全 文 ：植物学通报 2006, 23 (1): 29~36
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2005-06-02; 接受日期: 2005-09-26
基金项目: 国家自然科学基金项目 (30440041) 和国家高科技发展计划项目 (2002AA213021)
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: wxx0813@163.net
.研究论文.
盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆及其蛋白质结构预测
李钢1,2 邓运涛2 任刚3 杨滔2 王小行1*
(1 四川大学生命科学学院 成都 610064) (2 四川川大光耀生物工程有限公司 成都 610031)
(3 四川师范大学生命科学学院 成都 610066)
摘要 本文通过对盐生杜氏藻(Dunaliella salina) cDNA文库进行大规模EST测序并结合RACE实验克隆
了盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因, 并且通过Southern blotting实验确定了该基因在这个物种中拷贝数。
通过生物信息学的方法, 预测该基因所编码的蛋白质结构, 验证了该蛋白质具有3-磷酸甘油脱氢酶完整
的功能性结构域和磷酸水解酶类结构域。本实验为解释盐生杜氏藻在面临高渗胁迫下快速合成甘油的机
制提供了帮助。
关键词 3-磷酸甘油脱氢酶, 磷酸水解酶, 结构域, 盐生杜氏藻
Cloning of Glycerol-3-phophate Dehydrogenase Gene in
Dunaliella salina and Prediction of its Protein Structure
Gang Li1,2, Yuntao Deng2, Gang Ren3, Tao Yang2, Xiaoxing Wang1*
(1 College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064)
(2 Sichuan Chuanda Guangyao Bioengineering, Ltd, Chengdu 610031)
(3 College of Life Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610066)
Abstract This paper describes the first cloning of the glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene
(DSGPDH) of Dunaliella salina involving large-scale sequencing of a cDNA library and RACE.
Southern blotting was carried out to identify the copy of this gene in this organism. The 3-D structure
of this protein was predicted. The protein had a whole functional domain of GPDH and another
phosphatase-like domain. This experiment may be helpful for the explanation of the rapid glycerol
synthesis in D. salina under hyperosmolarity stress.
Key words glycerol-3-phosphate dehydrogenase, phosphatase, domain, Dunaliella salina
盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是目前世界
上最耐盐的真核光合生物, 主要生活在盐湖、
盐田以及海洋中, 阐明该藻的耐盐机理是目前盐
胁迫功能基因组学迫切需要解决的问题。研
究表明, 该生物在高盐胁迫环境中可以将细胞叶
绿体中储藏的淀粉迅速转化成大量甘油(Ben-
Amotz and Avron, 1973), 这个过程不仅涉及物
质由叶绿体向胞质中运输过程, 而且还涉及甘油
合成途径的激活。甘油代谢的基本过程是淀
粉经过水解成葡萄糖, 经1,6-二磷酸果糖, 转化
为磷酸二羟基丙酮, 接着生成 3 - 磷酸甘油
(glycerol-3-phosphate), 最后在磷酸化酶的作用
下脱去磷酸生成甘油, 其中磷酸果糖激酶和3-
磷酸甘油脱氢酶( g l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t e
