全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 526-531, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-10-24; 接受日期: 2006-12-25
基金项目: 国家自然科学基金(No.30560094)和国家教育部科学技术重点项目(No. 205035)
* 通讯作者。E-mail: lianmeilan2001@yahoo.com.cn
.组织培养简讯.
生物反应器在满天星快繁中的应用
张春华, 朴炫春, 廉美兰*, 王守明
延边大学农学院园艺系, 龙井 133400
摘要 利用2.5 L柱状气升式生物反应器采用接触法进行了满天星(Gypsophila paniculata)增殖培养。结果表明: 外植体接
种密度(每个反应器接种外植体个数)为35比密度为25和45更有利于满天星的增殖生长, 平均每个生物反应器内可获得252株
生长健壮的不定苗; 光强为90 mmol.m-2.s-1对满天星增殖培养最有利, 过高的光强对不定芽和株高有抑制作用; 通过小孔隙
(15 mm)的多孔喷头注入0.1 vvm空气有利于满天星增殖培养。
关键词 生物反应器, 满天星, 增殖培养
张春华, 朴炫春, 廉美兰, 王守明 (2007). 生物反应器在满天星快繁中的应用. 植物学通报 24, 526-531.
组培技术目前被广泛应用于具商业化生产和重要经
济价值植物的无性繁殖。然而, 随着对组培苗需求的不
断增加, 常规的组培方法由于效率较低、成本高而较难
满足大规模生产植物组培苗的需求, 因此迫切需要建立
一种用简单的生产设备和技术便可大规模繁殖生产植物
组培苗的新工艺和方法, 从而大大降低植物组培生产的
劳动强度和生产成本。生物反应器是目前被认为可以
使植物组织培养体系由小规模转向大规模, 同时大幅提
高生产效率及降低生产成本和劳动强度的快速繁殖组培
苗的生产装置(Paek et al., 2001)。
满天星(Gypsophila paniculata)在我国气候条件下
不能结籽, 扦插成活率较低。而组织培养虽是其植株再
生的有效途径, 但却存在成本高、规模小等问题而远不
能满足市场需求。赵长新等(2005)发现, 采用生物反应
器培养能有效实现大量扩繁满天星组培苗。生物反应
器在植物细胞培养中应用较为广泛(Yuan et al., 2004;
Attilio et al., 2006), 主要类型有搅拌式、气升式、鼓
泡式和转鼓式(黄艳等, 2001a)。其中气升式生物反应
器是以气体为动力, 靠导流装置的引导, 形成气液固混合
物的总体有序循环, 具有混合效果好、结构简单、无
运动部件、易清洗、不易染菌和传热传质效率高等特
点(张明菊, 2005)。目前在蝴蝶兰(Park et al., 2002)、
百合(Lian et al., 2003)和菊花(Hahn and Paek, 2005)
等植物器官培养方面得以应用, 并取得较好效果。但在
满天星种苗的快速繁殖方面尚无研究报道。本文利用
2.5 L气升式生物反应器进行满天星幼苗的快速扩繁, 探
讨各种培养条件对满天星增殖和生长的影响, 以期为今
后运用气升式生物反应器进行放大培养, 实现满天星种
苗的商业化生产奠定实验和技术基础。
1 材料与方法
将通过茎尖离体培养得到的满天星 ( G y p s o p h i l a
paniculata)试管丛生苗切成单株(带4片叶)作为实验
材料 。
1.1 生物反应器和培养基
实验使用自制的 2.5 L柱状气升式生物反应器(f×h: 14
cm×16 cm), 其结构如图 1。培养时, 在距离反应器底
部3.0 cm处架一支持网, 通过定期补充培养基使接入反
应器内的外植体在支持网上始终与培养基刚刚接触, 培
养基量保持在 0.5 L。所用的培养基为MS(Murashige
527张春华等: 生物反应器在满天星快繁中的应用
and Skoog, 1962)加倍后的液体培养基, 附加0.5 mg.
