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几种因素对生物反应器培养东北刺人参不定根中皂苷积累的影响



全 文 :林业工程学报,2016,1(3):68 - 72
Journal of Forestry Engineering
Doi:10. 13360 / j. issn. 2096 - 1359. 2016. 03. 013
收稿日期:2015 - 12 - 01 修回日期:2016 - 03 - 08
基金项目:国家自然科学基金项目(31260182)。
作者简介:姜银姬,女,研究方向为反应器应用与有效物质的调控。通信作者:廉美兰,女,教授。E-mail:mllian@ ybu. edu. cn
几种因素对生物反应器培养东北刺人参
不定根中皂苷积累的影响
姜银姬,朴炫春,李贺,王洪秋,廉美兰*
(延边大学,长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室,吉林 延吉 133002 )
摘 要:为了优化东北刺人参不定根反应器培养体系,获得较高的人参皂苷含量,以东北刺人参无菌苗诱导得到
的不定根为试验材料,研究生物反应器不定根培养过程中,蔗糖浓度、生长素 IBA浓度、接种量和通气量对皂苷
积累的影响。比较 3 种培养方式发现,生物反应器培养比振荡培养和固体培养更有利于不定根中皂苷积累。在
生物反应器培养过程中,随着蔗糖浓度的增加,皂苷含量明显提高,在蔗糖质量浓度为 50 g /L达到最大;IBA 质
量浓度为 3 mg /L时最利于皂苷积累;接种量为 5 g /L时不定根中皂苷含量和生产量最多,而接种量超过 5 g /L
不利于皂苷积累;通气量 75 mL /min时,皂苷含量达到最高。因此,利用生物反应器培养不定根来生产皂苷,为
资源短缺的东北刺人参产品开发提供了新方法,对今后的东北刺人参产品生产具有重要意义。
关键词:生物反应器;不定根;皂苷;东北刺人参
中图分类号:S722. 3 文献标志码:A 文章编号:2096 - 1359(2016)03 - 0068 - 05
Effect of several factors on saponin-accumulation in adventitious roots of
Oplopanax elatus cultured with bioreactor culture
JIANG Yinji,PIAO Xuanchun,LI He,WANG Hongqiu,LIAN Meilan*
(Key Laboratory of Nature Resource of Changbai Mountain and Functional Molecular,Ministry of Education,
Yanbian University,Yanji 133002,Jilin,China)
Abstract:As a perennial woody medicine plant,Oplopanax elatus has high pharmaceutical values. The saponin is the
one of the main effective compounds in O. elatus. However,the production of O. elatus has been restricted by the short-
age of the plant resources. Therefore,the present study used adventitious roots derived from sterilized seedlings as the
experimental materials to mass-production of saponins by adventitious root culture in bioreactor systems. The adventitious
root growth and saponin content among the different culture systems (bioreactor culture,shake culture,and solid cul-
ture)were compared. The results showed that the bioreactor culture was more beneficial for adventitious root biomass
(fresh and dry weight)and saponin accumulation. During the bioreactor culture,sucrose concentrations in the culture
medium crucially affected the adventitious root growth and saponin accumulation,and the maximum saponin content of
adventitious roots were found at 50 g /L sucrose. IBA concentrations also had an obvious effect on the adventious root
culture in bioreactors,and 3 mg /L IBA was the most favorable concentration. In addition,the inoculation density of 5
g / L promoted the adventitious root growth and saponin accumulation,while the densities more than 5 g /L had the inhibi-
tory effect. The effect of air volume was also significant,and the maximum adventitious root biomass and saponin content
were found at 75 mL /min air volume,while the air volume higher or lower than 75 mL /min restricted adventitious root
growth and saponin accumulation. Consequently,the saponin-production of the O. elatus via adventitious root culture u-
sing bioreactor systems was feasible and the massive yields of adventitious root and saponins can be obtained by control-
ling the bioreactor culture conditions. The present study indicated that the bioreactor culture of adventitious roots was an
alternative approach to pave the way for the industrial production of O. elatus products.
