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NO在克隆整合提高异质性UV-B辐射下活血丹抗氧化酶活力中的作用研究



全 文 :分子植物育种,2016年,第 14卷,第 4期,第 1016-1020页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.4, 1016-1020
研究报告
Research Report
NO在克隆整合提高异质性 UV-B辐射下活血丹抗氧化酶活力中的作用
研究
李倩 毛少利 王宇超 李阳 *
陕西省西安植物园,西安, 710061
*通讯作者, dove18@126.com
摘 要 NO参与调控植物的生长发育、衰老、防御反应和植物的抗逆反应等多种生理过程。增强 UV-B辐射
会对植物生长和生理生化过程产生有害效应,异质性 UV-B辐射下抗氧化酶活力增强,但 NO在其中是否发
挥作用仍不清楚。本研究以克隆植物活血丹为材料,通过模拟同质和异质环境下 UV-B辐射,研究异质性
UV-B辐射下,NO在克隆整合提高活血丹抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶
(CAT)活力中的作用。结果表明:异质 UV-B辐射下连接处理中的活血丹 UV-B辐射端抗氧化酶活力显著增
加,但 NO清除剂改变了这一趋势,说明 NO作为信号分子在克隆植物生理整合提高了活血丹抗氧化酶活力中
发挥重要作用,有助于全面认识 UV-B辐射在克隆植物生长调控中的作用和异质性 UV-B环境下克隆植物生
理整合的机理。
关键词 NO,克隆整合,异质性, UV-B辐射,活血丹
Effects of NO on Activities of Antioxidant Enzymes in Glechoma longituba
under Heterogeneous UV-B Radiation
Li Qian Mao Shaoli Wang Yuchao Li Yang *
Xian Botanical Garden of Shaanxi Province, Xian, 710061
* Corresponding author, dove18@126.com
DOI: 10.13271/j.mpb.014.001016
Abstract NO involves in regulating growth and development, caducity, defensive reaction and resistance
reaction of plants. Increasing UV-B radiation would have bad effect on growth, physiology and biochemistry
process of plants. Antioxidant enzyme activity enhanced under heterogeneous UV-B conditions, whether the NO
played an important role was still unknown. In this study, pairs of connected ramets of the stoloniferous herb
Glechoma longituba were grown under the homogeneity (both of ramets received only natural background radiation)
and heterogeneity of UV-B radiation (one of the ramet received only natural background radiation and the other was
exposed to supplemental UV-B radiation), and we studied the effects of NO scavenger on antioxidant enzyme
(SOD, POD and CAT) activity under heterogeneity of UV-B radiation. The result showed that in comparison with
clones under homogeneous ultraviolet-B radiation, the activity of antioxidant enzymes increased notably if
ultraviolet-B stressed ramets were connected to untreated ramets, and the results were reversed by NO scavenger.
The results indicated that NO as a signal molecular has played an important role in enhancing the antioxidant
enzyme activity of cloned plant physiological integration. This could be helpful for further understanding of the
function of heterogeneous UV-B radiation on growth regulation in clonal plants, and mechanism of cloned plant
