全 文 ：植物学通报 2004, 21 (4): 471~477
Chinese Bulletin of Botany
①广东省科技攻关重大专项（2003A201040）和广东省农业科学院院长基金（2001-基金-24）。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zhugf@163.net
收稿日期：2003-03-31 接受日期：2003-10-27 责任编辑：孙冬花
重要观赏兰科植物的分子生物学研究进展①
1,2朱根发② 2郭振飞
1（广东省农业科学院花卉研究所 广州 510640） 2（华南农业大学生命科学院 广州 510640）
摘要 兰科植物是开花植物中最大的家族之一，分子标记技术应用于兰科植物的分类鉴定和品种鉴
别，为兰花的分类提供了分子水平的证据，也为兰花保护策略和措施的制定提供了理论基础。兰科植物
表现有高度特异的形态、结构和生理特性，是研究花着色机理和子房发育的理想对象。兰花离体培养开
花系统的建立，可以用来探明兰花从营养生长向生殖生长的转变机制，是研究花的分化和发育的理想材
料。兰花具有特异的查尔酮合成酶（CHS）基因和二氢叶酸还原酶（DFR）基因等控制花色素的合成，
DOH1基因控制石斛兰花芽的形成和提早开花，PHAL.039基因和ACC合成酶基因在蝴蝶兰授粉后的子房发
育中起着重要的调控作用，这些特异基因的分离和克隆为兰花花的分化、发育及着色机制提供了分子基础。
蝴蝶兰属、大花蕙兰(Cymbidium hybridium)、石斛兰属、文心兰属、五唇兰属和万代兰属等兰科植物都有转
基因的研究报道，主要以原球茎为材料采用基因枪或农杆菌法转化，部分研究获得了转化植株。
关键词 兰科植物，分子标记，基因克隆，转基因，花的发育，分子生物学
Progress on Molecular Biology of Main
Ornamental Orchidaceae
1,2 ZHU Gen-Fa② 2 GUO Zhen-Fei
1（Floricultural Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640）
2（College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510640）
Abstract Orchidaceae is one of the largest families of flowering plants. DNA molecular marker
techniques have been used in taxonomy, phylogenetic analysis between different species or varieties,
and conservation. Orchidaceae has highly specialized morphological, structural, and physiological
characteristics，it is an ideal material to study flower pigmentation and ovule initiation and
development. In vitro flowering techniques of orchids provide a model system to study inflorescence
differentiation and development. Flavonoid pathway was regulated by CHS and DFR gene in orchids.
Flower bud formation and early flowering were controlled by DOH1 gene in Dendrobium. ACC
synthase gene and PHAL.039 gene were most likely important regulators involved in ovule tissue
initiation and development in Phalaenopsis. Genetic transformation has been reported in Phalaenopsis
spp., Cymbidium spp., Oncidium spp., Dendrobium spp.， Doritis spp., and Vanda spp .Transgenic
plants were produced from protocorm by bombardment or Agrobacterium mediated transformation.