Key words:bioreactor;adventitious roots;saponin;Oplopanax elatus
东北刺人参(Oplopanax elatus)又名刺参,属五
加科刺人参属,多年生落叶灌木,为国家二级保护
植物,是一种稀有濒危的珍贵药用植物,主要分布
于我国吉林省长白山区、俄罗斯远东地区和朝鲜北
第 3 期 姜银姬,等:几种因素对生物反应器培养东北刺人参不定根中皂苷积累的影响
部山区等[1]。东北刺人参对精神分裂、神经衰弱、
低血糖、糖尿病等疾病有疗效,并具有抗真菌、抗氧
化、抗炎、抗癌等作用,且没有任何毒副作用,在长
白山区被称作“木本人参”。研究表明,东北刺人
参的化学成分十分复杂,有效成分主要包括皂苷
类、蒽醌类、挥发油、多糖、黄酮、总酚、不饱和脂肪
酸和微量元素等[2]。其中,皂苷具有增强免疫力、
抗肿瘤、抑制癌细胞的转移等效果[3]。
东北刺人参具有极高的药用价值,但由于野生
东北刺人参的生态环境遭到破坏,更有人为的过度
采挖导致野生资源逐年匮乏,而传统的人工栽培方
式也受地域和季节的影响,结实率和移植成活率
低,所以原材料极度短缺,进而产品开发也随之受
到限制。因此,寻找一种新的方法大量生产东北刺
人参以满足社会需求已迫在眉睫[4]。目前,植物
细胞培养工程已被广泛地应用在次生代谢物的生
产上,其中生物反应器的应用可实现植物细胞、组
织或器官的大量生产,并能快速获得目标产物。生
物反应器具有生产规模大、周年生产、不受季节及
区域性影响、自动化程度高、生产成本低等优点,能
为植物提供优化的物理和化学环境,使反应器内的
培养物能更好地生长。于晓坤等[5]通过在生物反
应器中培养贯叶连翘不定根的方式获得金丝桃素;
Seo等[6]发现生物反应器培养的刺五加不定根中
刺五加苷含量高于人工栽培 3 年根中的含量。对
于东北刺人参,虽然于丹等[7]研究了生物反应器
内影响东北刺人参不定根培养的因素,但并未对不
定根中生物活性物质的积累进行研究。因此,笔者
在比较 3 种培养方法后,利用生物反应器培养东北
刺人参不定根的方式,研究培养基中蔗糖、IBA 浓
度、不定根的接种量和反应器的通气量对皂苷积累
的影响,旨在为东北刺人参的产品开发提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
将东北刺人参层积处理的种子进行常规消毒
后接种于 MS培养基中,待无菌种子发芽并长出根
后,将根切成约 1cm 长,接种到不定根诱导培养基
[MS + IBA(吲哚丁酸)5 mg /L +蔗糖 30 mg /L +倍
力凝 8 g /L,pH 5. 8]中进一步增殖培养,培养条件
为(25 ± 2)℃,暗培养。40 d 后,将增殖的不定根
切成约 1 cm大小,作为试验材料。
1. 2 试验方法
试验研究了生物反应器、振荡培养和固体培养
等 3 种条件下不定根中皂苷的积累。生物反应器
培养:将 5 g /L(鲜质量)的不定根接种到含有 4 L
培养基 5 L气球型气升式生物反应器中,培养基为
MS + IBA 5 mg /L +蔗糖 30 mg /L(pH 5. 8),通气
量为 100 mL /min。振荡培养:将鲜质量为 0. 5 g的
不定根接种于含有 50 mL 培养基的 250 mL三角瓶
中,培养基与生物反应器培养相同,在 100 r /min
的振荡器上进行培养。固体培养基培养:将 9 个
(约 99. 2 mg)东北刺人参不定根外植体接种于含
有 50 mL 培养基的培养皿(Φ × h = 9. 5 cm × 1. 5
cm)中,培养基为 MS + IBA 5 mg /L +蔗糖 30 mg /
L +倍力凝 8 g /L(pH 5. 8)。
分析影响生物反应器培养不定根中皂苷积累
的因素:蔗糖浓度、IBA浓度、接种量及通气量。蔗
糖浓度试验:在 5 L反应器内加入 4 L含不同浓度
蔗糖(30,40,50 和 60 g /L)的 MS 培养基,培养基
其他成分为 IBA 5 mg /L,pH 调节为 5. 8。在每个
生物反应器接种 5 g /L 不定根,通气量调节为 100
