全 文 ：植物学通报 2004, 21 (3): 312~318
Chinese Bulletin of Botany
①国家重点基础研究发展规划（N o . G 1 9 9 9 0 1 1 7）资助项目。
②同为第一作者。Equal contributor.
③通讯作者。Author for correspondence. E-mail: xcwang@public.bta.net.cn
收稿日期：2003-05-16 接受日期：2003-09-16 责任编辑：崔郁英
植物细胞壁伸展测定仪在蚕豆扩张蛋白
特性研究中的应用①
1,2王文龙② 1陈 苏② 1朱果利 1陈 珈 1王学臣③
1（中国农业大学植物生理生化国家重点实验室 北京 100094）
2（湖南文理学院生命科学系 常德 415000）
摘要 扩张蛋白(expansin)在细胞扩张和果实成熟中起着极为重要的作用。植物细胞壁伸展测定仪是研
究扩张蛋白必不可少的仪器。为此以电涡流传感器为核心部件装配了一种具有结构简单、操作方便和测
量准确等优点的新型测定仪，并利用该仪器研究了蚕豆(Vicia faba)扩张蛋白的特性。结果表明蚕豆根、
茎、上胚轴和成熟叶片中均存在扩张蛋白，而且叶片和幼根的扩张蛋白活性最强；免疫印迹证实在蚕豆
根、茎、上胚轴和成熟叶片中确实存在扩张蛋白。以上结果说明本仪器灵敏且可靠，用此仪器首次发现
在成熟叶片中存在扩张蛋白。
关键词 扩张蛋白，蚕豆，细胞壁，伸展测定仪
Application of Extensometer in Analyzing Characteristics
of Expansin from Vicia faba
1,2WANG Wen-Long② 1CHEN Su② 1ZHU Guo-Li 1CHEN Jia 1WANG Xue-Chen③
1(State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, China Agricultural University, Beijing 100094)
2(Department of Biology, Hunan Institute of Art. and Science, Changde 415000)
Abstract Expansin is first identified as cell-wall-loosening protein. Its function is involved in
regulating cell expansion and fruits softening. Because its typical characterization is the ability to
induce the extension of isolated cell walls, extensometer is necessary for detection activity of the
protein. A new sensitive and accurate extensometer with simple structure was installed using trans-
ducer as the key component. Characteristics of expansins from roots, stems, epicotyls and mature
leaves of Vicia faba were studied using the extensometer. Results showed that there were expansins
in all the tested organs and it was approved further by western-blot analysis. The activity of expansins
from roots and leaves was higher than that from epicotyls and stems. The results suggested that our
extensometer was sensitive enough to study expansins and the existence of expansin in mature
leaves was reported firstly.
Key words Expansin, Vicia faba, Cell wall, Extensometer
扩张蛋白(expansin)是McQueen-Mason等(1992)首次从在黑暗条件下生长的黄瓜下胚轴中分
3132004 王文龙等：植物细胞壁伸展测定仪在蚕豆扩张蛋白特性研究中的应用
离纯化出的一种细胞壁蛋白。该蛋白的活性受H+调控，在酸性条件下(pH 4.5)活性最高，而
在中性条件下，几乎没有活性，该蛋白可以较为圆满的解释生长素诱导的细胞延伸现象。目
前，在拟南芥（Cho and Cosgrove, 2000）、番茄(Rose et al., 2000)、草莓(Civello et al., 1999)、
