全 文 ：ISSN 1000-0054
CN 11-2223 /N
　 清华大学学报 (自然科学版 )
J Tsingh ua Univ ( Sci & Tech ) ,
2003年 第 43卷 第 12期
2003, Vo l. 43, No. 12
8 /32
1609-1612　
固液两步法的藏红花素生物合成
郭志刚 , 　邓　颖 , 　刘瑞芝
(清华大学 化学工程系 ,北京 100084)
收稿日期: 2003-02-14
作者简介: 郭志刚 ( 1958-) ,男 (汉 ) , 北京 ,副教授。
E-mai l: guozhig@ tsinghua. edu. cn
摘　要: 为提高现代生物技术生产藏红花素的产率和效率 ,
该研究采取固液两步培养法将在固体培养基中获得的藏红
花愈伤组织转移到液体培养基中进行生物合成 ,结果显示生
物反应器比摇瓶培养更有利于生物量的积累 ,也更有利于 2
号藏红花素的合成。 碳源、氮源和磷酸的消耗与藏红花素的
合成密切相关。采取固液两步培养法可以有效解决藏红花素
合成与藏红花素抑制细胞快速增殖的相互矛盾。该结果对具
有抗癌作用的藏红花素产业化有重要意义。
关键词: 植物细胞学 ; 藏红花 ; 藏红花素 ; 摇瓶悬浮培养 ;
生物反应器 ; 愈伤组织
中图分类号: Q 942 文献标识码: A
文章编号: 1000-0054( 2003) 12-1609-04
Biosynthesis of crocin in a
solid-liquid two-step cell culture
GUO Zhigang , DENG Ying , LIURuizhi
(Department of Chemical Engineering,
Ts inghua Universi ty, Beijing 100084, China)
Abs tract: Th e biotech nology prod uct ion ef ficiency of crocin II,
which has an ti-cancer activi ty, w as imp roved in a solid-liquid
two-s tep cell cul tu re in which th e callus cell s ob tained f rom th e solid
medium w ere t ran sfer red to th e liquid medium. Th e result s sh ow
th at the bio reactor cul tu re not on ly increas es th e biomass compared
wi th f lask cultures, but als o favo res the s ynth esi s of crocin II. Th e
consumption of the carbon, ni trogen and ph osphate acid clos ely
correlated w ith th e crocin synthesis. Th e s olid-liquid tw o-step
cul ture res olv ed th e con flict betw een th e m ultiplication of the saff ron
cells and th e crocin s ynth esi s, to enhance th e rapid accumu lation and
yield of crocins. The process can faci lit ate th e indus t riali zation of
crocin p rod uction.
Key words: plant cytology; saf f ron; crocin; fl ask suspension
cul tu re; bioreactor; callus