L-1 BA、0.1 mg.L-1 NAA和 30 g.L-1 蔗糖, pH值调
至 5 . 8。
1.2 处理方法
生物反应器内接种密度对满天星增殖的影响实验设置3
种处理, 每个反应器分别接种 25、35和 45个外植体,
并使用直径为 2.4 cm、长 4.7 cm、孔隙为 60 mm的
多孔喷头, 注入0.10 vvm (air volume/culture volume/
min)的空气, 在光强为 30 mmol.m-2.s-1下培养。在探
讨生物反应器内光照强度对满天星增殖的影响时, 每个
反应器内接种 35个外植体, 光强分别为 10、30、60、
90和120 mmol.m-2.s-1, 其它条件与密度实验相同。进
行选择生物反应器适宜喷头实验时, 设置 A(多孔喷头,
孔隙 15 mm)、B(多孔喷头, 孔隙 60 mm)和 C(硅胶管,
内径4 mm)3种处理, 每个反应器接入35个外植体, 光
强为 90 mmol.m-2.s-1, 其它条件与密度实验相同。而
在探讨生物反应器内通气量对满天星增殖的影响时, 使
用孔隙为 60 mm 的喷头, 通气量分别为 0、0.05、
0.1、0.2和 0.3 vvm, 其它条件同喷头实验。
1.3 培养条件及数据统计和处理
将接种后的生物反应器置于温度(25±2)°C, 每天光照16
小时, 培养 20天后统计幼苗增殖情况。其中叶绿素含
量用叶绿素测定仪(SPAD-502, Minolta Camera Co.
Ltd., Japan), 随机取中部 3片叶子进行测定。每个处
理设置3个重复, 所得结果用SAS(Statistical Analysis
System, Cary, NC, USA)软件处理, 采用邓肯氏新复极
差法进行分析比较, 显著水平 P<0.05。
2 结果与分析
2.1 生物反应器内培养密度对满天星增殖的影响
将 25、35和 45个满天星外植体分别接入生物反应器
内进行增殖培养, 20天后统计记录外植体的增殖和生长
情况。由表 1可见, 接种密度为 35时, 增殖效果最好,
平均每个外植体分化的幼苗数为7.2个, 每个反应器可
生产252株幼苗, 明显多于接种密度为25和45的处理。
接种密度为 35的处理, 其幼苗的株高、鲜重和干重显
著优于其它 2种处理, 且植株健壮, 无徒长现象。叶绿
素在接种密度为25和35时处理间差异虽不显著, 但均
优于接种密度为 45的处理。已有研究表明, 在植物组
织培养过程中器官形成与发育受外植体数 /培养基量、
外植体数 /空气量和外植体数 /容器容积等比值的影响
(McClelland and Smith, 1990)。在植物器官的培养过
程中发现接种密度影响培养体的生长, 适宜接种密度依
据植物种类、培养方式等而不同(Park et al., 2002;
Hahn and Paek, 2005)。
在本实验中, 当接种密度为35时, 其增殖和生长效
果均表现良好, 而当接种密度为45时, 由于植株过于拥
挤, 导致部分幼苗死亡, 培养 20天后只有 35个外植体
成活, 且大多数苗的基部变黄。而在接种密度为 25时,
其外植体的增殖和生长情况均不良。实验结果表明, 在
利用直径为 14 cm、高 16 cm的 2.5 L柱状生物反应
器采用接触法进行满天星快速增殖培养时, 以接种密度
为 35的增殖效果最好。
图 1 生物反应器结构示意图
A: 进气口; B: 空气调节器; C: 薄膜过滤器; D: 喷头; E: 支持网; F:
出气口; G: 贮液瓶
Figure 1 Schematic diagram of bioreactor
A: air inlet; B: air flow meter; C: membrane filter; D: sparger; E:
supporter net; F: air outlet; G: medium reservoir
528 植物学通报 24(4) 2007
2 . 2 光照强度对满天星生物反应器增殖的影响
光照强度对生物反应器内满天星增殖和生长的影响见
表 2。满天星增殖的幼苗数以光强为 120 mmol.m-2.