专 题 介 绍
472 21(4)
Key words Orchidaceae, DNA molecular marker, Gene clone, Genetic transformation, Flower
development, Molecular biology
兰科(Orchidaceae)植物是开花植物中最大的家族之一，有6个亚科725属约25 000多个种
（Floyd et al.，1989）。广泛分布于各种生态环境，并表现有高度特异的形态、结构和生
理特性。这些高度特异的叶形、花形和花色正是人们欣赏兰花及热爱兰花的根本原因。对兰
花育种、组织培养、生理、栽培和分子生物学等的研究，是花卉学研究的热点之一。本文
就兰花分子生物学研究的进展进行综述。
1 分子标记技术在兰花分类鉴定上的应用
分子标记技术近十年来取得了重大的发展，已构建了水稻(Oryza sativa L.)、小麦(Triticum
aestivum L.)、玉米(Zea mays L.)和大麦(Hordeum vulgare L.)等十几种重要农作物的分子标记连
锁图谱。利用分子标记技术，不仅可以绘制品种的指纹图谱及目标性状的基因连锁图，还可
以用来研究种质资源的遗传多样性，进行种质资源的创新和鉴定(贾继增，1996；张德水和陈
受宜，1998）。在育种上，利用分子标记技术将使亲本的选配更准确且更快速，从而提高
育种效率，也可以及时准确地鉴定 F1的真实性，并预测杂种优势。在回交育种中，利用分
子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection, MAS),不仅可以提高选择效率，而且可有
效地用于数量性状的遗传改良(张德水和陈受宜，1998；陈升和张启发，2000)。
用于植物种质资源鉴定和育种的分子标记技术，主要有限制性片断长度多态性（restric-
tion fragment length polymorphism, RFLP）、随机扩增多态性（random amplified polymorphic
DNA, RAPD）、简单重复序列（simple sequence repeat, SSR）和扩增片断长度多态性
（amplified fragment length polymorphism, AFLP）等。比较而言，RFLP和 RAPD技术在主
要农作物和园艺作物上的研究和应用较多，AFLP和 SSR则较少（许占友和常汝镇，2000）。
但一些研究表明，AFLP标记每一引物组合检出的多态性带数最多，重复性好，作全基因组
背景选择有明显的优势，适用于研究不同种质间的遗传关系以及亲子间的系谱分析等（许占
友和常汝镇，2000；陈升和张启发，2000；祝军等，2000）。
分子标记技术用于兰花分类鉴定和亲缘关系分析上，国内外已有一些报道。Choi 等
（1998）在杂交中发现春兰(Cymbidium goeringii)与建兰(C. ensifolium)、寒兰(C. kanran)和墨
兰(C. sinense)具较高的亲和性；而与蕙兰（C. faberi）、纹瓣兰(C. aloifolium)、鼓槌石斛
(Dendrobium chrysotoxum)和蝴蝶兰杂交则无亲和性，经 RAPD分析发现，春兰与建兰、寒
兰和墨兰的亲缘关系较近，与蕙兰和纹瓣兰亲缘较远，与石斛兰和蝴蝶兰更远。文李等
（2001）利用RAPD技术分析了兰属 5个种 2个变种共 13个品种间的亲缘关系，从 55种 10个
碱基随机引物中筛选出 4种引物，扩增出 93条多态性带，多态率为 100%，通过聚类分析表
明，建兰、墨兰和春兰的亲缘关系较近，而春剑(C. longibracteatum)、寒兰、独占春(C.
eburneum)和兔耳兰(C. lancifolium)与建兰的亲缘关系较远。
丁小余等（2002）对束花石斛(D. chrysanthum)与同属相似种玫瑰石斛(D. crepidatum)、喇
叭唇石斛(D. lituiflorum)、报春石斛(D. primulinum)和兜唇石斛(D. aphyllum)进行了 rDNA ITS
区序列比较研究，发现尽管束花石斛及其相似种的外部形态差异较小，但在 rDNA ITS序列上