　　藏红花 (Crocus sativus L. )是一种活血化淤的
名贵中药材。最新的研究表明 ,藏红花具有广谱的抗
癌活性 ,对白血病、皮肤癌、结肠癌、横文肌肉瘤和淋
巴癌等都具有较强的抑制作用 ,而且对正常细胞的
毒副作用很小 [1 ]。但是 ,由于藏红花的生药产量很低
(产量约 6 kg /hm2 ) ,在中国又很难大面积栽培 ,所
以利用生物技术生产其替代产品将具有重要的社会
意义和经济价值。
在植物细胞工程领域 ,产业化的最大障碍是因
细胞增殖速度缓慢和有效成分含量低而造成的生产
成本过高。总结以往的研究会发现 ,植物细胞在固体
培养基中的增殖量经过 30 d可以达到 5～ 20
倍 [2, 3 ] ,而在液体培养基中每 30d的增殖量一般为 2
～ 4倍 [4～ 6 ]。虽然在固体培养中细胞增殖较快 ,但是
由于其培养基传质不良而不利于次生代谢产物合
成。在藏红花细胞培养过程中 ,由于藏红花素合成以
后会抑制 DNA的合成而影响细胞分裂 [ 7] ,所以其
细胞的增殖与产物的合成相矛盾。为此 ,开发出细胞
固液两步培养法 ,既通过固体培养抑制藏红花素合
成并获得较大生物量 ,再利用液体培养快速合成藏
红花素的新型培养方法。 本论文将重点报告把在固
体培养中获得的藏红花愈伤组织细胞转移到液体培
养基中合成藏红花素的动力学研究。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
实验选用了本实验室自己筛选出的 C96细胞
系作为实验材料 ,在改良的 M S培养基中添加
BA 0. 25mg /L, N AA 2mg /L, 蔗糖 45 g /L, 琼脂
9 g /L, pH 5. 7～ 5. 8, 在 20℃的黑暗条件下大约每
30 d增殖培养一次。
1. 2　摇瓶培养实验
在改良的 1 /2 M S培养基中添加 0. 4 mg /L
BA, 4mg /L IAA, 30g /L蔗糖 ,一定量的藏红花素
DOI : 10. 16511 /j . cnki . qhdxxb. 2003. 12. 008
合成诱导子 , pH= 5. 7～ 5. 8, 作成液体培养基。将
继代培养的藏红花愈伤组织按 (细胞鲜质量 培养基
体积 )= 100 g /L的接种量接种在 200 mL三角瓶
中 ,每瓶 50mL培养液接种 5 g愈伤组织细胞 ,重复
3次。然后在 25℃、黑暗条件、 100 r /min摇床上培
养 14 d。每两天取样一次 ,收获细胞经冷冻干燥后
称取干质量 ,计算生物量增长倍数= (收获细胞干质
量 -接种细胞干质量 ) /接种细胞干质量。 分析培养
液中营养物质的消耗变化和细胞中藏红花素含量。
1. 3　生物反应器培养实验
实验中采用日本东京理化生产的 EPC-500PE
型植物细胞反应器。培养基和实验材料与上述摇瓶
培养实验相同 ,藏红花愈伤组织按 (细胞鲜质量 培
养基体积 )= 100 g /L的接种量接入 2 L培养液中 ,
在 25℃避光培养 ,搅拌转速 100 r /min, 通气量为
0. 1 n L /min下分别培养 2d、 4d、 6d,直至 14 d, 收
获细胞经冷冻干燥后称取干质量 ,计算其生长倍数 ,
测定培养液中营养物质的消耗情况并分析其藏红花
素的含量。
1. 4　营养物质浓度测定
收集培养液 ,用 3, 5-硝基水杨酸显色法测定培
养液中的总糖和还原糖含量 ,用靛定酚蓝比色法测
定培养液中的氨态氮含量 ,用磷钼蓝比色法分析培
养液中的磷含量。
1. 5　藏红花素含量分析
收获藏红花细胞经冷冻干燥后磨碎 ,用 50%的
乙醇按 (干细胞质量 乙醇体积 )= 0. 02 g /m L的比
例 ,在 25℃ , 100 r /min摇床萃取 24 h。萃取液经高
速离心取上清液 ,并经 0. 22μm的膜过滤后 ,用
HPLC分析其藏红花素的含量。所用 HPLC为岛津
10 Avp高效液相色谱仪 ,岛津反相 C18色谱柱 (粒度
5μm, 6mm× 150 mm) , 流动相为甲醇 -水 ,甲醇