s-1的处理最少, 但其它各光照强度下培养的满天星外植
体所产生的幼苗数目无显著差异, 幼苗的株高则随生物
反应器内光照强度的增加而逐渐下降。对比各光照强
度培养下的满天星外植体所产生幼苗的鲜重和干重, 以
在90 mmol.m-2.s-1的光照强度下效果最佳; 120 mmol.
m-2.s-1的过强光照则对幼苗的鲜重和干重有抑制作
用。在本实验中, 随着光强增加, 幼苗的叶绿素含量也
升高, 但在光照强度为90和120 mmol.m-2.s-1时, 其幼
苗的叶绿素含量无显著差异。本实验结果表明, 较强的
光照对生物反应器内满天星增殖培养是必需的, 其中以
90 mmol.m-2.s-1光强对满天星增殖培养最为有利, 过高
的光强对不定苗的形成和株高都有抑制作用。
2.3 生物反应器内喷头种类对满天星增殖的影响
生物反应器喷头种类对满天星增殖生长的影响见表 3。
在对生物反应器进行通气时, 随着多孔喷头孔隙直径的
减小, 所产生幼苗的株高、鲜重和干重逐渐增加。其
中, 以A喷头效果最好, 所产生的幼苗最多; B喷头所得
到的幼苗数虽与 A喷头无显著差异, 但所得幼苗的株
高、鲜重和干重则差异显著。而当空气直接通过内径
为4 mm的硅胶管(C喷头)生物反应器时, 满天星外植体
的增殖及其幼苗的生长均受抑制。
气升式生物反应器是利用喷头的喷射动能和流体在
反应器内的重度差造成流体循环流动, 从而实现培养液
的搅拌、混合和溶氧。反应器内的溶氧量对植物细胞
和器官生长影响很大, 而溶氧率通常与搅拌强度、气泡
分散程度、培养基的溶氧度和容器内水压等有关(黄艳
等, 2001b)。Tanaka(1981)认为喷头孔隙对生物反应器
内植物体的生长产生影响, 喷头孔隙大, 所注入空气的气
泡大, 从而使气体不能充分扩散到培养基中, 造成培养基
内的溶氧低而不利于植物体生长, 这与本实验的结果类
似。在本实验中, 用可喷射出大小一致微细气泡的A和
B两种处理进行通气培养的生物反应器增殖满天星的效
果比较好, 而只产生竖直的大气泡的C处理的增殖效果
较差。这可能是由于 A和 B两种多孔喷头均可喷射出
大小一致的微细气泡, 且散射范围较大, 能与培养基充分
混合, 而C处理只产生直径较大的气泡, 它们在生物反
应器内流体循环慢, 不能很好地与培养基混合, 因而使得
满天星的增殖及其幼苗的生长受到影响。所以在应用
表 1 反应器内接种密度对满天星增殖和生长的影响
Table 1 Effect of inoculation density in bioreactor on proliferation and growth of Gypsophila paniculata
Inoculation density
No. of shoots No. of shoots Shoot length
Shoot fresh
Shoot dry weight Chlorophyll(No. of explants
/explant /bioreactor (cm)
weight
(mg/explant) content**/bioreactor) (mg/explant)
25 5.0 b* 125.0 c 2.9 b 1232.3 c 99.7 b 25.5 a
35 7.2 a 252.0 a 4.6 a 1998.1 a 110.6 a 23.7 a
45 5.4 b 189.0 b 3.2 b 1567.0 b 80.6 b 18.0 b
*Different letters means significant at P < 0.05 level by Duncan’s multiple range test; **SPAD value
表 2 光照强度对生物反应器内满天星增殖和生长的影响
Table 2 Effect of light intensity on proliferation and growth of Gypsophila paniculata in bioreactor
Light intensity No. of shoots Shoot length Shoot fresh weight Shoot dry weight Chlorophyll
(mmol.m-2.s-1) /explant (cm) (mg/explant) (mg/explant) content**
10 5.3 a* 4.8 a 820.5 c 52.4 c 10.1 c
30 5.1 a 4.7 ab 978.0 bc 42.0 d 9.4 c
60 5.3 a 4.5 b 1068.0 b 63.0 b 18.1 b
90 4.7 a 3.6 c 1244.3 a 82.3 a 21.9 a
120 2.3 b 2.1 d 377.2 d 36.4 d 23.1 a