4732004 朱根发等：重要观赏兰科植物的分子生物学研究进展
存在显著且稳定的差异，碱基替换数高达75~80，遗传距离为0.1214~0.1264; 并挑选出15个碱
基位点用作束花石斛与其相似种的DNA标记。rDNA被称为生物体内的活化石，具有比cpDNA
更快的进化速率，且不存在 cpDNA的母系单亲遗传，是用于研究科内、属内和种间的分子
系统演化及物种鉴别的重要分子标记。
在栽培品种的鉴定上，Obara-Okeyo和Kako（1998）利用 RAPD技术对 36个大花蕙兰
(Cymbidium hybridium)栽培种进行了品种鉴定和遗传分析，用 15个 RAPD引物扩增出 132条
带，其中 78%具多态性，所有的品种均可清楚鉴别，品种间的遗传距离为 0.08~0.50；利用
OPA-1引物，可以将已混淆的品种明确地区别出来。Chen 等（1999）利用EcoRI+4t和MseI+3
作引物对万代兰进行了AFLP分析，发现同一杂交来源的株系间有超过10%多态性AFLP带数，
而同一品种的茎尖培养体细胞无性系变异品种，也有0.3%~0.7%的AFLP带数是多态性，说明
AFLP适用于万代兰属品种的鉴定。谭文澄等（1999）采用 LZF-1探针和限制性内切酶Hinf1
检测了兰属23个样株和石斛兰属1个样株的DNA酶切片断，获得了清晰易读的由6~15条带组
成有特异性的遗传指纹图谱。
在遗传多样性与群体遗传结构分析上，李昂等（2002）采用 RAPD技术研究了中国 3种
珍稀濒危兰科植物硬叶兜兰(Paphiopedilum micranthum)、麻栗坡兜兰(P. malipoense)和独花兰
(Changnienia amoena)的遗传多样性与群体遗传结构。12个RAPD引物在 2种兜兰中共扩增出
131条带，11个独花兰群体采用 16个 RAPD引物共扩增出 119条带。研究认为，3个物种的
遗传多样性偏低而群体间遗传分化较高，主要原因在于人为的过度采挖和生境的片断化，因
此为兰花保护策略和措施的制定提供了理论基础。
2 特异基因的分离克隆
兰花是研究花着色机理的理想对象，因为兰花的花色变化非常丰富。如蝴蝶兰，不仅具
有红花和白花等单色花，也有白花红唇等复色花，还有线条花和斑点花。查尔酮合成酶（又
称苯基苯乙烯酮合成酶 chalcone synthase,CHS）是花青素（anthocyanin）生物合成的一个重
要的关键酶。Liew等（1998）从 Bromheadia finlaysoniana的 cDNA文库中克隆出 3个 CHS
基因OCHS3、OCHS4和OCHS8，其序列长度分别为 1 445 bp、1 382 bp和 1 439 bp，三者
的同源性达 97%以上，与其他植物的同源性为 59%~68%。许华欣和黄鹏林（1999）为了探
讨控制蝴蝶兰花色的机制，利用‘白花红唇蝴蝶兰’和‘红花朵丽蝶兰’为材料，进行
了 CHS cDNA克隆和分析，发现‘白花红唇蝴蝶兰’约有 11个 CHS基因，而‘红花朵丽
蝶兰’约含有 7个 CHS基因，蝴蝶兰 CHS基因为多基因族；从‘白花红唇蝴蝶兰’选取
出的 pOCHS01克隆系，DNA序列长度为 1 498 bp，可编码 390个氨基酸，其氨基酸序列与
拟南芥(Arabidopsis thaliana)等其他作物相比，具 59.5%~64.9%的同源性；利用 pOCHS01作
探针，对以‘粉红花蝴蝶兰’为母本与‘白花蝴蝶兰’杂交选出的淡红花、晕红花和白
花后代进行 Southern 杂交分析，发现子代的杂交条带与母本相似，而与父本完全不同，说
明来自‘白花红唇蝴蝶兰’的 pOCHS01克隆系，可能是负责控制红花或喷点花花色表达的
基因，而白花亲本可能无 pOCHS01基因的存在，或者有其他 CHS基因负责控制。
其他已克隆的基因包括 Bromheadia finlaysoniana的二氢叶酸还原酶（dihydroflavonol 4-
reductase,DFR）基因（Liew et al.，1998）、Dendrobium crumenatum的异柠檬酸裂解酶基
474 21(4)
因（isocitrate lyase gene, DCRICl）（Vellupillai et al.，1999）和H+-ATP合成酶(vacuolar H+-