mL /min。IBA浓度试验:在 MS +蔗糖 50 g /L中加
入不同浓度的 IBA(2,3,4 和 5 mg /L),接种量为
5 g /L,生物反应器中通入 100 mL /min 的气体。接
种量试验:生物反应器中分别接种 5,10 和 15 g /L
的不定根,并通入 100 mL /min 的气体。培养基为
MS + IBA 3 mg /L +蔗糖 50 g /L。通气量试验:将
通气量分别设为 50,75 和 100 mL /min,每个生物
反应器接种 5 g /L 不定根,培养基与接种量试验
相同。
1. 3 不定根生物量测定和增殖系数换算
不定根培养 40 d 后收获,并用流动的水冲洗
后,除去表面水分后称质量,记录鲜质量。然后放
入 55 ℃烘干箱中烘干,2 d后待不定根完全烘干后
称干质量(DW)。不定根增殖系数 =(收获时鲜质
量 -接种时鲜质量)/接种时鲜质量。
1. 4 皂苷测定方法
皂苷的提取:称取东北刺人参不定根干燥粉末
1 g,加入 25 mL的 80%甲醇在 80 ℃条件下浸提 2
次,每次 2 h。过滤后合并滤液,在 50 ℃下减压浓
缩至 5 mL左右膏状物,加水定容至 25 mL。加入
乙醚脱脂,再用正丁醇和蒸馏水 1∶ 1(V∶ V)混合得
到的水饱和正丁醇萃取 3 次,合并提取液,在 60 ℃
下浓缩至膏状物,用甲醇定容至 10 mL,过滤后即
得待测样品。
皂苷的测定:采用硫酸 -香草醛显色法(按照
GBIT 18765—2008),取待测样品 10 μL,加入 8%
香草醛溶液 0. 5 mL 和 72%硫酸溶液 5 mL 并摇
匀,置于 60 ℃恒温水浴上加热 10 min 后,冰水冷
96
林 业 工 程 学 报 第 1 卷
却 10 min,摇匀。人参单体皂苷 Re为标准品,利用
紫外可见分光光度计(UV110,上海天美科学仪器
有限公司)在 544 nm 处测定吸光值,每个样品重
复测定 3 次,取平均值,绘制标准曲线,采用插入法
计算皂苷含量。皂苷生产量(mg /L)=不定根干质
量(g /L)%皂苷含量(mg /g,DW)。
1. 5 培养条件及数据分析
不定根培养温度为(25&2)℃,进行暗培养。
固体培养和振荡培养设置 5 次重复,反应器培养重
复 3 次。利用 SPSS 11. 5 软件,采用邓肯氏新复极
差法进行分析(显著水平 P < 0. 05)。
2 结果与分析
2. 1 培养方法对不定根中皂苷积累的影响
不同培养方法对东北刺人参不定根生物量和
皂苷积累影响不同,结果见表 1。由表 1 知,振荡
培养和生物反应器培养中不定根的生长及皂苷积
累明显好于固体培养,通过反应器培养的不定根中
皂苷含量和生产量分别为固体培养的 1. 3 倍和 5
倍。液体培养基有利于不定根生长及有效物质积
累,可能是因为不定根在液体培养中能充分地接
触、吸收养分,使得不定根的增殖和活性物质的积
累得到促进[8]。同样是液体培养,本研究中所用
生物反应器容量(5 L)远大于振荡培养(250 mL),
所以具有实现大量生产不定根的优势,对进一步规
模化生产有指导意义。
表 1 培养方法对不定根增殖和皂苷积累的影响
Tab. 1 Adventitious root growth coefficient and saponin
accumulation in different culture systems
培养方法 增殖系数
皂苷含量
/(mg·g - 1)
皂苷生产量 /
(mg·L -1)
反应器培养 14. 6 a 13. 7 a 102. 9 a
振荡培养 14. 5 a 13. 9 a 100. 2 a
固体培养 2. 9 b 10. 5 b 20. 0 b
注:同列数据后的不同小写字母表示 0. 05 水平差异显著。下同。
2. 2 几种调控因子对生物反应器培养不定根中皂
苷积累的影响
2. 2. 1 蔗糖浓度对不定根中皂苷积累的影响
为了研究蔗糖浓度对东北刺人参不定根中皂
苷含量的影响,将蔗糖质量浓度设为 30,40,50 和