*Different letters means significant at P < 0.05 leve by Duncan’s multiple range test; **SPAD value
529张春华等: 生物反应器在满天星快繁中的应用
表 3 生物反应器内喷头种类对满天星增殖和生长的影响
Table 3 Effect of sparger types in bioreactor on proliferation and growth of Gypsophila paniculata
Sparger types*
No. of shoots Shoot length Shoot fresh weight Shoot dry weight
/explant (cm) (mg/explant) (mg/explant)
A 5.3 a** 4.9 a 2068.2 a 104.2 a
B 4.9 a 4.5 b 1239.4 b 83.3 b
C 3.6 b 3.9 c 873.2 c 73.6 b
* A: lacunosis sparger of 15 mm; B: lacunosis sparger of 60 mm; C: silica gel tube of 4 mm inner diameter;
** Different letters means significant at P < 0.05 level by Duncan’s multiple range test
表 4 通气量对生物反应器内培养的满天星增殖和生长的影响
Table 4 Effect of air volume on proliferation and growth of Gypsophila paniculata in bioreactor
Air volume No. of shoots Shoot length Shoot fresh weight Shoot dry weight
(vvm) /explant (cm) (mg/explant) (mg/explant)
0 -* - - -
0.05 3.5 c** 2.5 c 775.1 b 57.0 b
0.10 7.0 a 2.8 b 1298.9 a 97.1 a
0.20 4.7 b 3.3 a 880.0 b 51.8 bc
0.30 2.3 d 2.2 d 440.7 c 41.1 c
* Indicated not determine due to death of shoot; ** Different letters means significant at P < 0.05 level by Duncan’s multiple range
test
图 2 生物反应器内不同通气量条件下满天星的增殖和生长
Figure 2 Proliferation and growth of Gypsophila paniculata under different air volume conditions of bioreactor
(vvm means air volume/culture volume/min)
530 植物学通报 24(4) 2007
气升式生物反应器快速增殖满天星幼苗时, 应选择孔隙
小的多孔喷头, 不宜采用直接通过管子注入空气的通气
方式。
2.4 通气量的影响
通气量对满天星生物反应器增殖和生长的影响见表 4。
不通气(0 vvm)时, 所接种的满天星外植体在2周内逐渐
变黄直至死亡。而当通气量为0.1 vvm时, 所产生的幼
苗不仅生长健壮, 而且幼苗的数目、鲜重和干重均显著
优于其它处理; 但当通气量达0.3 vvm时, 外植体的增殖
效果变差(图 2)。实验结果表明, 生物反应器培养需要
供给一定量的空气, 但较多的空气注入则因流体动力胁
迫使植物生长受到抑制。空气的注入是进行生物反应
器培养的重要参数(Schlatrmann et al., 1994)。Jeong
等(2006)认为通气量与溶氧率有直接的关系, 是影响生
物反应器培养效果的重要因素。在本实验中, 0.1 vvm
是促进满天星增殖和生长的最适通气量, 超过0.3 vvm不
利于满天星幼苗的增殖。
参考文献
黄艳, 赵德修, 李佐虎 (2001a). 利用生物反应器培养植物细胞的
研究进展 (II). 植物学通报 18, 665-671.
黄艳, 赵德修, 李佐虎 (2001b). 植物细胞生物反应器培养的研究
进展 (I). 植物学通报 18, 567-570.
张明菊 (2005). 生物反应器产业概况. 黄冈职业技术学院学报 7,
87-91.
赵长新, 廉美兰, 朴炫春 (2005). 应用生物反应器培养满天星幼苗
的初步研究. 吉林农业大学学报 27, 10-12.