ATP synthase)基因（Liew et al.，1999）。潘俊松等（1997）开展了侵染兰花的两种病毒
建兰花叶病毒（CyMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）外壳蛋白基因的克隆。获得了 CyMV和
ORSV的外壳蛋白基因，以及抗细菌性病害如软腐病的 AP（amphipathic protein）基因（陈
文辉和林益贤，2000）。刘志昕等（2001）从石斛兰的建兰花叶病毒(CyMV)分离物中提取
病毒 RNA，用反转录 -聚合酶链式反应(RT-PCR)方法获得约 500 bp的运动蛋白(movement
protein，MP)基因片断。序列分析表明，该基因片断由 474 bp组成，与美国夏威夷和新加
坡的CyMV分离物相应基因核甘酸序列具有97.8%同源性；根据核酸序列推导该片断含有3个
部分重叠的开放阅读框架(ORF)，分别编码 14 kD、12 kD和 10 kD的多肽。
3 花发育的分子生物学
在兰花组织培养中，常有试管开花现象的报道。最近的研究表明，离体培养可将兰花的
童年期由几年缩短到几个月(Yu and Goh，2001)。离体培养开花系统，是研究兰花花的分化
和发育的理想系统，可以用来探明兰花从营养生长向生殖生长的转变机制。
Yu和 Goh（2000a）利用其建立的石斛兰属品种‘Madame Thong-In’离体开花系统，
通过mRNA差选方法（mRNA differential display ），从茎尖分生组织和花芽分生组织中分别
提出总mRNA,发现前者有 53个特异的 cDNA克隆，而后者则有 16个特异的 cDNA克隆；
通过 Northern 印迹技术证实，在由营养生长向生殖生长的转变中，有 12种 cDNA克隆表
达降低，而有 8种 cDNA克隆表达增加；序列分析表明，其中 5个基因可能是与花的转变
有关的基因。Yu和 Goh（2000b）进一步分离出一些与花发育有关的基因，如 DOH1基
因，控制花芽的形成和提早开花；DoMADS1、DoMADS2和 DoMADS3基因，与花器官
的形成有关。
对多数开花植物而言，子房成熟后，卵细胞才能与花粉受精，但在兰科植物中，其子
房的发育是由授粉启动的，这是兰科植物的特殊性，是进行子房发育研究最具吸引力之所在。
目前已发现和分离了一批控制兰花子房发育的特异基因。如蝴蝶兰 PHAL.039基因（Lu et
al., 1996），在蝴蝶兰子房发育的不同阶段都有表达，可能是蝴蝶兰子房发育的重要的调控
基因。利用 PHAL.039作探针，在拟南芥花芽的 cDNA 文库中也发现了与其同源的基因
ATML1。
Bui和ONeill（1998）发现了3种ACC合成酶基因在蝴蝶兰授粉后的子房发育中起着重要
作用。在蝴蝶兰授粉后 1 h便可在柱头上检测到 PHAL-ACS2的表达，2 h后可在子房中检测
出 PHAL-ACS3的表达，而授粉后 6 h才可检测出 PHAL-ACS1的表达。利用外源生长素刺激，
进行假授粉，也可在柱头和子房中发现PHAL-ACS2和PHAL-ACS3的先表达。说明PHAL-ACS2
和PHAL-ACS3的表达，是授粉的初始信号，而PHAL-ACS1则是次级信号。张宪省等（1999）
也利用朵丽蝶兰分析了生长素、乙烯及去雄等与授粉有关的因子调节下ACC合酶和ACC氧化
酶基因在花中的表达，结果表明，生长素和乙烯均可诱导ACC合酶和ACC氧化酶的mRNA
在花器官中积累。然而，去雄却不能诱导这两个基因在花器官中表达。生长素和乙烯所诱导
的ACC合酶和ACC氧化酶的mRNA在花器官中的积累模式相似。原位杂交结果表明，生长
素和乙烯处理后ACC氧化酶的mRNA在柱头的表皮和薄壁细胞中积累。
4752004 朱根发等：重要观赏兰科植物的分子生物学研究进展
4 转基因研究
兰科植物转基因研究的报道不多，仍停留在建立基因转化体系的水平，尚未达到应用阶
段。采用的方法有基因枪法和农杆菌法。研究的兰花种类包括蝴蝶兰属（Anzai et al.，1996；
Belarmino and Mii，2000; 詹渊理等，2003）、大花蕙兰（Yang et al.，1999）、石斛兰属
