全 文 ：植物学通报 2004, 21 (5): 565~577
Chinese Bulletin of Botany
①教育部重点课题资助项目(02093)。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: yaguangzhan@126.com
收稿日期：2003-11-25 接受日期：2004-01-12 责任编辑：白羽红
转基因植物中外源基因的整合
特性及其研究策略①
曾凡锁 詹亚光②
(东北林业大学生命科学学院 哈尔滨 150040)
摘要 综述了外源基因在宿主中的整合特性及结构变化的多样性。将外源基因在宿主中的整合方式分
为3种：单拷贝单位点整合、串联多联体单位点整合及单拷贝或多拷贝在多位点整合。分析了不同整合
方式对表达的影响。详细讨论了植物转基因的整合机制，阐述了以基因组的双链断裂修复为基础的整合
模型。最后介绍了国内外的研究者对不同的整合方式所采取的研究策略。
关键词 转基因植物，整合，表达，外源基因
Integration of Exogenous Genes in Transgenic Plant Genomes:
Characteristics and Approaches
ZENG Fan-Suo ZHAN Ya-Guang②
(College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040)
Abstract The integration of exogenous genes in transgenic plant genome are reviewed. Three
integration patterns of exogenous genes included single-copy integration in one site, multiple-copy
integration in one site and single-copy or multiple-copy integration in multiple sites. This review also
analyses the influence of different integration patterns on the expression of exogenous genes, and
discusses the mechanism of integration and the T-DNA integration model based on genomic DSB
(double-strand breaks). In the end, the approaches studying different pattern of integration are
introduced.
Key words Transgenic plant, Integration, Expression, Exogenous genes
1984年首次利用农杆菌Ti质粒将外源基因导入烟草(Nicotiana tabacum)获得成功(Herrera-
Esfrella et al.,1984) 。在随后的数年时间里，植物基因工程研究取得了突破性的进展，已在
许多物种上获得了转基因植株。植物遗传转化技术在基础研究和应用研究中的价值得到了很大
的体现，尤其在应用研究上植物遗传转化技术具有超越了种间隔离的优点，吸引了广大分子
育种学家投入到这方面的研究中来(华志华和黄大年,1999)。但转基因植物能否广泛应用，其关
键在于所转基因能否在遗传转化体内稳定整合和表达(华志华和黄大年, 1999; Kumar and Fladung,
专 题 介 绍
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2000)。然而转基因的不同整合方式，不但影响外源基因在转基因植株中的表达性能，而且还
有可能对宿主基因组中的固有基因的表达产生影响。Fladung(1999)认为转基因植物中外源基因
的表达稳定性取决于目的基因在宿主中的整合特性及其旁侧序列性质。
因此，尽可能了解外源基因的整合机制及如何影响其表达和遗传稳定性是必要的。不同
的转基因植株的整合方式有较大区别, 不同的研究者所采用的研究策略亦有所区别。本文综述
并分析了外源基因在转基因植物中的整合方式、机制及所应用的研究策略。
1 外源基因在转基因植物中的整合方式及结构变化的多样性
外源基因是以质粒为载体通过同源重组或非同源重组随机整合到受体染色体DNA上。现
在普遍认为在转基因的宿主染色体内整合位点是随机的，外源DNA可以插入到植物基因组的
任何一条染色体的任何位点上，但往往对转录活跃的区域具有优先插入的特性(王关林和方宏筠,