physiological integration under heterogeneity of UV-B radiation.
Keywords Nitrogenmonoxide,Physiological integration,HeterogeneityUltraviolet-Bradiation,Glechoma longituba
基金项目:本研究由国家自然科学基金(31200249, 31500322)和陕西省科学院青年人才培养项目(2013K-20, 2014K-24, 2014K-
25, 2015K-04)共同资助
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
生理整合(克隆整合)是指克隆植物的分株形成
以后,在一定时期内由横生结构(即间隔子)相互连接
在一起,这种物理连接使分株间的物质运输和交换
(生理整合)成为可能,当这些相互连接克隆分株处在
不同生境时候,其资源能够被其他相连的分株进行
共享和占有(Salzman and Parker, 1985)。在大自然,植
物生存必需资源(如光照,水分和营养元素等)以及其
所处的生境条件(如温度,海拔,湿度等)无论在时间
上还是空间上都呈现出不同的异质性,即便在非常
小的尺度上都存在这种异质性 (罗学刚等 , 2002;
Chen et al., 2010)。
近年来随着工业快速发展,大量有害气体释放
到大气中,对臭氧层破坏较为严重,从而造成地球地
面的紫外 B (UV-B: 280-320 nm)辐射增强。虽然UV-B
在太阳辐射光谱中比例不高,但却具有极大的生物
学效应(Hideg et al., 2013)。由于地理纬度、海拔高度、
云量和太阳高度角等多种因素的影响,太阳辐射中
的 UV-B辐射强度也存在很大的异质性。营养元素
在克隆植物独叶草(Kingdonia uniflora)分株间的分配
结果表明林下光斑可能是影响独叶草生理可塑性的
主要原因(李育花等 , 2008),而光照强度的变化与
UV-B辐射强度密切相关(Grant et al., 2005)。项目组
前期通过研究发现异质性 UV-B辐射环境下克隆植
物白三叶和蛇莓都存在生理整合,UV-B辐射端分株
从非 UV-B辐射分株端获益,其紫外吸收物、叶绿
素、可溶性糖和蛋白的含量均增加,光合能力也有提
高,并且分株两端的抗氧化酶活力发生变化(Li et al.,
2011a)。这一现象说明克隆植物的生理整合不仅包括
资源物质在分株之间的流动,也包括防御性物质的
整合,对于克隆植物在逆境下的生存具有非常重要
的意义(Li et al., 2011b)。
UV-B辐射作为环境因子并不直接参与克隆植
物的生理整合,因此在克隆植物中必然存在着相关
的胞内信号分子及相应的信号转导机制来感受并传
递外界环境因子的刺激信号。众多研究表明过氧化氢
(hydrogen peroxide, H2O2)、一氧化氮(nitrogen monox
ide, NO)、脱落酸(abscisic acid, ABA)、茉莉酸(jasmonic
acid, JA)、乙烯和水杨酸(salicylic acid, SA)等分子共
同参与调控植物的生长发育、衰老、防御反应和植物
的抗逆反应等多种生理过程。前期研究结果表明 NO
参与了异质性 UV-B环境中防御物质紫外吸收物在
克隆植物活血丹分株之间的整合过程,而 H2O2未参
与该过程。研究发现异质性 UV-B环境导致活血丹
UV-B辐射端分株 NO含量升高,并且利用激光共聚
焦实时检测技术发现 NO沿着匍匐茎传递到非辐射
端分株,导致非辐射端分株苯丙氨酸解氨酶
(L-phenylalanin ammo-nialyase, PAL)活性提高,以及
随后的紫外吸收物含量增加,而外源施加 NO清除
剂 2-(4-羧基苯基)-4, 4, 5, 5-四甲基-1,3-二氧咪
唑啉钾盐(2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethyli-
midazoline-1-oxyl-3-oxide, cPTIO)则抑制了紫外吸
收物的整合过程。而且克隆整合提高了异质性 UV-B
辐射下活血丹抗氧化酶活力,但 NO在其中是否发
挥作用是本研究需要解决的内容。
1结果与分析
1.1异质性 UV-B辐射下 NO在活血丹克隆分株叶片
SOD活力变化中发挥的作用
异质 UV-B辐射下,补加 UV-B辐射可造成辐
射端 b II处理组 SOD活力显著高于和它相连但无
补加 UV-B辐射的 b I处理组,且 b II处理组 SOD
活力明显高于同质 UV-B辐射处理 a。然而在异质
UV-B 辐射处理组辐射端加入 NO 清除剂 (cPTIO,
0.004 mmol/L)后,补加 UV-B辐射并没有使 c II处
理组 SOD活力升高,且和同质 UV-B辐射处理 a抗
氧化酶 SOD活力相当(图 1)。
1.2异质性 UV-B 辐射下 NO 在活血丹克隆分株叶
片 POD活力变化中发挥的作用
异质 UV-B辐射下,补加 UV-B辐射可造成辐
射端 b II处理组 POD活力显著高于和它相连但无
补加 UV-B辐射的 b I处理组,且 b II处理组 POD
图 1异质性 UV-B辐射下 NO对活血丹抗氧化酶 SOD活力
变化的影响
注:图中相同字母表示不同处理间结果无显著性差异(p<0.05,
n=6)
Figure 1 The effects of NO on activities of SOD in Glechoma
longituba under heterogeneous UV-B radiation