（Kuehnle and Sugii，1992；Chia et al.,1994; Yu and Goh, 2000a）、文心兰属（邵寒霜等，
2000）、万代兰属（Chia et al.,1990）和五唇兰属（Griesbach and Hammond，1993)。
Chia 等（1990）报道了 LUX基因在万代兰原球茎的瞬间表达；Kuehnle和 Sugii（1992）
将NEO基因转入石斛兰21个月后获得稳定表达; Griesbach和Hammond(1993)报道了在五唇兰中
导入花色素苷合成的调控基因后,在花中获得瞬间表达,花瓣颜色发生变化。陈文辉和林益贤
（2000）利用农杆菌对蝴蝶兰原球茎进行了基因转化研究，以 NPTⅡ和 GUS基因作标记，初
步建立了蝴蝶兰的农杆菌转基因体系，发现蝴蝶兰不同品系或不同增殖时期的原球茎对农杆菌
感染的反应不同，农杆菌EHA105(pMT1)菌株对Phal. Taisuco Elegance ‘F80-13’原球茎感染的
GUS基因瞬时表达率最高。Belarmino和Mii（2000）利用 LBA4404（Ptok233）和 EHA101
(pIG121Hm)对蝴蝶兰进行农杆菌基因转化研究，发现经过10 h的共培养可显著地提高转化率，
获得了 100多株转基因植株。
Yang等（1999）将带有NPTⅡ和GUS标记基因的 pKH200质粒，通过基因枪对大花蕙兰
原球茎进行了基因转化研究，获得了抗卡那霉素的原球茎和转基因植株，通过 PCR分析，证
明 NPTⅡ基因存在于转基因植株中。陈志俊等（2000）利用花椰菜花叶病毒 (CaMV ) 35S启
动子引导的GUS基因检测基因枪法转化Aranda原球茎的瞬间表达效率，发现在基因枪轰击时
在DNA金粉悬液中加入 0.1 mol.L-1的NAA，轰击前预培养时用 0.1 mol.L-1甘露醇处理，每
个培养皿轰击两次和轰击压力为 1 100 psi下，GUS基因在兰花原球茎组织中的瞬间表达效率
最高。邵寒霜等（2000）将 LFY基因（从拟南芥中克隆出的具有促进植物提早开花的基因）
与单子叶植物的UBI启动子构建了一个适合在单子叶植物中高效表达的含有LFY cDNA的表达载
体(pBIL-1)，应用基因枪转化法将其导入文心兰的原球茎中，获得了一些卡那霉素抗性克隆。
5 结语
我国的野生兰科植物估计达 173属 1 240多种，其中 1/4可供观赏，有些种类如兜兰、杓
兰和独蒜兰属，已受到全世界的重视（陈心启等，1999）。我国是兰属植物的分布中心之
一，世界上兰属植物约有 50~60种，我国已知的兰属植物有 31种，占全球的一半以上，主
要为地生兰(吴应祥, 1 9 9 3 )。墨兰（报岁兰）、春兰、建兰（四季兰）、蕙兰和寒兰，在
我国都有大量分布。经过千百年来的品种选择和栽培，每个兰花种类都有成千上百的珍奇品
种流传于世，深受人民的喜爱。“兰文化”因此而生，其影响遍及日本、韩国及东南亚国家。
兰属已被列为我国重点保护的植物资源之一。“九五”期间，在全国已建立或筹建了一
些兰花样品园，为我国兰花资源的保存起到较好的作用，如广东的“墨兰样品园”、云南
的“莲瓣兰样品园”、福建的“建兰样品园”和浙江的“春兰样品园”，但对这些资源
的分类、鉴定、创新和利用等缺乏深入的研究。甚至市场上出现一些以假乱真的兰花品种，
很难从形态上鉴定其真伪。建立名贵兰花的分子标记指纹图谱，有利于名贵兰花品种的鉴别。
476 21(4)
我国兰花的品种选育，仍然主要依靠芽变筛选，对品种间的亲缘关系、新品种的早期鉴
定方法和芽变的规律性缺乏研究。由于兰花杂交育种方法的繁琐（其种子发育不全，需进行
无菌播种）及选育周期长（国兰播种苗从出瓶至开花需 5~7年的时间），国内目前还较少人
问津。以上因素，使得我国兰花育种工作的进展缓慢，影响了我国兰花的普及推广和进一步
走向世界。建立和利用兰花分子标记技术，对我国兰花进行分类鉴定，研究其遗传多样性，
弄清其品种间的亲缘关系，为兰花杂交、诱变和基因工程育种提供早期的辅助选择指标。兰
花特异基因的分离克隆、花发育的分子生物学和转基因技术的研究，将为兰花育种和花期调
节提供新的途径。
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