Attilio C, Alessandra L, Adriana DB, Carlo S (2006). Cultiva-
tion of Spirulina platensis in a combined airlift-tubular reactor
system. Biochem Eng J 32, 13-18.
Hahn EJ, Paek KY (2005). Multiplication of Chrysanthemum shoots
in bioreactors as affected by culture method and inoculation
density of single node stems. Plant Cell Tissue Organ Cult
81, 301-306.
Jeong CS, Chakrabarty D, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2006).
Effect of oxygen, carbon dioxide and ethylene on growth and
bioactive compound production in bioreactor culture of gin-
seng adventitious roots. Biochem Eng J 27, 252-263.
Lian ML, Chakrabarty D, Paek KY (2003). Growth of Lilium
oriental hybrid ‘Casablanca’ bulblet using bioreactor culture.
Sci Hortic 97, 441-448.
McClelland MT, Smith MAL (1990). Vessel type, closure and
explant orientation influence in vitro performance of five woody
species. HortScience 25, 797-800.
Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid
growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol
Plantarum 15, 473-497.
Paek KY, Hahn EJ, Son SH (2001). Application of bioreactors of
large scale micropropagation systems of plants. In Vitro Cell
Dev Biol Plant 37, 149-157.
Park SY, Murthy HN, Paek KY (2002). Mass multiplication of
protocorm-like bodies using bioreactor system and subse-
quent plant regeneration in Phalaenopsis. Plant Cell Tissue
Organ Cult 63, 67-72.
Schlatmann JE, Fonck E, ten Hoopen HJG, Heijnen JJ (1994).
The negligible role of carbon dioxide and ethylene in ajmalicine
production by Catharanthus roseus cell suspension. Plant
Cell Rep 14, 157-160.
Tanaka H (1981). Technological problems in cultivation of plant
cell at high density. Biotechnol Bioeng 23, 1203-1218.
Yuan XF, Zhao B, Wang YC (2004). Cell culture of Saussurea
medusa in a periodically submerged air-lift bioreactor. Biochem
Eng J 21, 235-239.
531张春华等: 生物反应器在满天星快繁中的应用
Application of Bioreactors in Rapid Propagation of
Gypsophila paniculata
Chunhua Zhang, Xuanchun Piao, Meilan Lian*, Shouming Wang
Department of Horticulture, Agricultural College of Yanbian University, Longjing 133400, China
Abstract We investigated proliferation culture of Gypsophila paniculata by using a raft method in a 2.5 L air-lift bioreactor of the
column type. Inoculation density of 35 explants in the bioreactor was more favorable than treatments of 25 and 45 explants for
proliferation; 252 vigorous adventitious shoots were obtained for the 35 explants with the bioreactor. A light intensity of 90
mmol·m-2·s-1 was considered the most effective, but excessive light inhibited shoot formation and length. Furthermore, proliferation
of G. paniculata in the bioreactor was more efficient with lacunaris sparger of small pore size (15 mm) and 0.1 vvm of air.
Key words bioreactor, Gypsophila paniculata, proliferation culture
Zhang CH, Piao XC, Lian ML, Wang SM (2007). Application of bioreactors in rapid propagation of Gypsophila paniculata. Chin Bull
Bot 24, 526-531.
* Author for correspondence. E-mail: lianmeilan2001@yahoo.com.cn
(责任编辑: 白羽红)
新书介绍 — — 《细胞遗传学》
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胞质遗传(重点介绍细胞质遗传研究的最新进展和细胞质雄性不育的机制); 第十章：植物染色体工程(以小麦的染色体工程为
重点, 理论联系实际, 经典的染色体工程与现代的染色体操作相结合)。
细胞遗传学是遗传学与细胞学的交叉学科, 它侧重于染色体(包括细胞质的基因组)的结构、功能、调控机制、染色体
组、染色体操作等方面的研究, 通过染色体、染色体组、细胞质、细胞质基因组来研究遗传与变异的机制。细胞遗传学
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