Note: The same letter in each row indicated no significant differ-
ence among different treatments (p<0.05, n=6)
1017
活力明显高于同质 UV-B辐射处理 a,但 b I处理组
POD活力显著降低。然而在异质 UV-B辐射处理组
辐射端加入 NO清除剂(cPTIO, 0.004 mmol/L)后,补
加 UV-B辐射并没有使 c II处理组 POD活力升高,
且和同质 UV-B 辐射处理 a 抗氧化酶 POD 活力相
当,但仍高于 b I处理组 POD活力(图 2)。
1.3异质性 UV-B辐射下 NO在活血丹克隆分株叶片
CAT活力变化中发挥的作用
抗氧化酶 CAT 活力的变化趋势和 POD 一致。
在异质 UV-B辐射处理中,补加 UV-B辐射使 b II处
理组 CAT 活力显著高于和它相连但无补加 UV-B
辐射的 b I处理组。NO清除剂(cPTIO, 0.004 mmol/L)
改变了这一趋势,c II 处理组虽然补加了 UV-B 辐
射,但 CAT活力并没有显著升高(图 3)。
2讨论
在病原菌侵染引起的氧化猝发过程中,一些学
者发现,NO可以通过增强 H2O2诱导的细胞死亡效
应阻止病原菌从侵染位置扩散。这可能是由于 NO
激活液泡膜上的质子泵和 Na+/H+反向转运体活性,
增强植物对逆境抗性(Zhang et al., 2006)。除此之外,
NO还能够有效缓解热激、重金属和紫外线辐射等因
素引起的胞内 H2O2水平升高对植物体造成的伤害
(He et al., 2005)。不同的外源信号在植物体内可能通
过 NO信号传递给不同的受体,根据不同外界刺激,
进行不同的调节机制,从而调控植物对逆境胁迫产
生反应。通过本研究发现,UV-B辐射可以导致植物
体内有害自由基的积累,从而造成体内清除自由基
系统的失衡,最终形成脂质过氧化。同时试验发现,
抗氧化酶系统的增强可以有利于清除超氧自由基,
这是一种有效地减少 UV-B辐射对植物伤害的有效
途径。然而在异质性 UV-B辐射处理下,补加 UV-B
辐射处理组抗氧化酶活力显著增高,但和它相连无
补加 UV-B 辐射的处理组抗氧化酶活力却显著降
低,NO 清除剂却改变了这一现象,NO 清除剂和
UV-B辐射的作用正好相反,加入 NO清除剂后,UVB
辐射端抗氧化酶活力没有显著升高,和它相连的无
补加 UV-B辐射的处理组也无明显变化(图 2;图 3)。
植物细胞中的 NO可以通过硝酸还原酶(Nitrate
reductase, NR)、一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase,
NOS)或者非酶促反应途径产生(Hideo and Michael,
2006)。在以往研究表明不同外界刺激可以诱导植物
NOS的活性变化。细菌侵染可以诱发大豆细胞快速
产生 NO,而 NOS抑制物则可以抑制侵染细菌土豆
产生 NO作用。Mackerness研究结果发现 UV-B辐射
导致拟南芥中 NO升高,NOS活性同时增强,UV-B
辐射诱导植物中苯丙氨酸解氨酶(pal)和查尔酮合成
酶(chs)基因表达(Mackerness et al., 2001),这些作用
都可以被 NOS抑制剂和 NO清除剂进行逆转。在特
定的条件下,植物也可通过非酶促反应产生 NO,如
亚硝酸盐和抗坏血酸反应生成、由 NO的供体硝普
纳(sodium nitroprusside, SNP)产生,通过光介导,类胡
萝卜素将二氧化氮转化为一氧化氮。本研究结果和
前人研究结果一致。
前期的研究中我们发现 NO介导克隆植物紫外
吸收物的整合过程,本研究发现 NO在克隆整合提
高异质性 UV-B辐射下活血丹抗氧化酶活力中发挥
NO在克隆整合提高异质性 UV-B辐射下活血丹抗氧化酶活力中的作用研究
Effects of NO on Activities of Antioxidant Enzymes in Glechoma longituba under Heterogeneous UV-B Radiation
图 2异质性 UV-B辐射下 NO对活血丹抗氧化酶 POD活力
变化的影响
注:图中相同字母表示不同处理间结果无显著性差异(p<0.05,
n=6)
Figure 2 The effects of NO on activities of POD in Glechoma
longituba under heterogeneous UV-B radiation
Note: The same letter in each row indicated no significant differ-
ence among different treatments (p<0.05, n=6)
图 3异质性 UV-B辐射下 NO对活血丹抗氧化酶 CAT活力
变化的影响
注:图中相同字母表示不同处理间结果无显著性差异(p<0.05,
n=6)
Figure 3 The effects of NO on activities of CAT in Glechoma
longituba under heterogeneous UV-B radiation
Note: The same letter in each row indicated no significant differ-
ence among different treatments (p<0.05, n=6)
1018
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
重要作用,有助于全面认识 UV-B辐射在克隆植物
生长调控中的作用,为了解异质性 UV-B环境下克
