全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 511-515, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-07-31; 接受日期: 2006-10-30
基金项目: 国家自然科学基金(No.40571166)和国家教委博士点基金(No. 20050094004)
* 通讯作者。E-mail: jhjzjw@sina.com
.技术与方法.
基于MATLAB的花粉形态量化分析
贾红娟 1 , 张军文 2*
1 河北师范大学资源与环境科学学院, 石家庄 050016; 2 军械工程学院, 石家庄 050003
摘要 利用数字照相技术和MATLAB软件测量了5种杨树、3种柏树各50粒花粉的面积、扁圆率、极轴长度、赤道轴长度, 计
算了面积标准差和极轴长度/赤道轴长度。对8种花粉的面积作了方差分析。结果显示, 在99%置信水平上用面积能区分8种花
粉。用5种杨树花粉的扁圆率平均值、极轴平均值、赤道轴平均值和P/E值作聚类分析, 聚类结果显示, 5种杨树可分成3组, 加
拿大杨和小叶杨是一组, 毛白杨和山杨是一组, 青杨单独为一组。电镜观察纹饰特点与以上聚类结果一致。本研究为定量研
究花粉形态提供了一种快速有效的方法及更多的有效数据, 比目测精确度提高了10倍。
关键词 聚类分析, 数字照片, MATLAB, 花粉形态, 方差分析
贾红娟, 张军文 (2007). 基于MATLAB 的花粉形态量化分析. 植物学通报 24, 511-515.
MATLAB软件是美国Math Works 公司于1984年
推出的, 现已成为最优秀的科学与工程计算软件工具之
一。MATLAB 是解释型语言, 其语法规则非常类似
BASIC语言, 易学易用。它提供了 30多个工具箱, 包
括功能性工具箱和学科性工具箱, 如控制工具箱、图像
工具箱、小波工具箱等。借助这些工具箱, 研究人员
可以专注于个人领域的问题, 不必过多考虑计算机的实
现方法。MATLAB具有强大的数值计算功能(陈桂明等,
2002), 许多复杂的计算问题在MATLAB中只需几行代
码就可以解决。
随着数码照相机的广泛使用, 对数字图像的处理就
变得非常重要。MATLAB是基于矩阵的语言, 从本质
上提供了对图像的支持, 它可以对由数字图像形成的离
散数据矩阵进行各种处理。利用MATLAB可以对显微
图片结构进行准确而又细致的分析, 从而能更好地对显
微物体进行外形分析(杨云和黄亮, 2006)。成芳和应
义斌(2004)利用MATLAB成功地进行了稻种的形状分
析和识别。MATLAB图像处理工具箱中提供了数字图
像处理的大多数经典算法, 有100多个工具函数, 它可
以让使用者把精力集中在算法而不是编程上。
MATLAB 具有很强的开放性和适应性, 可以根据需要
对函数进行修改和扩展 , 方便用户使用(董长虹等 ,
2004)。
对花粉形态的研究, 以往人们多是在光学显微镜下
用测微尺目测花粉的大小(Erdtman, 1962; 王开发和王
宪曾, 1983; 王伏雄等, 1995; 王萍莉, 1997; 周忠泽等,
2004), 这种方法易受人为因素影响, 且较繁琐。随着计
算机技术、数字图像技术的发展, 摆脱人工方法, 找到
更简单快捷的方法测量花粉成为可能。曾志将等
(2000)利用计算机对花粉电镜照片进行了研究。我们
尝试着用日本OlympusBX51光学生物显微镜40倍物镜
及700万像素的Olympus数码相机3倍光学变焦下对几
种杨树和柏树花粉照相, 利用MATLAB程序对数字照片
进行计算, 得到各种花粉的扁圆率、面积、极轴、赤
道轴等各种参数, 为测量花粉形态参数提供一种快速有
效的方法。利用获得的原始数据进行了方差分析和聚
类分析, 把对花粉分析从定性分析上升到定量分析, 为植
物系统演化提供证据。
512 植物学通报 24(4) 2007
1 材料和方法
1.1 材料来源
观察材料均为现采花粉(表 1)。
1.2 采样和照相
采样时统一选含苞待放的花蕾, 以确保花粉成熟度一
致。光学显微镜观察材料均经过 Erdtman醋酸酐分解
法处理(Erdtman, 1962)。在日本OlympusBX51光学
生物显微镜40倍物镜及Olympus数码相机3倍光学变
焦条件下对花粉照相。在显微镜下选取较清晰、粘连
少、视野中品相好的花粉区域照相, 相同倍数照下测微
尺, 作为最后换算成公制单位的依据。
1.3 照片的预处理
把选好的照片用 photoshop进行处理, 去掉背景, 选择
合适的花粉复制到一个新文件中。在新文件中用橡皮
擦工具擦去杂质和有缺陷的花粉(不必擦得很仔细, 在
以后的计算时会自动除去面积小的杂质), 保存成JPG
格式文件。
1.4 在MATLAB中计算(主要代码如下所示)
首先对彩色照片进行二值化处理, 填充花粉图像中的空
洞, 移除杂质(面积小的对象), 计算整个照片中的花粉个
数, 标记每个花粉。
photo=imread(‘simonii.jpg’);
i=graythresh(photo);
a1=im2bw(photo,i);
a2=imcomplement(a1);
a3 = imfill(a2,‘holes’);
clean_ptoto=bwareaopen(a3, 5000);
[l,num] = bwlabel(clean_ptoto);
以最小矩形裁剪单个花粉, 旋转到水平位置, 计算每
个花粉的各种参数, 并以 EXCEL文件的形式保存。
Min-rectangle=regionprops(l,‘BoundingBox’);
for n=1:50
pollen= Min-rectangle(n).BoundingBox;
I1=imcrop(clean_ptoto,[pollen(1) pollen(2) pollen
(3) pollen(4)]);