60 g /L进行不定根培养,试验结果见表 2。从表 2
中可以得出,蔗糖质量浓度为 30 ~ 50 g /L 时增殖
系数、皂苷含量和生产量随蔗糖浓度的增加而提
高,蔗糖质量浓度高于 50 g /L 时,皂苷含量无明显
下降,但因不定根增殖受到明显抑制,导致皂苷生
产量下降。糖是植物组织培养中的碳源,有助于细
胞生长和新陈代谢[9],并可以调节渗透压,有助于
生物活性物质的积累[10]。Yin 等[11]研究表明,蔗
糖浓度为 40 g /L时最适合太子参不定根生长以及
皂苷和多糖的积累;姚睿[12]研究发现,蔗糖质量浓
度为 30 g /L时,铁皮石斛原球茎的生物量和生物
活性物质达到最大值;本试验结果显示,蔗糖质量
浓度为 50 g /L时有利于东北刺人参不定根的增殖
与皂苷的积累。综上所述,不同植物或不同培养物
在生长过程中对糖浓度的要求有所不同。
表 2 培养基中蔗糖浓度对生物反应器培养
不定根增殖和皂苷积累的影响
Tab. 2 Effect of sucrose concentration on adventitious
root growth coefficient and saponin accumulation
during bioreactor culture
蔗糖浓度
/(g·L -1) 增殖系数
皂苷含量
/(mg·g - 1)
皂苷生产量
/(mg·L -1)
30 16. 5 c 12. 7 c 103. 8 d
40 18. 4 b 19. 6 b 203. 2 c
50 21. 6 a 24. 4 a 307. 9 a
60 12. 5 d 23. 2 a 236. 3 b
2. 2. 2 IBA浓度对不定根中皂苷积累的影响
植物生长素对不定根生物量和物质积累起着
至关重要的作用,因此在不定根培养时需在培养基
中加入适宜的生长素(如 IBA)。本试验通过设置
4 种不同浓度的吲哚丁酸(IBA),来探明东北刺人
参不定根在反应器培养过程中生长素 IBA 的效
果。从表 3 可见,当 IBA 质量浓度从 2 mg /L 增加
到 3 mg /L时,不定根的增殖和皂苷的积累量也随
之增加。当 IBA质量浓度为 3 mg /L 时,增殖系数
(21. 9),皂苷含量(19. 2 mg /g)和生产量(243. 3
mg /L)也达到最大值。但当 IBA浓度继续增加,不
定根生长和皂苷积累均受到明显抑制。IBA 被广
泛应用于植物组织培养过程中[13],作为生长素能
影响植物细胞分化、发育和形态发生,而且比萘乙
酸和吲哚乙酸稳定[14]。不同的植物进行不定根
培养时,对IBA浓度的要求也有不同,李慧娟等[15]
表 3 培养基中 IBA浓度对生物反应器培养
不定根增殖和皂苷积累的影响
Tab. 3 Effect of IBA concentration on adventitious root
growth coefficient and saponin accumulation
during bioreactor culture
IBA浓度
(mg·L -1) 增殖系数
皂苷含量
/(mg·g - 1)
皂苷生产量
/(mg·L -1)
2 10. 9 d 12. 1 b 91. 6 d
3 21. 9 a 19. 2 a 243. 3 a
4 19. 4 b 12. 7 b 141. 4 b
5 15. 4 c 12. 8 b 122. 7 c
07
第 3 期 姜银姬,等:几种因素对生物反应器培养东北刺人参不定根中皂苷积累的影响
研究发现 5 mg /L的 IBA对西洋参不定根组织的增
殖效果最好;Rajesh 等[16]认为 IBA 质量浓度为 3
mg /L有利于桃儿七不定根的生物量和足叶草毒素
的积累,这与本试验结果相一致。
2. 2. 3 接种量对不定根中皂苷积累的影响
本研究将接种量分别设置为 5,10 和 15 g /L
进行试验,发现接种 10 d 后不定根生物量开始增
加,20 d后所有反应器内的不定根均浮于液面上,
生物量显著增加。培养 40 d后,接种量为 5 g /L的
不定根的皂苷积累显著高于其他接种量处理(表
