全 文 ：收稿日期:2006-07-14;修回日期:2006-09-30
基金项目:国家自然科学基金(30500287)
作者简介:孙晓菲(1982-),女, 2004级硕士研究生 ,研究方向为微生物分子生物学.
通讯作者:曹毅.E-mail:caoyi -01@163.com
文章编号:　0490-6756(2007)02-0433-06
不同胁迫下盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶
基因表达及其与甘油合成的响应
孙晓菲 ,黄　非 ,梁　雪 ,张飞伟 ,杨旺桂 ,白林含 ,乔代蓉 ,曹　毅
(四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都 610064;
四川省生物信息与代谢工程共享实验平台 , 成都 610064)
摘　要:在已克隆的盐藻(Dunaliel la salina)3-磷酸甘油脱氢酶 GPD 基因的基础上 ,利用实
时荧光定量 PCR的方法 ,研究了经高盐 、厌氧 、磷酸盐以及氧化等不同外界胁迫条件下该基因
的表达情况 ,并同时监测了盐藻细胞甘油合成的动态变化.对比酿酒酵母的 GPD 基因 ,发现
D.salina GPD 基因受高渗诱导 ,同时 D.salina细胞内可能存在多个形式的GPD 基因.
关键词:盐生杜氏藻;3-磷酸甘油脱氢酶;荧光定量 PCR;甘油合成
中图分类号:Q78　　　文献标识码:A
Expression of GPD gene from Dunaliella salina treated with
different stress and glycerol synthesis of the cells
SUN Xiao-fei , HUANG Fei , LIANG Xue , ZHANG Fei-wei ,
Y ANG Wang-gui , BAI Lin-han , QIAO Dai-rong , CAO Y i
(Key Labo rato ry of Bio-resources and Eco-environment of Ministry of Education , Sichuan University , Chengdu 610064 , China;
Sichuan Public Experiment Platform of Bioinfo rmatics and Metabolic Engineering , Chengdu 610064 , China)
Abstract:Basing on the cloned Glycerol 3-phosphate dehydrogenase gene of Dunaliel la sal ina (DsGPD), its
expression under salt , oxidative , phosphate and anaerobiosis st ress w ore researched w ith fluorescent real time
PCR.At the same time , the change of to tal glycerol synthesis of the cells w as monitored under the same stress
treatments.Contrast wi th GPD gene of Saccharomyces cerevisiae , osmotic stress significantly induces DsGPD
expression and i t w as suggestd that there may be other types of DsGPD .
Key words:Dunaliella salina , gly cerol 3-phosphate dehydrogenase , fluorescent real time PCR , g ly cerol syn-
thesis
1　引　言
盐生杜氏藻(Dunal iella salina ,简称 Ds.)是
迄今发现的世界上最耐盐的单细胞真核绿藻 ,能在
0.5 ～ 5.5 mol/L 的 NaCl环境下正常生长.在高盐
胁迫环境中 ,盐藻可将细胞中储藏的淀粉迅速转化
成大量的甘油 ,以适应外界渗透压的变化[ 1] .其甘
油代谢的基本过程[ 2] 与酵母细胞中的十分类似 ,
即淀粉经水解成葡萄糖 ,经 1 ,6-二磷酸果糖 ,转化
为磷酸二羟基丙酮(Dihydroxyacetone Phosphate ,
简称 DHAP),接着生成3-磷酸甘油 ,最后在磷酸化
酶的作用下脱去磷酸生成甘油.其中 ,3-磷酸甘油
脱氢酶(g lycerol 3-phosphate dehydrogenase , 简称
GPD)是甘油合成途径中的关键酶[ 3-5] , 它在
2007年 4月　
第 44卷第 2期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)
　 Apr.2007
Vol.44　No.2
NADH的参与下催化磷酸二羟基丙酮向 3-磷酸甘
油的转化.
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞
中 ,3-磷酸甘油脱氢酶有两个同工酶 ,即 GPD1和
GPD2 ,其中 GPD1是酵母细胞在高渗透压环境下
生长所必须的 ,受高渗透压诱导 ,是 HOG 途径的
一个目标基因 ,主要负责在有氧情况下产生甘油;
GPD2是酵母在无氧情况下产甘油所必需的 ,受无
氧条件诱导[ 3 ,6] .相对于酵母的 GPD同工酶基因 ,
盐藻的 GPD研究只停留在天然蛋白的分离和纯化
方面.Durba Ghoshal[ 7]等人从 D.tertiolecta 中分
离纯化出了 3种天然的 GPD蛋白 ,并根据洗脱峰
的形状 、细胞定位和酶学特性 ,将其分别归类为叶
绿体渗透调节型 、叶绿体甘油酯型以及细胞质甘油
酯型.而有关盐藻 GPD同工酶基因及其表达和功
能的报道却很少.