隆植物生理整合的机理提供理论依据。
3材料与方法
3.1试验材料
在秦岭北坡海拔 600~800 m范围内采集生长状
况一致的活血丹克隆分株对,移植于 0.6 m×0.6 m×
0.4 m的培养池中,培养池一分为二,中间用薄木板
和防水塑料布分隔,各植分株对中的一支。进行 2周
的培养后,选择分株大小基本一致的分株对进行试验
(图 4)。
(4℃, 15 000 g),上清液即为超氧物歧化酶(SOD)粗提
液。SOD活性以抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原的50%
作为一个酶活单位,在 560 nm处测定吸光值,计算
出 SOD活力(Giannopolitis and Ries, 1977)。
50 mL 100 mmol/L磷酸缓冲液(pH=7.0),加入愈
创木酚 28 μL,将溶液放置于磁力搅拌器上加热搅
拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入 19 μL
30%过氧化氢,混合均匀制成反应混合液。通过称取
0.5 g活血丹叶片,剪碎,放入研钵中,加适量的
100 mmol/L磷酸缓冲液(pH=7.0)充分研磨,在 4℃离
心 15 min,取上清液,取反应混合液 3 mL和上述活
血丹叶片酶液 1 mL,测量 470 nm下吸光度值,每
隔 1 min读数一次,通过吸光值的变化来计算过氧
化物酶(POD)活力(Nakano and Asada, 1981)。
采用氧化还原滴定法(即碘量法)进行 CAT活性
测定。取上述酶液 20 μL于 50 mL锥形瓶中, 加入
pH 7.0的磷酸缓冲液 5 mL,再加入 1%的 H2O2 1 mL,
反应 5 min,然后加入 H2SO4 3 mL以中止反应。再加
入 10%的 KI 1 mL并滴入 2~3滴钼酸铵和淀粉指示
剂,最后用 Na2S2O3滴定至蓝色消失,记录 Na2S2O3的
用量。根据空白和测定二者滴定值之差,可计算被
CAT分解的 H2O2的量,并以 1 min内 1 g鲜重叶组
织所分解 H2O2的 mg数表示 CAT活性(Cakmak and
marschner, 1992)。利用 STATISTICA 6.0软件对数据
进行统计和分析,利用 ORIGIN7.5作图。
作者贡献
李倩为本研究的主要执行者负责实验操作、数
据分析及论文撰写;毛少利、王宇超和李阳负责材料
管理和数据统计整理。全体作者都阅读并同意最终
的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(31200249, 31500322)
和陕西省科学院青年人才培养项目(2013K-20, 2014K-
24, 2014K-25, 2015K-04)的共同资助。
参考文献
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3.2增强 UV-B辐射处理
UV-B辐射由覆以醋酸纤维膜(Grafix Ltd, USA)
的 40 W UV-B灯管(峰值波长 313 nm,飞利浦)在自
然光照背景下补加,日辐射剂量相当于西安地区臭
氧层减薄 15%所导致的 UV-BBE增加量。处理期间
根据背景通过调节灯管与分株顶层的高度来保持紫
外辐射强度。每天补充 8个小时(9:00~17:00)。
3.3试验指标测定方法
通过加入 2 mL预冷的磷酸缓冲液(pH=7.8)在冰
浴上充分研磨取 0.5 g活血丹叶片(去叶脉),加磷酸
缓冲液定容 5 mL。取 2 mL 该溶液在离心 15 min
图 4试验设计
注 : 活血丹克隆相连分株对随机分为三组 ; a 组为同质性
UV-B辐射,仅接受自然背景辐射, b和 c组为异质性 UV-B辐
射,分株中间用塑料薄膜隔开,使一端(b II, c II)补加 UV-B辐
射,另一端(b I, c I)不进行补加处理,接受自然背景辐射,且 c II
端另外加入 NO清除剂(cPTIO, 0.004 mmol/L)
Figure 4 Experimental design
Note: The connected ramets of Glechoma longituba were ran-
domly divided into three treatments; Homogeneity represents that
both ramets in a clonal fragment (ramet pair) were grown under
natural background radiation; Heterogeneity means that one ram-
et in a ramet pair (b I, c I) was grown under natural background
radiation, and the other (b II, c II) was exposed to supplemental
UV-B radiation, polyester films were set vertically between two
connected ramets to avoid interception of UV-B radiation by
the un-irradiated ramet , and NO synthesis inhibitors (cPTIO,
0.004 mmol/L) were supplicated to c II
1019
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