30 23(1)
dehydrogenase, GPDH)是这个代谢途径中的关
键酶(Goyal et al., 1987; Bental et al., 1990), 尤其
是3-磷酸甘油脱氢酶在生成甘油中起到了关键
酶的作用。
盐生杜氏藻在高渗条件下要合成甘油调节
胞内膨压(turgor pressure), 而 3-磷酸甘油脱氢
酶是甘油合成途径中的关键酶, 因此研究这个基
因对盐生杜氏藻耐渗的机理具有重要意义。
早在20世纪80年代就有人分离并纯化了这个
酶(Gee et al., 1993), 但是后续研究发现在盐生杜
氏藻中 3 - 磷酸甘油脱氢酶存在多种形式
(Ghoshal et al., 2001, 2002), 一种是位于线粒体
并参与磷酸甘油穿梭途径的, 还有3种以NADH
为辅酶的GPDH同工酶, 位于叶绿体的有2种,
分别是调渗型GPDH以及甘油酯型GPDH; 另外
一种是位于细胞质型GPDH也可能参与细胞甘
油代谢, 其中渗透调节型(osmoregulatory type)
的活性受到渗透压的调节, 因此在该物种适应渗
透压变化过程中起着重要作用。虽然对调渗
型GPDH以及与之相关的渗透压调控反应途径
的研究取得了很大的进展, 但是至今没有人成功
克隆到这个酶的基因。本文成功地克隆了这
个基因, 同时对这个基因做出了相应分析。为
盐生杜氏藻盐胁迫下的功能基因组学研究打下
了坚实的基础。
1 材料
1.1 材料与试剂
1.1.1 藻种 盐生杜氏藻(Dunaliella salina),
购于中国科学院武汉水生生物研究所。
1.1.2 菌种 大肠杆菌DH5α, 由本实验室保
存。电转化感受态大肠杆菌 JM109, 购自宝
(TaKaRa)生物工程有限公司。
1.1.3 酶制剂 HindⅢ, SacⅠ, XhoⅠ, EcoR
Ⅰ, BamHⅠ, KpnⅠ, SmaⅠ, SfiⅠ限制内切酶,
购自宝生物工程有限公司。
1.1.4 试剂盒 Creator™ SMART™ cDNA
Library Construction Kit、SMART™ RACE试
剂盒及Advantage 2 PCR Kit购自CLONTECH
公司。RNeasy Mini Kit植物总RNA提取试剂
盒购自QIAGEN公司。DIG High Prime Label-
ing and Detection Starter KitⅠ杂交及检测试剂
盒购自Roche试剂公司。ExTaq™ PCR Kit和
TA克隆试剂盒购自宝生物工程有限公司。小
量胶回收试剂盒, 购自华舜生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 杜氏藻的培养 将原种按5%的接种量
接入Ds培养基中, 按光照16小时, 黑暗8小时,
25℃培养。
1.2.2 盐生杜氏藻 SMART™ 质粒 cDNA文
库构建 利用RNeasy Mini Kit植物总RNA提
取试剂盒提取藻总RNA, 通过SMART™ 技术
构建盐生杜氏藻的全长 cDNA文库(李钢等,
2004)。
1.2.3 RACE扩增 3-磷酸甘油脱氢酶基因全
长 cDNA序列 通过随机挑取克隆对文库的
大规模测序, 并对序列进行相似性搜索, 寻找3-
磷酸甘油脱氢酶基因的 EST, 克隆子命名为
pGPDH-3并测序。
使用Primer Premier 5.0软件设计5RACE 的
GSP引物, 按SMART™ RACE cDNA Amplifica-
tion Kit操作说明书对3-磷酸甘油脱氢酶基因
cDNA 5端未知序列进行扩增。回收RACE样
品电泳中所有条带, 通过TA克隆将片段克隆到
pMD18-T Vector载体中, PCR检测重组子, 命名
为 pGPDH-5x并交寄测序。
使用Vector NTI 8.0软件对3-磷酸甘油脱
氢酶基因EST, cDNA 3端序列和 5端序列的测
序结果进行拼接, 同时对拼接结果中比对不一致
的位点加以更正。通过RT-PCR反应验证拼接
的全长 ORF。
1.2.4 盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶基因
Southern鉴定 参照盐生杜氏藻基因组DNA
提取方法(李钢等, 2002), 最终每管获得 40 mL
DNA。用 Eco R Ⅰ、Bam H Ⅰ、Hin d Ⅲ、
KpnⅠ和 SmaⅠ 5种酶对藻总DNA进行单酶
312006 李钢 等: 盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆及其蛋白质结构预测
切, 每种酶分别与20 mg藻总DNA反应。酶切
过程按照《分子克隆实验指南》中基因组
DNA Southern杂交分析实验过程进行。在 4
℃将酶切的藻总DNA于0.8%琼脂糖凝胶中按
<1 V.cm-1的电场强度电泳。电泳完毕后, 采取
DNA在中性条件下从凝胶转移至尼龙膜的方
