ,到花后 30 d ,整个胚乳被染成
蓝色且颜色逐渐加深 ,胚基本不着色(图 2 E1 、E2)。
这表明整个胚乳的细胞已经基本死亡。
DPA:花后天数　　DPA:Days af ter anthesi s
图 2　小黑麦 AC Ultima开花后不同时期胚乳细胞
死亡的 Evans Blue染色检测结果(死亡细胞被
染成蓝色 , 活细胞不着色)
Fig.2　Endosperm PCD during seed development of triticale-
AC Ultima by staining with Evans Blue(Cell death is
indicated by those cells staining blue)
从不同发育时期的小黑麦胚乳提取基因组
DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳检测(图 3)。结果发
现 ,从花后 9 d 就出现了 DNA 拖尾现象 ,这和 Ev-
ans Blue检测到部分死亡细胞的结果一致 。此后 ,
分子量大于 3 kbp 的 DNA 的强度逐渐减弱 ,从花
后 21 d开始观察到明显的 DNA 片断化 ,这是 PCD
的典型特征之一 。这些结果表明胚乳 PCD 是一个
不可逆的过程。
DPA:花后天数 Day s af ter an th esi s
图 3　小黑麦 AC Ultima籽粒灌浆过程中胚乳基因组 DNA
片断化凝胶检测
Fig.3　Agarose gel separation illustrating genomic DNA-frag-
mentation isolated from endosperm during development
of ACUltima triticale
DPA:花后天数 Day s af ter an th esi s
图 4　小黑麦 AC Ultima籽粒灌浆过程中乙烯含量的变化
Fig.4　Changes of ethylene production rate in grains during
development of AC Ultima triticale
2.3　小黑麦籽粒发育过程中乙烯和脱落酸含量的
变化
小黑麦籽粒 PCD 发生过程中乙烯和脱落酸含
量的检测结果表明 ,开花后 12 ～ 15 d ,单个籽粒中乙
烯释放速率保持较高水平 ,此后逐渐下降 ,到花后
27 ～ 30 d ,乙烯释放速率下降到最低水平并维持稳
定(图 4)。而 ABA 含量在整个籽粒灌浆过程中呈
单峰曲线变化 ,花后6 d开始快速增长 ,花后 21 d达
到峰值 ,此后开始迅速下降(图 5)。
·506· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 30 卷
图 5　小黑麦 AC Ultima籽粒灌浆过程中
ABA含量的变化
Fig.5　Changes of ABA content in grains during
development of AC Ultima triticale
2.4　部分动物和植物 DAD-1的氨基酸序列同源性
比较及进化关系
本研究利用现有数据库 ,对部分动植物 DAD-1
进行了氨基酸序列比较和系统进化关系分析。结果
发现动植物 DAD-1之间同源性较高 ,序列之间相似
性均在 44%以上 ,水稻和玉米 、拟南芥之间更是高
达 97%和 81%(图 6)。通过软件 Mega 4.0 构建的
系统进化树(图 7)可以看出 ,植物和动物 DAD-1之
间亲缘关系较近 ,植物中又大体可分为单子叶和双
子叶两组。
GenBank登陆号:水稻(rice):BAA24104;玉米(m aize):AAC24568;拟南芥(Arabidopsis thal iana)CAC80055;人(human):CAG47001;
鼠(m ouse):CAX15983;非洲爪蛙(x enopus):AAI35131。用 CLUSTALW 得到的多序列比对结果中 , “ ＊”号表示保守性极高的残基位点;
“.:” :号代表保守性略低的残基位点。
图 6　植物和动物 DAD-1 的氨基酸序列同源性比较。
Fig.6　Comparison of the predicted amino acid sequences of animal and plant DAD-1 using the CLUSTALW program
GenBank登陆号:水稻(rice):BAA24104;玉米(m aize):
AAC24568;拟南芥(Arabidop sis thal iana):CAC80055;人(hu-
m an):CAG47001;鼠(m ou se):CAX15983;非洲爪蛙(xenopus):
AAI35131。
图 7　植物和动物 DAD-1 的氨基酸序进化关系
Fig.7　Phylogenetic trees based on amino acid sequences of
DAD-1 proteins from animals and plants
3　讨 论
本研究发现小黑麦胚乳发育过程伴随着胚乳细
胞程序性死亡的过程 ,开花后 15 d以前是淀粉的快
速积累时期 ,同时死亡的胚乳细胞数目也快速增长;
开花 18 d以后 ,淀粉的积累速率快速下降 ,整个胚
乳基本被染成蓝色 ,胚开始快速发育 ,种子中的营养
积累开始转向胚;开花 21 d以后 ,核酸酶活性升高 ,
基因组 DNA 降解加剧 ,胚乳中 DNA 和 RNA 的含
量下降[ 1 , 9] ,而此时 ,仍可检测到淀粉的积累及淀粉
合成关键酶的基因表达 ,甚至在花后 24和 27 d可
以检测到两个直径范围在 0 ～ 5 μm 的淀粉粒合成
的高峰(数据未显示)。那么 ,胚乳细胞是如何调节
其一边死亡一边继续执行积累淀粉的任务呢? 目前
·507·第 3 期　　　　　　　　　　　　　李春艳等:小黑麦籽粒灌浆过程中胚乳细胞程序性死亡
关于此问题尚无定论 ,有研究假设认为部分 mRNA
可以选择性表达 ,以保持细胞质中的代谢活动[ 14] 。
小黑麦胚乳中 PCD的发生部位是随机的 ,这和
小麦籽粒的观察结果一致[ 1] ,而玉米胚乳中 PCD则
是从中上部开始[ 9] ,说明物种间差异较大 。小黑麦
胚乳细胞是由胚乳外侧的分生组织分化而来 ,因此 ,
胚乳中心部位的细胞较外侧细胞老[ 15] ,因此胚乳细
胞的 PCD并不是由细胞年龄决定的 。
脱落酸和乙烯是植物 PCD的关键因子[ 9] ,对植
物衰老有明显的促进作用 。研究表明 ,脱落酸可抑
制核酸和蛋白质的合成 ,加速叶片中蛋白质和 RNA
的降解。乙烯不仅能促进果实呼吸跃变 ,提早果实
成熟 ,还可以促进叶片衰老[ 16] 。本研究中 ,和淀粉
积累速率相似 ,单个籽粒中 ABA 含量在整个籽粒
灌浆过程中呈单峰曲线分布 ,而乙烯的释放速率则
从花后 15 d持续下降。小黑麦籽粒灌浆的早中期
是淀粉积累的快增期 ,乙烯和脱落酸的较高含量可
能会对淀粉持续积累产生一定影响 。
小黑麦籽粒灌浆过程中 ,淀粉的快速积累时期
和胚乳 PCD 的快速发生时期相重合 , 所以 ,胚乳
PCD可能影响了胚乳中贮藏淀粉和蛋白的合成和
积累 。有研究通过对灌浆期玉米进行乙烯生物合成
抑制剂 AVG 等的处理 ,推迟了玉米胚乳 PCD[ 9] 。
还有研究通过反义技术抑制乙烯的生成 ,使番茄果
实成熟和软化明显受阻[ 16] 。本研究认为 ,开花后 15
d以前应该是生化处理小黑麦 ,推迟胚乳 PCD ,延长
籽粒灌浆期的较好时期。dad-1 基因作为 PCD 抑
制因子之一 ,其作用机理以及和其他因子的相互作
用需进一步探讨 。我们可以借鉴动物细胞凋亡的相
关研究经验 ,通过人为调控植物 PCD ,提高农作物
的产量 、质量和抗逆性。
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·508· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 30 卷