本实验室前期工作已经成功克隆到了
D.salina 的一条 GPD 基因的全长 cDNA.在此基
础上 ,本次实验利用实时荧光定量 PCR的方法 ,研
究了经高盐 、氧化 、磷酸盐以及厌氧等不同外界胁
迫条件下该 GPD 基因的表达情况 ,并同时监测了
盐藻细胞甘油合成的动态变化.结合已被透彻研究
的模式生物———酿酒酵母的 GPD ,可以使我们了
解 D.salina中 GPD 基因的具体分工 ,为进一步研
究 D.salina的耐盐机制和甘油合成机制奠定基
础.
2　材料与方法
2.1　材料及试剂盒
盐生杜氏藻(Dunal iella salina)及用于转化的
宿主菌株 E.coli JM 109均由本实验室保藏.SYBR
ExScript RT-PCR Kit 、ExTaqTM PCR Kit 、pMD 18-
T Vector 购自 Takara公司.Trizol试剂 ,购自 invit-
rogen公司.Gel Extraction Kit ,购自 Omega Bio-
tek公司.甘油检测试剂盒 ,购自 Roche公司.
2.2　方　法
2.2.1　盐生杜氏藻的培养及各种胁迫处理　将原
藻种按5%的接种量加入到盐藻培养基[ 8] .光照16
h ,黑暗 8 h ,于25 ℃培养至对数生长期时取 20 mL
转移到 50 mL 的三角瓶中 ,进行高盐 、氧化 、磷酸
盐及厌氧胁迫.即分别直接向含有 20 mL盐藻的 4
个三角瓶中加入 NaCl 2.34 g(终浓度为 3.5 mol/
L), 30%(W/V)的 H2O2 1 μL(终浓度为 0.4
mmol/L),NaH2PO4 60 mg(终浓度为25 mmol/L),
充入N2 15 min以便尽量排除盐藻培养基中的氧气 ,
用石蜡膜密封.每种胁迫分别处理 0 、1 、2 、4 、6 h.
2.2.2　盐藻总 RNA 的提取及反转录　收集各种
胁迫时间点处理的盐藻细胞 ,按 Trizol试剂说明提
取细胞总 RNA.分别取等量各胁迫条件下的 RNA
进行反转录.反转录采用 SYBR ExScript RT-PCR
Kit提供的随机引物(random primer).反转录体系
为 20 μL ,条件为:42 ℃10 ～ 15 min;95 ℃2 min;
反转录液保存于-20 ℃,用于后续的 PCR反应.
2.2.3　Realtime PCR的内参基因选择及引物验
证　选取盐生杜氏藻 18 S rRNA 作为内参基因.
根据 NCBI 上 DsGPD 基 因 序 列 (Accession
No.AY845323.1)及试剂盒引物设计说明 ,利用软
件 Primer Premier 5.0设计本次荧光定量 PCR反
应引物为:GPD Fo r.5CTGAAGGCTCGTGGAG-
TGGA3, Rev.5TGCCAGGACATGGTGTTGC3.
通过普通的 PCR反应 ,1%琼脂糖凝胶电泳分离 ,
回收目的片段 ,用 T/A 克隆载体进行连接 ,转入
E.coli JM109 ,挑选阳性克隆测序.
2.2.4　标准曲线制作及样品的 real time PCR反
应　使用 SYBR ExScript RT-PCR Kit 的 EASY
Dilution将 cDNA溶液按 100 , 101 ,102 ,103 ,104 ,105
梯度稀释 ,各取 2 μL 进行 real time PCR反应.反
应体系 25μL ,条件为 95 ℃10 s ,1cycle;95 ℃5 s ,
60 ℃30 s ,45 cycles.各胁迫处理样品的反应体系
及 PCR条件与标准曲线制作时的一致 , 各模板
cDNA稀释 3 倍使用 , 每 25 μL 体系加入模板 2
μL ,每个样品做 3个重复.
2.2.5　相对定量的计算　利用如下公式计算目的
基因在样品与对照品间(0 h 的样品)的表达差异
倍数[ 9] :
Rel.Qunantity =GOIsample/GOIcontro l
Norm sample/ N cont rol
=(1+Eff)
Ct
contro l
-Ct
sample
COI
(1+Eff)(Ctcontro l-Ctsample)
Norm
公式说明:Rel.Quantity:目的基因在样品与对照品
间表达差异的倍数;GOI:目的基因(Geneof Inter-
est);Norm :内参基因(Reference Gene , Normalizer ,
House Keeping Gene);Eff:PCR扩增效率 ,分子部
分为目的基因扩增效率 ,分母部分为内参基因的扩
增效率;如果目的基因与内参基因的扩增效率都接
近于 100%,也可将 PCR扩增效率默认为 100%,
这样公式就简化为 2-ΔΔCt.