法, 以10×SSC转移DNA 16小时。将膜于室
温干燥, 以总照射剂量为0.5 J.cm-2在紫外交联
仪中固定 DNA。
使用 PCR法合成 3-磷酸甘油脱氢酶基因
EST探针, 胶回收纯化片段, 使用地高辛对其进
行标记, 并按照试剂盒说明书对标记探针进行纯
化和检测, 得到标记探针的浓度。然后按照杂
交及检测试剂盒说明书中的步骤进行预杂交以
及杂交, 使用含50%甲酰胺以及25 ng.mL-1探
针浓度的标准杂交液于 45℃下杂交 16小时。
显色过程按照试剂盒说明书完成。
1.2.5 生物信息学分析 将DSGPDH基因最
长编码框编码的701氨基酸序列向NCBI提交进
行相似性搜索。GPDH蛋白质序列的功能结构
域通过 NCBI 的 CDD(conserved domain
database)Search搜索确定。三级结构预测是
由网站 3D-JIGSAW(http://www.bmm.icnet.uk/
servers/3djigsaw/)提供的同源模建法进行预
测 。
2 实验结果
2.1 RACE扩增3-磷酸甘油脱氢酶基因全
长cDNA序列
通过大规模测序以及Blastx搜索分析了盐
生杜氏藻的全长cDNA文库的EST序列, 获得
了3-磷酸甘油脱氢酶基因EST序列以及相应的
克隆子pGPDH-3, 插入序列总长1 609 bp, 插入
序列两端含有文库构建时LD-PCR引物以及3
端的poly(A)结构, 说明这个序列包含完整的3-
磷酸甘油脱氢酶基因 3-UTR序列。
利用GSP引物进行的5RACE电泳如图1,
阴性对照组包括GSP引物单一扩增和UPM引
物单一扩增, 阳性对照组为EST序列上一段长
度为193 bp的特异扩增, 5RACE样品泳道上在
大于1.5 kb处有较强扩增条带, 在1.0 kb处有弱
扩增现象。将2条扩增条带克隆并分别命名为
pGPDH-5A和pGPDH-510, pGPDH-5A测序结果
表明插入序列总长度为1.5 kb, 而pGPDH-510的
长度为 1.0 kb, 是 pGPDH-5A插入序列的一部
分。因此我们取较长的序列pGPDH-5A作为3-
磷酸甘油脱氢酶基因 cDNA5端未知序列。
将3-磷酸甘油脱氢酶基因5RACE获得的
pGPDH-5A插入序列与pGPDH-3插入序列通过
Vector NTI 8.0软件进行拼接, 总长度3 032 bp,
含有一个长度为2 103 bp(最长读框)的ORF, 编
码具有701个氨基酸残基的蛋白质。同时对盐
生杜氏藻反转录物进行全长ORF的扩增(图2),
获得了预期 2 103 bp的片断, 测序结果与拼接
序列比较完全一致。
2 . 2 盐生杜氏藻3 -磷酸甘油脱氢酶基因
图 1 DsGPDH 5RACE电泳结果
1. UPM对照; 2. GSP引物对照; 3. 特异片段; 4.
DsGPDH 5-RACE
Fig. 1 Result of DSGPDH 5RACE
1. Control of UPM primer; 2. Control of GSP primer;
3. Positive control; 4. 5-RACE of DsGPDH gene
32 23(1)
Southern鉴定
本次试验从320 mL 6×107 cells.mL-1新鲜
藻体细胞中提取了约500 mg的总DNA。DNA
纯度高, 完整性好, 可以用于 Southern 杂交。
图 3为 Southern杂交结果, 从各个泳道上看杂
交条带均为一条, 说明这个基因在这个生物的基
因组里为单一拷贝。
2.3 生物信息学分析
2.3.1 相似性搜索 BLASTp相似性搜索结果
表明开放阅读框编码的蛋白质具有2个同源相
似区, 一部分是与NAD+结合3-磷酸甘油脱氢
酶有很强的相似性, 与植物 Cuphea lanceolata
3-磷酸甘油脱氢酶相比, 相似性达到了64%; 同
时另一部分与L-3-磷酸丝氨酸磷酸化酶有较强
的相似性, 与拟南芥的比较, 相似性为58%, 说
明这个部分序列与磷酸丝氨酸磷酸化酶同源。
为了进一步确定这个蛋白质所具有的功能
结构域, 我们通过NCBI的CDD Search搜索结
果可以看出(图4), DsGPDH蛋白质主要具有2
个功能结构域, 一是112～316位磷酸丝氨酸磷
酸化酶样结构域, 二是333～681位NAD结合的
3-磷酸甘油脱氢酶结构域。这个结果同序列相
似性搜索结果一致。磷酸丝氨酸磷酸化酶样
结构域归于水解酶类结构域家族(hydrolase), 因
此在磷酸丝氨酸磷酸化酶样结构域的功能还没
有鉴定之前, 先将其命名为磷酸化酶类结构区
域 。
2.3.2 磷酸化酶类区域结构预测 目前由于
没有植物中磷酸化酶的实测结构, 因此磷酸化酶
样结构域的结构是以与之相似性较高的人类
(Homo sapiens)磷酸丝氨酸磷酸化酶实测结构
(PDB Num.: 1L8L)作为模板进行同源模建的。
预测结构中包含10个a螺旋, 8个b折叠, 除此