Monad-pollen=bwareaopen(I1,5000);
lxie=bwlabel(Monad-pollen);
angle=regionprops(lxie,‘Orientation’);
angle1=angle.Orientation;
horizontal =imrotate(Monad-pollen,-angle1, ‘bilin-
ear’);
L=bwareaopen(horizontal, 5000);
L1 = bwlabel(L);
ans11=regionprops(L1,‘all’);
pollenArea(n)=ans11.Area;
polleneccentricity(n)=ans11.Eccentricity;
pollenbox=ans11.BoundingBox;
pollenboxX(n)=pollenbox(3);
pollenboxY(n)=pollenbox(4);
end
aa(:,1)=pollenArea;
aa(:,2)=pollenEccentricity;
表 1 材料来源
Table 1 Source of materials
Species Locality Collector
Populus canadensis Moench Hebei Normal University, Shijiazhuang Li Yuecong, Jia Hongjuan
P. tomentosa Carrière Hebei Normal University, Shijiazhuang Li Yuecong, Jia Hongjuan
P. cathayana Rehder Tuoliang, Shijiazhuang Li Yuecong, Jia Hongjuan
P. davidiana Dode Xiaowutai Mt., Hebei Li Yuecong, Jia Hongjuan
P. simonii Carrière Xiaojiao, Shijiazhuang Li Yuecong, Jia Hongjuan
Sabina chinensis (Linn.) Ant. Hebei Normal University, Shijiazhuang Li Yuecong, Jia Hongjuan
Juniperus formosana Hayata Hebei Normal University, Shijiazhuang Li Yuecong, Jia Hongjuan
Platycladus orientalis (Linn.) Franco Hebei Normal University, Shijiazhuang Li Yuecong, Jia Hongjuan
513贾红娟等: 基于MATLAB 的花粉形态量化分析
aa(:,3)=pollenboxX;
aa(:,4)= pollenboxY;
xlwrite(‘simonii.xls’,aa);
取出最大、最小和平均值。
max(pollenArea)
min(pollenArea)
mean(pollenArea)
……
max(pollenboxY)
min(pollenboxY)
mean(pollenboxY)
计算机自动测量较手工作业精度和效率更高, 只要
准备好数字照片输入到程序中, 几分钟就可以得到大量
的数据。在光镜下目测最大分辨率一般是1 µm(王伏雄
等, 1995)。在数字照片中1 µm可以用9.4个像素点来
表示, 这种方法的精度就可以达到0.106 µm, 这样的精
度可以使测量误差忽略不计。误差主要由于花粉的选
择是随机的, 所以要去掉畸形及折叠明显的花粉, 以减少
误差。利用获得的大量数据, 在计算机上通过MATLAB
程序作量化分析, 把对花粉定性的文字描述变为量化的
数学分析。用数量表示比用文字描述能更好地对不同
种花粉进行区分, 为植物系统演化和分类学研究提供量
化证据。
2 结果与分析
2.1 原始数据分析
由于根据文献中(王伏雄等, 1995; 王萍莉, 1997; 周忠
泽等, 2004; 刘家熙和阎秀峰, 2005; 徐进和王章荣,
2005)普遍采用的20和30粒花粉计算的结果与80、90
粒的结果相差很大, 通过多次比较认为取 50粒比较合
适, 所以最后统一取 50粒计算花粉的面积、扁圆率、
极轴长、赤道轴长和 P/E等参数, 取最大、最小及平
均值。
由表 2可见, 杨树、柏树的花粉赤道轴、极轴的
数量值很小, 不同种之间的差值更小, 以赤道轴、极轴
的值为参数不能很好反映杨树、柏树不同种花粉之间
的差别, 而面积能较好地表现种类之间的差异。
柏树的花粉比杨树的花粉大很多, 用其面积平均值
的大小就可以区分这 3种柏树、5种杨树。刺柏花粉
的面积最大, 为634.64 µm2, 它的扁圆率为0.4257, 是
比较扁的花粉。侧柏花粉在柏树中比较小, 与圆柏相差
约 50 µm2。在这 8种花粉中最圆的扁圆率为 0.3507,
花粉个体的大小差异最明显, 标准差为109.8710 µm2。
圆柏花粉标准差为40.1268 µm2, 是8种花粉中大小最
均匀的。在8种花粉中加拿大杨花粉最小, 平均面积只
有339.2033 µm2, 面积的标准差也只有40.4495 µm2,
表 2 8种花粉的计算结果 (面积单位为µm2 , 长度单位为µm)
Table 2 Compute results of eight pollen species (area unit µm2, length unit µm)
Populus
P. simonii P. cathayana P. tomentosa P. davidiana
Platycladus Sabina Juniperus
canadensis orientalis chinensis formosana