2002)。尽管外源基因在宿主染色体中的整合有其不确定性，但许多研究表明外源基因在宿主
基因组中的整合有如下几种方式。
1.1 单拷贝单位点整合
一般情况下，外源基因是以单拷贝单位点整合(王关林和方宏筠, 2002)。这种整合方式是
最简单最易于分析的整合方式存在于许多转化事件中(Pawlowski and Somers,1995; Fladung,1999;
O’Kennedy et al., 2001)。但是单位点的单拷贝插入并非都是完整的单拷贝插入。在多数情况
下T-DNA及其边界序列都有修饰发生。Forsbach(2003)在整合有单拷贝T-DNA的转基因拟南芥
(Arabidopsis thaliana)的系统研究中发现在多数情况下单拷贝T-DNA插入伴随有基因组的重排
发生，例如,目的位点序列的删除或复制、T-DNA序列的部分删除或复制以及染色体上的变化
(如易位及倒位的发生)等。Fladung(1999)在研究转基因山杨(Populus tremula)的目的基因的旁侧
序列和 T-DNA的结构时，发现单拷贝单位点整合的 3个株系 Esch:#3、#5、#16的 T-DNA的
结构有相似的变化，即左边界只有缺失2~4 bp而右边界几乎全部缺失。但进一步研究发现, 这
种修饰作用对目的基因的表达并无影响(Fladung ,1999; Kumar and Fladung ,2000)。
1.2 串联多联体单位点整合
在同一位点有较多的拷贝串联整合的现象是普遍存在的。通过农杆菌介导转化和基因枪转
化得到的多拷贝单位点整合的转基因植株已有许多报道(王守才等,1999; Fladung,1999; Kumar and
Fladung,2000; O’Kennedy,2001)。这样整合的DNA有两种存在方式。 (1)转化过程中转化的质粒
DNA以完整的多拷贝串联的形式整合到宿主染色体基因组上。其形式主要有顺向重复和反向重
复两种。其中反向重复又有头对头式串联和尾对尾式串联两种。关于这种整合方式已有许多
报道(王守才等,1999;Chareonpornwattana et al., 1999; Fladung, 1999; Kohli et al.,1999; Cervera et al.,
2000; Kumar and Fladung ,2000; 2001)，其中,Cervera等(2000)在研究转基因柑橘(Citrus sinensis)
的基因表达和表型稳定性时发现至少有35％的多拷贝T-DNA在同一位点发生了重排。Kumar
(2000)在研究转基因山杨中, 外源基因重复的分子特征时发现有10个株系为完整的T-DNA直接
重复整合在宿主基因组中，有一株表现为 T-DNA头对头式串联的整合方式。(2)另外一种也是
串联的多联体整合方式,只是这种整合方式中一般只有一个或几个完整的质粒DNA整合到受体染
色体基因组上，而一端或两端连有不完整的质粒DNA。同样这种截短的DNA片段也有顺向
的重复和反向的重复两种。如在 Fladung(1999)的转基因山杨中发现有一不稳定的转基因株系
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Esch5#1，进一步分析表明，其完整的 T-DNA片段左侧连接有 1 050 bp的反向重复片段。
O’Kennedy (2001)研究由基因枪法获得的转基因植株的整合方式时，由Southern杂交和PCR分
析表明，在一个完整的 pAHC25单个拷贝的上游整合有一个只有目的基因的反向重复片段
DNA。Dominguez(2000)在研究能表达病毒抗性蛋白的转基因柑橘时指出，有70％的转基因植
株在单个位点上有相互连接的T-DNA，其中一半有左边界去除的截短的T-DNA存在。这种整
合方式在许多转基因的研究中都有报道(Fladung,1999;Kumar and Fladung,2000; 2001; O’Kennedy
et al.,2001)。同时有一些研究表明, 在T-DNA重排形成串联多联体时，常有未知序列插入到了
连接处使其结构发生改变(Fladung,1999; Kohli et al.,1999; Kumar and Fladung,2000)。如前文介
绍的Fladung(1999)发现的 1 050 bp的截短的反向重复T-DNA片段的连接处就有 13 bp的填充
DNA。Kumar(2000)在研究T-DNA在转基因山杨中的整合方式时，发现有8个转基因植株中的
T-DNA重排过程中在连接处有填充DNA且并不相同，其序列长度为 4~300 bp。Gheysen等
(1991)也报道了在T-DNA与植物靶DNA的连接处或是左边或是右边常有填充DNA存在。
1.3 单拷贝或多拷贝在多位点整合
这种整合方式比较复杂, 不易于分析，有报道(Akama et al.,1992; DU et al., 1994; Yang et al.,