0～ 100%线性梯度洗脱 60min, 柱温 40℃ , 检测波
长 250 nm, 流速为 1. 0mL /min。标准品为本实验
室分离纯化的 2号藏红花素 ,经过质谱和核磁鉴定 ,
纯度为 99%。
2　结果与讨论
2. 1　生物量的积累
图 1表明 ,在藏红花素的合成过程中 ,生物反应
器培养较摇瓶更有利于生物量的积累。在摇瓶培养
中 ,前 4 d的细胞生物量增加了约 17% , 而后不再
增加。 在生物反应器中 ,由于搅拌和通气比较充分 ,
培养液的溶氧可以维持在 90%左右 ,所以藏红花细
胞有明显增殖的现象 ,在 10 d之内细胞增殖了 65%
左右 ,而后进入衰退期。这是由于藏红花素具有抑制
DNA的合成和细胞分裂的作用 [ 14] , 10 d左右细胞
变成了红色 ,表明细胞中大量合成了藏红花素 ,所以
细胞的生长受到了抑制。此外 ,由于反应器的空间较
大 ,大约有 15%的细胞贴壁生长 ,这也有利于细胞
的增殖。
图 1　藏红花素合成过程中生物量积累变化
2. 2　藏红花素的合成
2号藏红花素的合成过程如图 2所示 ,在前
6 d, 摇瓶培养与生物反应器培养的 2号藏红花素含
量变化趋势基本相同 ,其合成速度比较缓慢。由于在
此阶段细胞处于快速分裂和环境适应阶段 ,所以并
不利于藏红花素的合成。 第 6 d以后 ,细胞开始变
红 ,表明进入藏红花素快速合成阶段。在生物反应器
中的藏红花素合成速度明显高于摇瓶培养。 第 12 d
2号藏红花素的含量达到最高值 ,约为 34. 6mg /g,
即为细胞干质量的 3. 4%。比接种时细胞内的 2号
藏红花素含量增加了 10倍左右。 12 d以后 2号藏
红花素的含量开始下降 ,表明由于细胞老化和培养
液中的合成前体减少 ,已经合成的 2号藏红花素有
可能发生转化。在摇瓶培养中 , 6 d以后 2号藏红花
素的含量开始增加 ,但在实验结束时 ,其含量只有细
胞干质量的 1. 7% 。
2. 3　碳源的消耗
从实验结果来看 (图 3b ) , 生物反应器培养从
第 2 d到第 8 d培养液中的碳源被迅速消耗 ,占添加
总糖量的 60%左右。而此刻正处于细胞快速生长和
藏红花素缓慢合成阶段 ,由此可知此时所消耗的碳
源基本用于细胞增殖。而后 ,细胞增殖速度减慢并最
后停止分裂 ,伴之培养液中的蔗糖也全部转化为还
原糖 ,此时碳源的消耗量 (cs )趋于平衡 ,表明合成藏
红花素对碳源的需求量不大。 摇瓶培养实验结果也
1610 清 华 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2003, 43( 12)
图 2　藏红花素合成过程 2号藏红花素的积累
可证明这一点 ,只是在摇瓶培养过程中 ,培养液中的
碳源消耗比较缓慢 ,到实验结束时 ,总糖只消耗了
20%左右 (图 3a)。
图 3　藏红花素合成过程中糖的消耗
图 4　藏红花素合成过程中氮的消耗
2. 4　氮的消耗
图 4是培养液中氮的消耗曲线。 可以明显看到
摇瓶培养在细胞较快增殖的前 4 d, 培养液中的氮
浓度下降较快 ,表明细胞增殖需要较多的氮源。此后
由于细胞几乎停止生长 ,培养液中的氨态氮含量
(cN )有所回升 ,其结果与其他细胞培养研究非常相
似 [15 ]。第 6 d以后 ,细胞开始合成藏红花素 ,因此培
养液中的氮源又有被利用的趋势。在生物反应器中 ,
前 6 d培养液中的氮呈线性下降 ,其变化趋势与摇
瓶培养基本相同。到试验结束时 ,摇瓶培养的总氮被
消耗了 30%左右。 生物反应器的氮源被消耗了
40% 。第 8d以后两者细胞均接近停止生长 ,所消耗
的氮源主要用于次生代谢 ,其中一部分用于藏红花
素的合成。
2. 5　磷的消耗
从图 5可以看到 ,在生物反应器和摇瓶培养的
前 2 d, 培养液中的磷的浓度 (cP )均快速降低 ,其中
生物反应器培养大约消耗了 60% , 这可能是由于在
增殖培养后期 ,愈伤组织基本处于“饥饿”状态 ,进入
新的培养环境后 ,细胞便快速吸收培养液中的磷 ,以