434 四川大学学报(自然科学版) 第 44卷
2.2.6　盐藻细胞甘油含量的测定　吸取各个胁迫
时间点处理的盐藻 1 mL ,沸水浴煮 5 min ,冰浴放
置 2 min ,10000 g 离心5 min ,取上清液按照 Roche
公司的甘油检测试剂盒说明进行细胞总甘油含量
的测定 ,每个样做 3 个重复.同时取各个胁迫时间
点处理的盐藻 20 mL ,10000 g 离心10 min ,去掉大
部分上清液 ,重悬盐藻细胞并转移到 1.5 mL EP
管中 , 6000 g 离心 1 min ,尽可能去除上清液 ,用天
平称量沉淀的重量并计算 1 mL 盐藻的细胞湿重.
3　结　果
3.1　荧光定量 PCR的结果
3.1.1　标准曲线　内参基因 18 S rRNA 和目的
基因 GPD 的 PCR扩增效率都接近 100%,并且其
标准曲线的相关系数都大于 0.99(图 1及图 2).说
明按此 PCR体系进行的反应效果很好且实验的重
复性也较好 ,满足 2-ΔΔCt法的要求..
3.1.2　融解曲线　从 18 S和 GPD 的融解曲线看
(图 3及图 4 ,该图直接来源于 Bio-rad icy cler定量
图 1　18 S rRNA 的标准曲线
Fig.1　Standard Curve of 18 S rRNA
图 2　DsGPD 基因的标准曲线
Fig.2　Standard Curve of DsGPD
图 3　18 S rRNA 的融解曲线
Fig.3　Melt Curve of 18 S rRNA
435第 2期 孙晓菲等:不同胁迫下盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶基因表达及其与甘油合成的响应 　
图 4　DsGPD 基因的融解曲线
F ig.4　Melt Curve of DsGPD
PCR仪的软件分析结果),两融解曲线都只有单一
的峰 ,说明内参基因和目的基因的扩增片段特异性
非常高 ,没有引物二级结构造成的干扰 ,也没有其
它非特异性条带的污染 ,所以 PCR扩增效果良好 ,
最后的结果可信度高.
3.1.3　盐藻细胞在各种胁迫条件下 GPD 基因的
表达变化　高盐胁迫可以诱导 DsGPD 基因的表
达 ,胁迫 4 h 表达量达到最大.当加入双氧水时 ,
GPD 的表达下降 ,在 6 h后可能会有所恢复.磷酸
盐胁迫也可以诱导 DsGPD 基因的表达 ,胁迫 4 h
表达量达到最大 , 6 h 仍能维持较高的表达量.厌
氧胁迫也明显诱导 GPD 的表达 ,并在胁迫 6 h 时
达到最大表达量(图 5).
图 5　盐藻细胞在各种胁迫条件下 GPD 基因的表达变化
Fig.5　The various expression of DsGPD gene under different stress
(a)高盐胁迫;(b)氧化胁迫;(c)磷酸盐胁迫;(d)厌氧胁迫纵坐标为 DsGPD 基因 mRNA的相对表达量 ,横坐标为胁迫时间 ,单位是 h
436 四川大学学报(自然科学版) 第 44卷
3.2　不同胁迫条件下盐藻细胞总甘油合成的动态
变化
可以看出高盐胁迫和氧化胁迫都可以诱导盐
藻细胞甘油的合成 ,在高盐胁迫 4 h 时 ,盐藻细胞
甘油合成的总量达到最大 ,此时的甘油量是0 h的
2.5倍.而氧化胁迫 2 h 时甘油合成达到最高 ,是
0 h的 1.8倍左右.磷酸盐胁迫下 ,盐藻细胞甘油先
减少后增加 ,在 2 h时达到最低 , 4 h 时达到最高.
同样的 ,厌氧胁迫下 ,盐藻细胞甘油量 2 h 时达到
最低 ,随后慢慢回升 ,在 6 h 时基本接近 0 h 的水平
(图 6).