4)。接种量超过 5 g /L的不定根颜色发暗,生长状
态不良,皂苷含量也明显下降。在植物组织培养
中,接种量与培养基的体积比对培养物的增殖和生
物活性物质的积累有直接的影响。接种量过多会
导致培养基中营养物质消费过快,培养物过早衰
老,抑制生物活性物质的积累;而接种量过低会使
培养周期过长,加大培养成本[17]。植物种类不同,
对适宜接种量的要求也存在很大的差异,高山红景
天愈伤组织的最佳接种量是 10 g /L[18],而悬浮培
养玫瑰茄细胞却在 4 g /L 以下[19]。所以,筛选出
适合的接种量非常重要,本试验结果表明,在 5 L
气升式生物反应器内不定根接种量为 5 g /L 时有
助于皂苷的积累。
表 4 接种量对生物反应器培养不定根增殖和
皂苷积累的影响
Tab. 4 Effect of inoculation density on adventitious root
growth coefficient and saponin accumulation
during bioreactor culture
接种量
/(g·L -1) 增殖系数
皂苷含量
/(mg·g - 1)
皂苷生产量
/(mg·L -1)
5 19. 5 a 16. 3 a 215. 3 a
10 9. 3 b 13. 8 b 160. 3 b
15 7. 5 c 11. 1 c 86. 6 c
2. 2. 4 通气量对不定根中皂苷积累的影响
东北刺人参不定根增殖生长和皂苷的积累受
通气量影响很大,从表 5 可见,当通气量为 75 mL /
min 时增殖系数高且皂苷生产量达到最大,为
241. 9 mg /L,而皂苷含量最大值出现在通气量为
50 mL /min 时。并且,由图 1 知,当通气量为 75
mL /min时,不定根生长健壮,颜色鲜亮,长满反应
器。生物反应器中通入空气,不仅能够维持培养基
中的氧气浓度,而且对植物的生长以及其代谢产物
都起到作用[20]。但过低的通气量不能使培养物和
培养基充分混合,而过高的通气量又会抑制生物量
的积累[21]。金美玉[22]对葡萄茎段进行试验,结果
表明,在通入 150 mL /min通气量的条件下,茎段生
长旺盛;在通气量为 100 mL /min时,有助于贯叶连
翘不定根的增殖和金丝桃素的积累[5]。
表 5 通气量对生物反应器培养不定根增殖和
皂苷积累的影响
Tab. 5 Effect of air volume on adventitious root growth
coefficient and saponin accumulation
during bioreactor culture
通气
/(mL·min -1) 增殖系数
皂苷含量
/(mg·g - 1)
皂苷生产量
/(mg·L -1)
50 17. 6 c 19. 3 a 223. 9 b
75 19. 2 a 17. 1 b 241. 9 a
100 18. 5 b 17. 2 b 210. 7 c
图 1 不同通气量条件下的生物反应器培养的
不定根生物量
Fig. 1 Adventitious root biomass at different air
volumes during bioreactor culture
3 结 论
利用生物反应器可大量培养不定根生产东北
刺人参皂苷。在反应器培养过程中,50 g /L 的蔗
糖和 3 mg /L的 IBA适合不定根生长和皂苷含量的
积累;在生物反应器中不定根的接种量为 5 g /L,最
有利于皂苷的积累,皂苷含量分别为 10 g /L,15 g /L
接种量的 1. 4 倍和 2. 4 倍;除此之外,过高的通气
量使不定根受气体胁迫而生长不良,导致生物量明
显下降,因此,通气量为 75 mL /min 时最有利于东
北刺人参不定根生长和皂苷积累。
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(责任编辑 梁辉 葛华忠)
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