1998; Vaira et al.,2000; O’Kennedy et al.,2001)表明，在农杆菌介导和基因枪转化法所获得的转基
因植株中都发现了这种整合方式。Akama等(1992)在用农杆菌转化拟南芥时发现有10％的转基
因植株为多拷贝多位点插入。DU等(1994)在苜蓿(Medicago sativa)转化研究中发现，NPTⅡ
基因的拷贝数可多至30~50个整合在苜蓿基因组的1~4个插入位点上。这种整合方式可能更多
地存在于基因枪转化法所获得的转基因植株中。O’Kennedy等(2001)用基因枪法转化优质白玉
米(Zea mays)时没有获得单拷贝数的转基因植株，也有研究者用基因枪转化玉米时目的基因的
拷贝数最多达50个整合在宿主基因组中(Register et al.,1994;Wan et al.,1995)。
2 不同的整合方式对外源基因表达的影响
外源DNA插入植物基因组中可能导致宿主基因组结构的变化，这种变化必将对宿主基因
和外源基因的表达产生影响(Kumar and Fladung,2001)。因此对于转基因植物尤其是生长周期较
长的树木来说，外源基因能否稳定地整合和表达是至关重要的(Fladung,1999)。但转基因植株
中外源基因的表达要受到很多因素的影响(Cervera et al.,2000)，根据已有的报道与整合方式有
关的影响因素如下：(1)转基因整合的位点数(拷贝数)(Hobbs et al.,1990; Matzke et al.,1994; Elmayan
and Vaucheret,1996; Jorgensen et al.,1996); (2)插入位点的基因组成, 即位置效应(Peach and Velten,
1991; Iglesias et al.,1997); (3)已经整合的T-DNA的构型的改变(Hobbs et al.,1993; Stam et al.,1997)。
2.1 转基因的位点数(拷贝数)对表达的影响
有研究(Yang et al.,1998; Alvarez et al.,2000; Cervera et al.,2000)表明, 高拷贝的T-DNA插入到
同一或不同位点常导致转基因沉默。Cervera等(2000)在研究转基因柑橘时发现GUS表达水平与
其基因(UIDA)的拷贝数存在明显的负相关。Yang等(1998) 在研究所获得的转基因花生(Arachis
hypogaea)植株中的核壳体蛋白的整合与表达时发现, 目的基因在宿主中的高拷贝导致了基因沉
默。Hobbs等(1990)研究表明, 在有多拷贝GUS基因的烟草中GUS表达量明显低于单拷贝插入
整合的烟草中GUS表达水平。Linn等(1990)报道在转玉米可凝性球蛋白A1基因的矮牵牛(Petunia
hybrida)植株中单拷贝整合的转基因植株通常表现整齐一致，且可以预测外源基因的表达，然
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而有多拷贝整合的转基因植株的启动子区通常会甲基化且外源基因不能表达。Rathore等(1993)
和Kumpatla等(1997)的研究也表明在水稻(Oryza sativa)中的目的基因只有在多拷贝时才沉默，
而在拷贝数相对较低的转基因植株中不沉默。支持目的基因在宿主中的高拷贝导致了基因沉默
的观点的研究还有很多(Flavell,1994; Meyer,1996; Lakshminarayan et al.,2000)。但也有一些研究
结果与此观点相反。Vander等(1990)报道，在转基因的矮牵牛植株中具单拷贝的外源基因沉默
发生的频率较高。Dominguze等(2000)在研究转基因的柑橘时发现，所有的转基因品系无论其
GUS基因(UIDA)的拷贝数多少，其GUS表达活性均相似。进一步研究表明其目的基因 CTV-
CP的表达与其拷贝数也无关系。华志华等(2001)在研究基因枪转化获得的转基因水稻中外源基
因整合与表达时发现，转基因拷贝数的多少与其表达和沉默不存在必然联系。这与Lakshmin-
arayan 等(2000)的研究结果相同。
2.2 插入位点的基因组成或位置效应
宿主基因组的遗传学组成在转基因整合和表达中发挥着重要的作用(Kumar and Fladung,
2001)。而且外源基因的插入位点的性质及旁侧序列均能影响外源基因的活性，即所谓的位置
效应(Peach and Velton,1991; Fladung,1999)。Leeuwen等(2001)认为在不同转化体间外源基因的
定量表达差异通常归因于转基因的不同整合位点。Meyer等(1992)和Walter等(1992) 都报道了