Max. area 533.0693 469.4206 460.7402 656.9149 855.9416 721.1747 825.6451 862.5396
Min. area 244.1489 257.9787 281.6772 294.4885 317.4287 398.7438 428.2028 438.1394
Mean area 339.2033 350.6338 363.5695 439.4862 520.6881 552.3766 610.2309 634.6424
Area standard deviation 40.4493 68.6974 79.2904 60.4708 84.8619 109.8710 40.1268 85.8047
Max. eccentricity 0.6075 0.6252 0.5610 0.6157 0.6152 0.5429 0.5677 0.6114
Min. eccentricity 0.1735 0.1517 0.1296 0.1859 0.2238 0.1446 0.1440 0.1380
Mean eccentricity 0.4158 0.4196 0.3563 0.4071 0.409 0.3507 0.4064 0.4257
Max. pole-length 29.1489 26.5957 26.1702 30.2128 35.5319 31.3830 34.1489 35.6383
Min. pole-length 19.2553 19.5745 19.6809 20.1064 21.2766 23.4043 25.0000 25.9574
Mean pole-length 22.1894 22.4787 22.6064 24.9894 27.1766 27.6489 29.5298 30.2787
Max. equator-length 23.5106 22.7660 23.6170 28.1915 31.2766 30.1064 33.2979 32.3404
Min. equator-length 16.0638 16.9149 18.0851 19.0426 18.8298 22.0213 22.2340 21.1702
Mean equator-length 19.8723 20.2596 21.0255 22.6532 24.6489 25.8553 26.9383 27.1319
P/E 1.1166 1.1095 1.0752 1.1031 1.1025 1.0694 1.0962 1.1160
514 植物学通报 24(4) 2007
是 8种花粉中大小比较均匀的。山杨的花粉是 5种杨
树中最大的 , 大小也最不均匀。在杨树中 , 加拿大
杨、小叶杨和青杨的花粉比较小, 毛白杨和山杨的花
粉比较大。
2.2 方差分析
为了验证用面积区分花粉是否可行, 我们用这8种各50
粒花粉的面积作方差分析(表 3)。
由表3可知, F值127.69远远大于F0.01的值3.0988,
检验结果是呈显著差异, 说明在99%的置信水平下用面
积区分这 8种花粉是可行的。
2.3 聚类分析
用加拿大杨、小叶杨、青杨、毛白杨和山杨花粉的面
积平均值、扁圆率平均值、极轴平均值、赤道轴平均
值和 P/E值为参数作聚类分析(图 1)。
由图1可以看出, 5种杨树可分成3组, 加拿大杨和
小叶杨是一组, 毛白杨和山杨是一组, 青杨单独为一组。
在电镜下观察, 加拿大杨和小叶杨呈不规则颗粒状纹饰,
颗粒比较密, 刺突不明显; 毛白杨和山杨也呈颗粒状纹
饰, 与加拿大杨及小叶杨相比, 颗粒较稀, 刺突明显; 青
杨则为网状纹饰, 与其它4种明显不同。电镜观察的纹
饰特点与聚类分析结果一致。
以上分析只是在有限数据范围内得出的结果, 是否
普遍适用, 有待获得大量数据后进一步验证。
3 结论与讨论
本文提供了一种利用光镜数字照片快速测量花粉形态参
数的方法, 可以比目测得到更多的参数。由于花粉本身
很小, 目测花粉极轴、赤道轴的误差比较大, 而利用
MATLAB程序测量花粉形态参数提高了测量精度和效
率。原始数据和方差分析表明, 用花粉面积可以区分 5
种杨树、3种柏树的花粉。对 5种杨树作了聚类分析,
分析结果与电镜观察纹饰特征一致。本研究把花粉研
究从定性分析上升到定量分析, 为植物的分类和系统演
化提供依据。电镜成本高, 花粉鉴定中不可能全部用电
镜观察花粉, 光镜和数码照相机成本低, 利用光镜照片并
借助计算机技术可以降低花粉研究的成本。
这种方法比较适用于圆形和椭圆形的花粉, 其它形
状的花粉还需要进一步研究。花粉较植物其它器官变
异小, 通过计算大量的花粉样本, 建立花粉样本库, 可
为进一步的形态分析、系统演化、分类和识别提供量
化数据。
致谢 感谢李月丛老师帮助采集花粉, 于和平老师
表 3 8种花粉面积的方差分析
Table 3 Variance analysis about pollen area of eight species
Source SS DF MS F F0.01
Columns 3.88086E+010 7 5.54409E+009 127.69** 3.0988
Error 1.70205E+010 392 4.34197E+007
Total 5.58291E+010 399
SS: 平方和; DF: 自由度; MS: 均方值; F: 均方值的比值 ;F0.01: F在 0.01水平上的临界值
SS: square sum; DF: degree of freedom; MS: mean square sum; F: square sum among class/square sum inner class ;F0.01: the
threshold value of F at 0.01
图 1 5种杨树花粉聚类分析
A: 加拿大杨; B: 小叶杨; C: 毛白杨; D: 山杨; E: 青杨