之外还含有一些具有二级结构趋势的氨基酸。
这个磷酸化酶样结构域从结构上看包含了
HAD样亚结构域和1个4螺旋束亚结构域, 是
典型的磷酸化酶结构域。预测结果以及基于
二级结构的序列比对见图 5。
2.3.3 3-磷酸甘油脱氢酶区结构预测 3-磷
酸甘油脱氢酶结构域是以利斯曼原虫
(Leishmania mexicana)的3-磷酸甘油脱氢酶实
测结构(PDB Num. :1EVZ)作为模板预测的。预
测结构中有14个a螺旋, 8个b折叠, 其N端部
分包含了1个Rossmann折叠超二级结构域, 是
NAD+结合域, C端部分是1个6-磷酸葡萄糖脱
氢酶C端特征催化结构域, 这2个结构域是3-磷
酸甘油脱氢酶的典型结构域特征(Suresh et al.,
2000; Shin-ichi et al., 2004)。预测结构以及基
于二级结构的序列比对如图 6。
图 2 DsGPDH 阅读框验证
1. 扩增结果
Fig. 2 Amplification of full-length ORF of DSGPDH
gene
1. Amplification result
图 3 DsGPDH Southern鉴定
Fig. 3 Southern blotting of DSGPDH gene
1. BamHⅠ; 2. EcoRⅠ; 3. HindⅢ; 4. KpnⅠ; 5. SmaⅠ
332006 李钢 等: 盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆及其蛋白质结构预测
3-磷酸甘油脱氢酶NAD+结合区含有1个
保守的模体[G]-[X]-[G]-[X2]-[G], 这个区域为
D s G P D H 蛋白质序列从第 3 3 8 位开始的
GSGAWA, 如图6所框区域。DsGPDH的NAD+
结合模体中的Ser339和Trp342在20个真核生
物中是完全一样的, Ser339是在与NAD中核糖
的3位羟基结合中起作用, Trp342位与NAD+中
的烟碱环之间产生疏水作用(图 7)。另外在位
于NAD+中烟碱核糖的3羟基附近的Lys455位
点以及该核糖2羟基处的Gln638位点在真核生
物中完全一致, 与LmGPDH相应位置的氨基酸
——分别为 Lys125和Glu300也高度相似; 与
NAD+腺嘌呤环发生疏水作用的Phe430以及与
腺嘌呤核糖作用的Pro427在真核生物以及原生
动物中都一致(图 7)。
DsGPDH 催化域中主要是以 Lys539、
Asp594、Ser598以及烟酰碱环(nic)构成(图8)。
可以看出Lys539、 Asp594、Ser598三个氨基
酸好似一个平台将磷酸二羟基丙酮支持在活性
中心中, 旁侧的氨基酸比如Arg603、Asn604以
图 4 CDD搜索结果示意图
SerB. 磷酸丝氨酸磷酸化酶结构域; Hydrolase. 水解酶样结构区域; Gph. 磷酸甘油磷酸化酶结构域;
NAD_Gly3P_dh. NAD依赖的GPDH结构域
Fig. 4 CDD search result
SerB. Phosphoserine phosphatase domain; Hydrolase. Hydrolase-like domain; Gph. Phosphoglycerol phos-
phatase domain; NAD_Gly3P_dh. NAD+ GPDH domain
图 5 磷酸化酶样结构域三级结构预测结果以及基于二级结构的序列比对
DsGPDH. DsGPDH的磷酸化酶样结构域; 1L8L_B. 人的磷酸丝氨酸磷酸化酶; SS_TP. 1L8L_B的二级结
构; SS. DsGPDH的预测二级结构; SS Con. 同一的二级结构
Fig. 5 Structure prediction of phosphatase-like domain and sequence alignment based on secondary structure
DsGPDH. Phosphatase-like domain; 1L8L_B. Phosphoserine phosphatease of human; SS_TP. Secondary struc-
ture of 1L8L; SS. Secondary structure of DsGPDH; SS Con. Consensus of secondary structure
34 23(1)
及Gln638主要起辅助作用。这样磷酸二羟基
丙酮的2位羰基的氧原子就可以与NADH的烟
酰碱环上4位碳上的氢发生相互作用, 接受氢而
被还原成 3-磷酸甘油。活性中心情况推测如
图 9。可以看出DsGPDH与模板一致, 说明同
源模建的DsGPDH三级结构比较成功。
图 6 3-磷酸甘油脱氢酶结构域预测结构以及基于二级结构的序列比对
DsGPDH. DsGPDH的 3-磷酸甘油脱氢酶结构域; 1evy_A. LmGPDH; SS_TP. 1evy_A的二级结构; SS.