转基因插入位点的旁侧DNA序列可以影响外源基因的表达水平。Iglesias等(1997)在烟草上的
实验表明，稳定表达的转基因植株中外源基因常整合在宿主染色体的端粒附近与核基质结合，
而不能稳定表达的转基因植株中外源基因常常整合到异染色质区和中间区域或高度重复序列。
也有研究认为外源基因的沉默与整合位点的遗传学组成有关(Kumar and Fladung,2001 )。Hilder
等(1989)认为外源基因的沉默多是由于插入位点附近染色体的微环境影响了外源基因的启动子的
表达活性所致。另外，从遗传学角度看，如果外源基因整合在一个有高度转座活性的区域可
能导致外源基因的丢失(Fladung,1999)。
2.3 已经整合的 T-DNA的构型的改变
有研究表明，在转基因植株中的反向重复的T-DNA与外源基因的沉默有直接关系(Stam et
al.,1997; Stam et al.,1998; Dominguez et al.,2000)。由于外源基因的重复或重排而引起的沉默在
许多农作物和树木的研究中已有报道(Flavell,1994; Fladung,1999; Kohli et al.,1999; Kooter et al.,
1999)。Fladung(1999)在研究转基因山杨的稳定性时也发现，有一个完整的单拷贝植株且旁侧
序列为宿主DNA时可以稳定表达。但如果其外源基因连接有一段截短的反向T-DNA序列时则
该转化体的外源基因不能稳定表达或在培养过程中外源基因丢失。Kumar等(2000; 2001)也认为
外源基因以完整或不完整的直接或反向重复均能导致外源基因在杂种山杨中的表达沉默。但是
O’Kennedy等(2001)在对转基因优质玉米的研究中得出的结论是：完整的T-DNA连接有一个
无功能的靶基因时可以正常表达。Dominguez等(2002)在研究沉默与非沉默的柑橘转化体时发现
T-DNA的直接重复、反向重复甚至单拷贝整合均可诱发外源基因沉默，所以不能简单认为
T-DNA的直接或反向重复诱发了基因沉默。
3 外源基因的整合机制
目前，有许多研究报道了外源基因在宿主中的整合与重排机制(Gheysen et al. ,1991;
Mayerhofer et al., 1991; Tinland et al., 1994; 徐明良等，1996; Tinland, 1996; Kumar and Fladung,
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2000; 2002)。针对于农杆菌介导的T-DNA整合机制主要可分为两类。在第一类整合机制中认
为T-DNA5端连接的VirD2蛋白起主要作用(Zupan et al.,1996; Zupan et al.,2000)。在这种机制
下T-DNA两端的作用机制不同。T-DNA的右边界和植物基因组的目的位点只有一个或没有碱
基配对，然而 T-DNA的左边界和预整合位点(pre-insertion site)间有较长的相似片段存在。
T-DNA整合的发生是通过VirD2蛋白将T-DNA 5端与基因组序列相连(Tinland,1996)。然而一
些研究表明，VirD2蛋白不能拥有连接酶的活性(Kohli et al., 1998; Ziemienowicz et al.,2000)。与
第一类不同，在第二类整合机制中不强调VirD2蛋白的作用。只是由于T-DNA的右边界与预
整合位点的序列具有较高的同源性并且右边界被部分截短(Matsumoto et al.,1990; Mayerhofer et
al.,1991)。有研究者认为这类整合机制通过双链断裂(double-strand breaks, DSB)修复机制完成
(Salomon and Puchta,1998)。Kumar和Fladung(2002)研究转基因山杨的整合位点的结构和T-DNA
的特点时综合了这两类机制提出了以基因组的双链断裂修复为基础的整合模型。这个模型可分
为两个部分：(a) 经过修改的 SDSA(synthesis-dependent strand-annealing)整合模型; (b) 通过
SDSA(synthesis-dependent strand-annealing)途径产生的中途失败的缺口修复模型。其具体过程
如图 1(b)所示。
由图1可以看出在第二部分过程中由T-DNA的左边界复制形成的填充DNA就插入到了T-
图 1 T-DNA的整合模型
(a): ⅰ. 植物基因组DNA通过核酸外切酶产生单链 3突出端; ⅱ. 这个 3突出端与 T-DNA的左边界中的
少数几个同源碱基配对并且开始缺口修复过程; ⅲ. 单链 T-DNA为模板进行 T-DNA的合成; ⅳ. 新合成
的序列的 3末端与另一部分的相似序列连接; ⅴ. 单链的缺口修复完成同时 T-DNA的整合完成。(b): ⅰ.