供细胞增殖之用。此后生物反应器培养的磷消耗趋
于缓和 ,即使在藏红花素合成阶段也没有发生快速
吸收现象 ,摇瓶培养也表现出相同趋势。因此可以说
明愈伤组织细胞可以贮藏磷以备后期生长和生物合
成之用。在实验结束时 ,生物反应器培养的磷被消耗
了 75% , 而摇瓶培养大约消耗了 50% 。
图 5　藏红花素合成过程中磷的消耗
3　结　论
总结以上实验结果 ,虽然在前 10 d反应器的生
物量积累远远大于摇瓶 ,但是其总量只增加了
70% 。而在此期间 ,藏红花素开始缓慢合成 ,当细胞
进入衰亡期以后 ,藏红花素的合成速度加快。从营养
物质的消耗来看 ,在细胞增殖阶段消耗较快 ,进入藏
红花素快速合成期后 ,消耗速度减慢。说明营养物质
主要用于细胞生长 ,而在藏红花素的合成阶段需要
量不大。 由于藏红花细胞在悬浮培养过程中的增长
速度缓慢 ,而在固体培养基中增殖速度较快 ,所以利
用固液两步培养法将藏红花的愈伤组织直接接种在
液体培养基中诱导合成藏红花素的方法可以有效解
决藏红花素合成和细胞增殖的相互矛盾 ,并且可以
在短时间内达到促进合成藏红花素的目的。
1611郭志刚 , 等: 　固液两步法的藏红花素生物合成
参考文献　 (References )
[1 ] Jag adeeswaran R, Thi runav ukkarasu C, Gunasekaran P, et
al. In vit ro s tudies on the selectiv e cyto toxic ef fect of crocetin
and quercetin [ J ]. Fi totera pia, 2000, 71( 4) : 395 399.
[2 ] 郭志刚 , 刘瑞芝 , 刘雪 , 等 . 藏红花的叶鞘培养与藏红花类
物质的合成 [ J ]. 清华大学学报 (自然科学版 ) , 1999,
39( 12): 4 7.
GUO Zhigang, LIU Ruizhi, L IU Xue, et al. Leaf sheath
cul tu re of crocus s ativus L and crocin family biosynthesis
[ J] . J Tsing hua Univ ( Sci and Tech ) , 1999, 39( 12): 4 7.
( in Chinese)
[3 ] LIU Xue, GUO Zhigang, LIU Ruizhi. Ef fect of culture
condit ion, carbon source and reg ulators on saf f ron cal lus
grow th and crocin accumulation in th e cal lus [ J ]. Tsing hua
Scien ce and Technolog y , 2002, 7( 5): 448 453.
[4 ] Tanaka H. , Takayama M. Plan t Cel l Engineering [M ].
Tok yo: Oum Publish ing Company, 1992. ( in Japan ese)
[5 ] 郭志刚 , 都军 , 刘瑞芝 . 紫杉细胞生长过程与营养物质消耗
的动态研究 [ J] .清华大学学报 (自然科学版 ) , 2002, 42( 5):
599 602.
GUO Zhigang , DU Jun , LIU Ruizhi. Kinetic inves tigation of
tax us cell grow th and nu t rient consumption [ J ]. J Tsinghua
Univ ( Sci an d Tech ) , 2002, 42( 5): 599 602. ( in Chines e)
[6 ] 罗文 , 郭志刚 , 刘瑞芝 , 等 . 紫杉醇生物合成与营养物质消
耗的相关性 [ J] . 清华大学学报 (自然科学版 ) , 2002,
42( 12): 1590 1593.