图 6　在各种胁迫下盐藻细胞总甘油合成的动态变化
Fig.6　The change of cell total glycerol under different stress
(a)高盐胁迫;(b)氧化胁迫;(c)磷酸盐胁迫;(d)厌氧胁迫纵坐标为盐藻细胞总甘油的量,单位是 g 甘油/ g 湿细胞;横坐标为时间 ,单位是
h
4　讨　论
4.1　荧光定量 PCR
荧光定量 PCR技术具有高通量 、特异性强 、解
决PCR污染和操作简单等优点[ 9] .它的灵敏性以
及对扩增过程进行实时监控的能力提高了基于
PCR进行定量的有效性.该技术是对 PCR反应过
程中的每一个循环根据 Ct值进行定量分析 ,因此
只要在仪器检测的灵敏度范围内 ,就可以进行精确
的外源基因拷贝数定量.荧光定量 PCR分为相对
定量和绝对定量 ,本实验采用的是相对定量法.与
绝对定量不同 ,相对定量不关心每个样品中目的基
因表达产物的具体拷贝数 ,而关注目的基因在不同
的细胞类型 、不同的发育周期等条件下不同的转录
效率 ,即基因的差异化表达.就研究目的而言 ,该方
法比绝对定量的应用范围更广泛 、更符合研究的目
的.
4.2　不同胁迫条件下 DsGPD 基因的表达与盐藻
细胞总甘油含量的变化
从图 5 中可以看出 , 在高盐胁迫的情况下 ,
DsGPD 表达增加 ,说明其受高渗诱导.这是由于当
外界渗透压增加时 ,盐藻细胞需要快速且大量的合
成甘油来平衡膜内外的渗透压差异[ 1] .同时 , DsG-
PD 的表达受到氧化胁迫的抑制 ,可能是由于双氧
水可以氧化细胞内的 NADH ,从而抑制 GPD 的表
达.而磷酸盐又能诱导 DsGPD 的表达 ,可能是由
于磷元素是藻类生长的必须元素 ,当向培养基中加
入磷酸盐时 ,藻细胞会大量生长繁殖 ,细胞处于一
个旺盛的生长期 ,所以 GPD 基因的表达可能会增
加.在厌氧胁迫下 DsGPD 的表达会增加 ,且在 6 h
后还能维持很高的表达 , 这就类似于酿酒酵母
(Saccharomyces cerev isiae)的 GPD2 基因.对酿酒
酵母的研究表明[ 3 , 6] ,其 GPD1的表达受到高渗诱
导 ,是 HOG 途径的一个靶基因;而其 GPD2 基因
437第 2期 孙晓菲等:不同胁迫下盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶基因表达及其与甘油合成的响应 　
的表达是酿酒酵母在缺氧情况下合成甘油所必需
的 ,它的表达受到厌氧条件诱导 ,主要是在缺氧的
情况下 , 通过它的高量表达合成甘油 ,达到消耗
NADH的目的 ,从而起到调节细胞的氧化还原平
衡的作用 ,故而它的调控受到一条和氧无关的信号
途径调节.本实验还同时监测了这四个胁迫条件
下 ,盐藻细胞总甘油合成的动态变化.从图 6 中可
以看出高盐胁迫和氧化胁迫都可以诱导盐藻细胞
甘油的合成 ,在高盐(3.5 m NaCl)诱导 4h 时的甘
油量达到最大 ,是 0 h 的 2.5倍 ,这与图 5A 中 Ds-
GPD 基因表达情况一致.而氧化诱导 2 h时细胞甘
油合成量就达到最高 ,是 0 h 的 1.8倍左右 ,其后
不再增加 ,这与图 5(b)中 DsGPD 基因的表达情况
不符.甘油是盐藻细胞抵御氧化胁迫危害的必要条
件[ 10] ,而实验结果显示 ,氧化胁迫降低了 DsGPD
mRNA的水平 ,却诱导了甘油合成的增加 ,这说明
盐藻细胞内还可能存在其他形式的 GPD 基因可
以在氧化胁迫下高表达 ,从而使细胞合成大量甘
油.磷酸盐胁迫下 ,细胞甘油含量先下降后增加 , 2
h时下降至最低 ,4 h时恢复至较高水平 ,这与图 5
(c)中 DsGPD 基因的表达情况基本相符.磷酸盐
能够抑制 3-磷酸甘油脱氢酶的酶活[ 11] ,这可能就
是 DsGPD 基因在磷酸盐胁迫前两个小时内表达
高于 0 h水平而细胞甘油量低于 0 h水平的原因.
盐藻细胞在厌氧胁迫下 2 h甘油含量降至最低 ,随
后慢慢恢复 ,这一情况与图 5(d)中 DsGPD 基因的
表达情况不符 , DsGPD mRNA 水平增加而细胞甘
油含量却下降 ,可能是由于盐藻细胞内存在的其他
形式的 GPD 基因被厌氧胁迫抑制 ,无法合成甘
油 ,致使 DsGPD 基因的高表达量不能弥补其他形
式GPD 基因的被抑制量 ,从而导致细胞甘油含量
下降.本实验室目前已经从 Dunaliella salina 中克
隆到了另一条 GPD 基因的 EST ,它也有可能参与
盐藻细胞甘油合成途径.
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438 四川大学学报(自然科学版) 第 44卷