植物基因组DNA通过核酸外切酶产生单链 3突出端; ⅱ. 图中下方的单链自由 3末端与 T-DNA的左边
界末端的较短的相似序列配对并把T-DNA作为模板开始缺口的修复完成; ⅲ. 缺口的修复过程中途失败
停止，并且 T-DNA的左边界重新与上方的单链 3末端结合(T-DNA的左边界已经被复制连接于下方的
单链上——灰色哑铃形); ⅳ ~ⅶ 的这些过程与第一部分中的ⅱ ~ⅴ相同。
Fig.1 Mechanism of T-DNA integration (Kumar et al., 2002)
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DNA的右侧与基因组序列之间。这个模型可以很好地解释T-DNA的整合过程及填充DNA(filler
DNA)的形成。但并不能很好地解释许多研究所报道的多拷贝单位点整合等复杂的整合方式，
也不能解释DNA直接转化中的整合情况。Kohli等(1998)提出的两阶段整合机制，可以解释上
述这些整合方式。这种机制认为外源基因的整合是分两个阶段进行的。第一阶段为预整合阶
段，在这一阶段转化的质粒分子(完整的或不完整的)相互连接形成多联体。这一过程增加了外
源基因重排的可能性。第二阶段为外源基因的整合阶段，在这一阶段中外源基因在宿主染色
体中的整合开始。在这一过程中最初的整合位点被认为是“热点(hot spot)”，它促进了随后
的整合外源基因分子整合在同一位点，并进一步形成了连续的多拷贝单位点整合。这一机制
是由基因枪直接转化水稻的研究中得出的。但也有一些研究认为适合于解释农杆菌介导的 T-
DNA转化的整合机制(De Neve et al., 1997; Dominguez et al., 2000)。
外源基因整合是一个相当复杂的问题。虽然有许多研究报道了不同的模型和机制，但这
些模型只是根据某一物种或某一转化方法的研究提出的，还不能适合所有的整合情况，还有
待于进一步系统地研究。
4 转基因整合方式的研究策略
外源基因整合方式的重要性及其对表达的影响前面已经讨论。那么如何对已经获得的转基
因植株的整合方式进行分析并评价转基因植物的整合特点是至关重要的。目前对于转基因植株
中外源基因的整合方式分析的常用方法主要有如下几种。
4.1 Southern blot 分析
基因组的Southern杂交(Southern,1975)是用于检测外源基因在宿主染色体上整合情况的一种
传统方法。应用Southern杂交分析的关键在于要选择不同的限制性核酸内切酶和不同的基因(目
的基因和选择标记基因等)做探针，二者要相互结合然后对所获得的条带进行分析。
Cervera等(2000)在研究转基因柑橘的基因表达和表型稳定性时应用了Southern杂交分析其
整合方式。T-DNA的结构如图 2所示。
其 p35SGUSINT的T-DNA区在左和右边界分别有单一的酶切位点 EcoRⅠ和DraⅠ。因
此，分别用这两种酶切就会产生含有 T-DNA和植物DNA的片段，然后用UIDA和 NPTⅡ探
针分别杂交就可以揭示其插入位点数和整合情况。基因组DNA再分别用HindⅢ和PstⅠ酶切，
则可分别产生UIDA基因(2.8 kb)和NPTⅡ基因(1.6 kb)。然后将HindⅢ酶切的DNA用UIDA基
因探针杂交，另一个用 NPTⅡ基因探针杂交。则杂交结果显示既有预期的 2.8 kb或 1.6 kb的
条带，也有其他大小的条带出现。Cervera根据这些杂交结果指出 T-DNA在宿主基因组内发
生了重排并有截短的 T-DNA存在。
同理，在有3个基因的T-DNA的整合情况也可用此方法。Doninguze等(2000)在分析CTV-
CP基因的整合情况和 T-DNA的结构时用此方法。其 T-DNA的结构如图 3所示。
植物基因组DNA分别用HindⅢ和DraⅠ酶切，然后依次与 CTV-CP、UIDA和NPTⅡ 3
个探针分别杂交。依据其杂交结果可以看出经HindⅢ酶切后CTV-CP探针杂交后均有一条约
1.8 kb的片段存在，由此说明至少有一个完整的CTV-CP基因存在于所有被检植株中。在CP2、
CP3、CP4、CP6、CP9、CP12和 CP17有附加的分子量大小不同的条带出现，说明 T-DNA