LUO Wen, GUO Zhigang, LIU Ruizhi , et al. Relationsh ip
betw een taxol bios ynth esi s and nu t rient consump tion [ J] . J
Tsin ghua Un iv ( Sci and Tech ) , 2002, 42( 12): 1590 1593.
( in Chines e)
[7 ] 郭志刚 ,刁劲羽 , 刘瑞芝 , 等 . 栝楼毛状根的生长与营养消
耗动态研究 [ J]. 生物技术 , 2001, 11(5): 18 20.
GUO Zhigang, DIAO Jinyu , LIU Ruizh i, et al. Kinetics of
g row th and nut ri ti on depletion in hai ry root s of
t rich osanth esi s ki ri lowii [ J] . Biotechnolog y, 2001, 11( 50):
18 20. ( in Chines e)
(上接第 1596页 )
4　讨　论
总的来说 ,这些模块满足系统的设计要求 ,但有
些方面还需改进:
1)改进光电二极管与前放电路的连接方式 ,以
减小电子学线路引起的串扰。
2)改进光电二极管的性能。例如: 给二极管加
一适当的反向偏压 ,降低环境温度并使其保持相对
的稳定。
3) 由于边缘晶体的漏光及晶体与光电二极管
的粘接工艺问题 ,个别模块出现了边缘通道比中间
通道灵敏度较大程度偏低的现象 ,这需要进一步提
高工艺水平。
下一步的系统设计将采纳以上改进 ,相信探测
器的性能会达到进一步的提升。
参考文献　 (References )
[1 ] Mart z H E, Azevedo S G, Brase J M , et al. Computed
tom og raph y systems and th eir indus t rial application [ J ]. In t
J Radiat Appl Inst rum Par t A , 1990, 41( 10): 943 961.
[2 ] 张朝宗 , 郭志平 , 董宇峰 . 工业 CT的系统结构与性能指标
[ J] . C T理论与应用研究 , 1994, 3( 3): 13 17.
ZHANG Chaozong , GUO Zhiping, DON G Yufeng.
Indus t rial C T system cons tituents and performance [ J] . C T
theory and app licat ion , 1994, 3( 3): 13 17. ( in Chinese)
[3 ] Izumi S, Kamata S, Satoh K, et al. High energ y X-ray
computed tomography for indu st rial applications [ J ]. IE EE
Transact ions on N uclear Science, 1993, 40( 2): 158 161.
[4 ] Kanamori Tak ahi ro, Kamata Sh ouji. Cros s-sectional imaging
of large and dense material s by high en ergy X-ray CT using
linear accelerator [ J] . Jou rnal of N uclea r Science and
Technolog y , 1989, 26( 9): 826 832.
[5 ] 吴沭新 , 钱永庚 ,王经瑾 . 用 Monte-Carlo方法模拟设计工业
CT探测器 [ J ]. 核电子学与探测技术 , 1996, 16( 5): 340
344.
WU Shuxin, QI AN Yonggeng, WANG Jingjin. M onte-Carlo
simul tion for th e array detector of ind us trial com puted
tomography [ J]. N uclea r Electronics & Detection
Technolog y , 1996, 16( 5): 340 344. ( in Chines e)
[6 ] 楼棋 , 李玉兰 ,李元景 , 等 . 用于高能 X射线成像的 CdWO 4
闪烁探测器探测灵敏度的研究 [ J] . 核电子学与探测技术 ,
2002, 22( 4): 331 334.
LO U Qi , LI Yulan, LI Yuanjing, et al. The s tud y on th e
s ensi tivi ty of CdWO4 scinti llating detector for high energy
X-ray imaging s ystem [ J] . N uclear Electronics & Detection
Technolog y , 2002, 22( 4): 331 334. ( in Chines e)
1612 清 华 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2003, 43( 12)