DsGPDH的预测二级结构; SS Con. 同一的二级结构
Fig. 6 Structure prediction of glycerol-3-phosphate dehydrogenase and sequence alignment based on secondary
structure
DsGPDH. Glycerol-3-phosphate dehydrogenase domain; 1evy_A. Glycerol-3-phosphate dehydrogenase struc-
ture of Leishmania mexicana; SS_TP. Secondary structure of 1evy_A; SS. Secondary structure of DsGPDH; SS
Con. Consensus of secondary structure
图 7 DsGPDH和 LmGPDH NAD+结合域比较
A. DsGPDH蛋白质; B. LmGPDH蛋白. nic. 烟酰碱环; ribose. 核糖; ade. 腺嘌呤环; sug. 腺嘌呤核糖
Fig. 7 NAD+ binding domaim comparasion of DsGPDH and LmGPDH
A. DsGPDH; B. LmGPDH. nic. Nicotinic loop; ribose. Ribose residue of NAD; ade. Adenine loop; sug. Adenine
ribose residue of NAD.
352006 李钢 等: 盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆及其蛋白质结构预测
3 讨论
早在20世纪80年代初有人就对兔子的3-
磷酸甘油脱氢酶结构做出了预测(Otto et al.,
1980), 他们通过对其他脱氢酶结构的比较发现
凡脱氢酶都有重复的b-a-b超二级结构单元, 认
为在3-磷酸甘油脱氢酶也应该存在这样的结构
域, 同时对其催化结构域做出了预测。但是由
于当时的二级结构算法精度不高以及已知脱氢
酶结构有限所以这些工作猜测性大。直到
2000年Suresh等将利斯曼原虫的 3-磷酸甘油
脱氢酶晶体结构公布出来, 对3-磷酸甘油脱氢
酶结构研究才有了真正的模板(Suresh et al.,
2000; Zubrzycki, 2002)。
本文通过以利斯曼原虫的GPDH(以后略作
LmGPDH)作为模板同源模建预测了DsGPDH序
列中3-磷酸甘油脱氢酶结构区的三级结构, 通
过预测结构与已知结构的比较, 得出这两个结构
域预测符合模体搜索和结构域定位的结论, 因此
预测是成功的。从图中预测结构与已知结构
比较看, 预测结构相对松散主要是由于模板与目
标序列的相同率较低, 比对时的空位较多造成
的, 例如图 6灰色部分。因此通过多种方法比
较可以获得比较理想的结构, 我们通过折叠识别
3D-PSSM(www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpssm/)的方
法纠正了插入序列对该蛋白质结构的影响, 使整
图 9 推测的DsGPDH反应活性中心
Fig. 9 Putative reaction center of DsGPDH
图 8 DsGPDH和 LmGPDH的催化结构域比较
A. DsGPDH蛋白质; B. LmGPDH蛋白. nic. 烟酰碱环
Fig. 8 Catalytic domaim comparasion of DsGPDH and LmGPDH
A. DsGPDH; B. LmGPDH. nic. Nicotinic loop
36 23(1)
个结构趋于正常状态。
目前所有已知GPDH蛋白质还没有同时具
有两种功能域的蛋白质, 本实验通过克隆全长
DSGPDH基因所编码的蛋白质具有两种功能
域。因此我们认为这个 3-磷酸甘油脱氢酶很
可能是一个具有酶反应活性中心的蛋白质, 即磷
酸化酶活性和脱氢酶活性, 其中磷酸化样结构域
可能起到 3-磷酸甘油磷酸化酶的作用。因为
磷酸丝氨酸磷酸化酶(EC3.1.3.3)和3-磷酸甘油
磷酸化酶(EC3.1.3.21)属于同一个水解酶类, 而且
两者的反应底物磷酸丝氨酸和3-磷酸甘油都是
三碳化合物, 具有一定相似性, 因此活性中心的
大小相似, 具有相似功能。从结构上磷酸丝氨
酸磷酸化酶和3-磷酸甘油磷酸化酶结构都同属
于HAD样结构超家族, 因此在进化上具有同源
性。在CDD搜索时DsGPDH这个区域同样集
中了磷酸甘油磷酸化酶区, 但由于NCBI数据库
中收集的3-磷酸甘油磷酸化酶数据很少, 因此
判断这个区域是否是3-磷酸甘油磷酸化酶有一
定困难。这个推测可以很好地解释盐生杜氏
藻在面临高渗胁迫的时候快速合成甘油的机制,
磷酸二羟基丙酮通过同一个蛋白质的脱氢酶区
还原, 然后再经过磷酸化酶区去磷酸化, 与单独
两个酶参与还原和去磷酸化的已知途径相比, 提
高了细胞合成甘油的效率。当然这些推测最
终还需要功能鉴定实验证实, 但是生物信息学分
析可为今后的实验提供参考。
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(责任编辑: 白羽红)