Figure 1 Cluster analysis of five pollen species about populus
A: Populus canadensis; B: P. davidiana; C: P. tomentosa; D:
P. simonii; E: P. cathayana
515贾红娟等: 基于MATLAB 的花粉形态量化分析
处理花粉。
参考文献
陈桂明, 戚红雨, 潘伟 (2002). MATLAB数理统计(6.X). 北京: 科学
出版社. pp. 136-198.
成芳, 应义斌 (2004). 基于MATLAB平台的稻种图像分析系统. 浙
江大学学报(农业与生命科学版) 30, 572-576.
董长虹, 赖志国, 徐啸海 (2004). MATLAB图像处理与应用. 北京:
国防工业出版社. pp. 196-204.
刘家熙, 阎秀峰 (2005). 西藏产四种卷柏科植物的孢子形态观察.
植物学通报 22, 44-59.
王开发, 王宪曾 (1983). 孢粉学概论. 北京: 北京大学出版社. pp.
Quantitative Analysis of Pollen Morphology with MATLAB
Hongjuan Jia1, Junwen Zhang 2*
1 College of Resource and Environment, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China
2 Ordnance Engineering College, Shijiazhuang 050003, China
Abstract Pollen grains of three species of Cupressaceae and five species of Populus were examined in detail by use of a digital
photographic technique and MATLAB software. For each pollen species, 50 measurements were taken of maximum, minimum and
mean values of area, eccentricity, pole-length and equator-length. P/E and area standard deviations were computed. Variance
analysis of the areas of 8 pollen species showed that the method can distinguish the 8 pollen species with reliability of 99%. Cluster
analysis of mean eccentricity, pole-length, equator-length and P/E parameter of 5 species of Populus showed that the 5 species
can be divided into 3 groups. P. canadensis Moench and P. simonii Carrière form one group; P. tomentosa Carrière and P.
davidiana Dode form another group; P. cathayana Rehder stands alone as the third group. This outcome is consistent with scanning
electron microscopy results. The method offers a speedy and convenient way for quantitative analysis of pollen morphology,
provides more useful data for pollen analysis and improves the accuracy, by about 10 times, than with estimation by the naked eye.
Key words cluster analysis, digital photo, MATLAB, pollen morphology, variance analysis
Jia HJ, Zhang JW (2007). Quantitative analysis of pollen morphology with MATLAB. Chin Bull Bot 24, 511-515.
53-54.
王伏雄, 钱南芬, 张玉龙, 杨惠秋 (1995). 中国植物花粉形态. 北
京: 科学出版社. pp. 9-9.
王萍莉 (1997). 中国实用花粉. 成都: 四川科学技术出版社. pp. 18-18.
徐进, 王章荣 (2005). 鹅掌楸属种间杂种与亲本花粉壁的超微结构
的比较观察. 植物学通报 22, 35-38.
杨云, 黄亮 (2006). 运用MATLAB实现对显微图片的数字化分析.
机械设计与制造 2, 135-137.
曾志将, 王开发, 俞小明, 张卫东 (2000). 花粉形态计算机量化分
析研究. 植物学通报 17, 372-374.
周忠泽, 张小平, 许仁鑫 (2004). 中国冰岛蓼属植物花粉形态的研
究. 植物分类学报 42, 513-523.
Erdtman G (王伏雄, 钱南芬译) (1962). 花粉形态与植物分类. 北
京: 科学出版社. pp. 5-18.
(责任编辑: 白羽红)
* Author for correspondence. E-mail: jhjzjw@sina.com