发生了重排。将经HindⅢ酶切后CTV-CP探针杂交过的滤膜处理后，用UIDA和NPTⅡ探针
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分别杂交后这些分子量不同的片段在有一些株系中依然存在，说明这些T-DNA是相互连接的
并有较高频率的多拷贝重复发生。同时经DraⅠ酶切的杂交结果分析可知CTV-CP基因的插入
位点数或拷贝数。
另外对于生长周期较短的植物来说，根据转基因植株子代的分离与连锁分析结果，揭示
转基因亲本的T-DNA的整合及组成情况也是一种有效的方法(Butterfield et al., 2002)。Butterfield
等(2002)将具有病毒抗性和除草剂抗性的转基因甘蔗(Saccharum officinarum)作母本非转基因植株
做父本进行杂交，并用 Southern杂交检测外源基因在子代中的存在情况。Butterfield等(2002)
根据子代遗传分离数据推测在两个转基因株系中的T-DNA均是相互连接插入在基因组中的同一
位点且可能有重排发生。在第三个转基因植株中T-DNA是相互独立地插入在两个位点。进一
步分析表明在这两个位点均发生重排和突变。王守才等(1991)研究转基因在玉米中的遗传分离
与整合特性时也将Southern杂交的结果与子代的遗传分离的结果相结合，推测出有两个转基因
无性系应为 2~3个 T-DNA头尾式串联或紧密连锁的结合。
但是此种方法的应用受限于外源基因能否稳定遗传。虽然许多研究表明转基因在许多转化
体中都能稳定整合、正常表达并呈常见的孟德尔遗传(Fromn et al.,1990; Walter et al.,1992; Spencer
et al., 1992)。但有一些转基因植株由于转基因沉默、损伤或丢失导致了不稳定遗传(Matzke and
Matzke,1995; Richard,1995)。且这种方法需要较长时间和存在较大的误差，故应用较少。
4.2 rpPCR (reverse primer polymerase chain reaction)
Southern杂交并不能清楚地分析转基因的拷贝数。因为当有外源基因重排(如完整的或不完
整的顺向和反向重排等)情况出现时，Southern杂交很难准确分析转基因的整合情况。另一种
图 2 p35SGUSINT的 T-DNA区的结构、酶切位点及探针对应的杂交产物长度
Fig.2 Representation of the p35SGUSINT T-DNA fragment, showing the restriction sites for the enzymes
used, probes and sizes of hybridisation products(Cervera et al., 2000)
图 3 CTV-CP基因的 T-DNA结构、酶切位点及探针对应的杂交产物长度
Fig.3 Schematic representation of pBI121/CTV-CP T-DNA, restriction sites and probes used (Dominguez et
al., 2000)
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比较简便快捷的方法就是rpPCR (Kohli et al., 1998; Fladung,1999; Kumar and Fladung, 2000; 2001)。
这种方法就是利用不同的引物进行配对然后对基因组DNA扩增，根据不同的引物对的扩增情
况及产物的大小可知T-DNA的重复情况是否完整。本文以Kumar等(2001)研究为例介绍如何应
用此方法研究 T-DNA的整合情况。
如图4A为T-DNA的结构图，数字1~6代表不同引物的位置(用于检测T-DNA可能的重复
方式)，箭号代表各引物的方向(5-3), 因此可以利用不同的引物对扩增出不同整合情况的T-DNA
片段。如B为完整的T-DNA的以头对尾形式直接重复。这种情况可以通过5对引物(1+2、1+5、
1+3、2+6和2+4)扩增，用所得的产物片段大小证明其整合情况及重复的T-DNA是否完整。同
理其反向的 T-DNA尾对尾重复可以由 3对引物(2+5、2+3和 5+3)进行扩增，头对头的反向重
复可以由(1+6、1+4和 6+4)进行扩增。由扩增结果可知其 T-DNA是否完整及重复情况。
此种方法与Southern杂交相比其优点就是能比较方便快捷的指出重复单位是否完整(如是完
整的T-DNA还是截短的T-DNA)并能表明这种重复的方向(是顺向重复还是反向重复)。此方法
的不足之处是在有多拷贝整合在不同的染色体上时不能显示作用 (Kumar and Fladung,2000)。
4.3 外源基因旁侧序列的克隆及测定
用以上几种方法可以研究外源基因的整合及重排等情况，但不能揭示插入位点的性质(如碱
基组成)和连接处的填充DNA等情况。Kohli等(1998)提出要想准确了解外源基因整合的拷贝数
和重排情况只能进行详细的分子水平的分析,即对转基因的旁侧序列进行克隆和序列测定。克隆
目的基因的旁侧序列主要有如下几种方法：反向 PCR (inverse PCR)(Fladung,1999; Vaira et al.,
2000; Kumar and Fladung,2001)、温度非对称交互PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-
PCR)(Liu and Whittier,1995;Liu et al., 1995)、 AL-PCR(adaptor ligation PCR)(Zheng et al.,2001)和T-
Linker PCR(T-linker-specific ligation PCR)(Yan et al., 2003)等。这里主要以反向PCR为例说明目
的基因旁侧序列的克隆和测定的重要意义。
反向PCR主要应用于扩增和克隆与已知DNA序列某一个末端相临近的侧翼的未知DNA序
图 4 T-DNA的结构及重复情况
A. 有 rolC目的基因的T-DNA结构图及引物序号左为AMP基因右为NPTⅡ基因; B. T-DNA的头对尾的
顺向重复; C. T-DNA的尾对尾的反向重复
Fig.4 Structure of T-DNA and T-DNA Repeat (Kumar et al., 2001)
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列。这种未知序列没有引物可以利用。对含有已知序列以及侧翼区域的基因组DNA样品用一
种在靶序列中无切点的限制性内切酶消化，酶切片段依靠分子内部连接发生自身环化。然后
用这种自身环化的DNA为模板扩增。用一对与已知序列的两端特异性结合的引物通过两个方
向向夹在中间的未知序列区域扩增。这种方法在许多研究中都有应用(Fladung,1999; Kumar and
Fladung, 2000; 2001)。Flang(1999)通过反向 PCR对T-DNA区和旁侧序列进行克隆和测定。结
果表明在不稳定株系Esch5.35S-rolc#1具有一个复杂的整合位点，由一个完整的T-DNA连有反
向的截短的T-DNA(1 050 bp)，其完整的T-DNA的左边界缺失 8 bp。截短的T-DNA与左边界
相连，且有 13 bp的填充DNA序列。此方法虽有较广泛的应用但也有一定的不足，因为该
技术要求DNA模板的序列复杂度低于109 bp(黄陪堂等,2002)。如果基因组DNA复杂度高于此
则不能获得理想的效果(黄陪堂等,2002)。
总之，为了更完整且详细地研究外源基因的整合方式，常常要把几种方法结合使用以便
获得更真实可靠的结果。
5 结语
外源基因的整合是一个相当复杂的问题。虽然目前人们已研究出许多有效的转化体系可将
外源基因转入受体细胞中，但是转入的外源基因能否整合，整合的位置以及整合的状态等均
难以控制。如前文所述外源基因即便已经整合也并非一定表达。因此采用适当的策略研究植
物转基因的整合特性是必要的。随着植物基因工程技术的发展，许多研究者应用不同的方法
克隆了外源基因的旁侧序列并对外源基因的插入位点及整合机制进行了详细的研究。这些研究
对于设计有效的转化载体和改进基因工程的技术路线是十分重要的。这些工作必将极大地加速
植物基因工程的发展。
参 考 文 献
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