棉花(Ruan et al., 2001)、水稻(Cho and Kende, 1997)和玉米(Zhang and Hasenstein, 2000)等多种植
物中均已发现扩张蛋白。研究表明，扩张蛋白在植物形态建成(Fleming et al., 1997；1999)、
果实成熟(Cosgrove, 2000)、根毛发生(Cho and Cosgrove, 2002)、细胞扩张(Cosgrove, 1996；
1997；1998)、渗透调节(Wu et al., 1996; Wu and Cosgrove, 2000)和禾本科植物花粉管生长
(Cosgrove, 1997)等诸多方面均起着极为重要的作用。
由于该蛋白的典型特点是可诱导热钝化的细胞壁恢复伸展活性(McQueen-Mason et al.,
1992)，因此，测定热钝化细胞壁的伸展性能是鉴定该蛋白重要方法之一。而研究该蛋白生化
活性，植物细胞壁伸展测定仪是必不可少的仪器。测定植物细胞壁伸展的常用方法有 6种：
生长速率 -膨压法、膨压松弛法、外施重力法、应力应变法（或称 Instron法）、应力松弛
法和细胞壁蠕变法，其中前 3种方法用于活体材料，后 3种方法用于离体细胞壁（Cosgrove,
1993）。但是，目前植物细胞壁伸展测定仪尚无商品化的产品，有关植物细胞壁伸展研究所
需的仪器均由研究者根据上述方法的基本原理自己设计安装的(Cosgrove, 1989)。李连朝等(1997)
曾报道过一种植物细胞壁伸展性能测定仪，但是仪器结构复杂、零配件多、操作繁琐和不易
掌握。我们设计安装的植物细胞壁伸展测定仪，不仅结构简单、操作方便、易学易用，而
且灵敏度高。利用该仪器，已成功地对蚕豆根、茎、上胚轴和成熟叶片中扩张蛋白的活性
进行了测定，证实在蚕豆根、茎、上胚轴和成熟叶片中均存在扩张蛋白。
1 仪器结构与原理
测定仪的结构如图 1所示，待测材料放置在一个有机玻璃制成的水槽中，为防漏水，接
缝处用凡士林油密封，然后再加入缓冲液。水槽一端是一个可活动的有机玻璃片，用于固定
材料。可动有机玻片的一侧用橡皮筋固定，另一侧用螺钉固定。水槽另一端有一缺口，用
于通过传动装置。材料一端用有机玻片固定，另一端用一小钢夹夹住后，通过一细丝线经滑
轮下垂与动片相连。下胚轴伸长时，传动装置会将运动传递给动片，使其向下运动，动片
与传感器之间的距离发生变化，这种变化经传感器转变为电信号，然后经台式自动记录仪准
图 1 植物细胞壁伸展测定仪结构示意图
Fig.1 Configuration of extensometer
1. Sensor; 2. Moving patch; 3. Sample room; 4. Trestle; 5. Recorder; 6. Sample
314 21(3)
确记录下胚轴的伸展曲线。实验用传感器购自清华大学精密仪器厂，输出为2.5 mV.mm-1，也
可根据实验需求定制。
2 材料和方法
2.1 材料
蚕豆（Vicia faba L.）种子经浸种 12 h后，播在湿蛭石中，27℃暗培养 6 d，分别剪
取顶端约4～5 cm长的上胚轴及根系在-80℃冻存，供提取扩张蛋白用；蚕豆种子经浸种并在
27℃下催芽后，播入营养土中，温室生长 20 d，分别剪取茎和成熟叶片于-80℃冻存，供
提取扩张蛋白用。黄瓜(Cucumis sativus L.)种子经浸种和在-27℃下催芽后，播入湿蛭石中，
27℃暗培养 5 d，剪取子叶下约 3～4 cm长的下胚轴，置于-20℃冰箱中保存 1～5 d，供测
定扩张蛋白活性用。
2.2 扩张蛋白的提取
参照McQueen-Mason (1992)的方法，将-80℃冻存的蚕豆叶片、茎、根和上胚轴约
100 g，加预冷至 4℃的匀浆缓冲液（20 mmol.L-1，NaAc/HAC，1 mmol.L-1 EDTA，pH 4.
5），高速匀浆后，用 70 mm尼龙网过滤，残渣经充分洗涤后，加入扩张蛋白提取液（20
mmol.L-1 Hepes，2 mmol.L-1 EDTA，3 mmol.L-1 NaS2O5，1 mol.L-1 NaCl，pH6.8），4℃
下提取 24 h，过滤，滤液加固体(NH4)2SO4（0.39 g.mL-1），分级沉淀 24 h左右，4℃下离
心（25 000× g, 10 min)沉淀用少量酸性缓冲液（50 mmol.L-1 NaAc/HAC，pH 4.5）复溶，
4℃下对其透析，透析液离心(15 000× g, 10 min)后，上清液即为扩张蛋白提取液，-20℃下
保存备用。蛋白质浓度按汪家政和范明(2002)的方法测定。
2.3 SDS-PAGE及免疫印迹鉴定
参照He (1996)等的方法，分离胶浓度为 12%，电泳凝胶用 Coomassic R-250染色。标准
分子量为华美公司生产（兔磷酸化酶 B 97 kD，牛血清白蛋白 66 kD，兔肌动蛋白 43 kD，牛
碳酸酐酶 31 kD，胰蛋白酶抑制剂 20 kD），抗体由本实验室制备的拟南芥扩张蛋白AtEXP1
抗体①，工作浓度 1∶200，二抗和显色液分别为华美公司生产的碱性磷酸酶标记的 IgG和
NBT/BCIP。
2.4 细胞壁伸展活性的体外重组及测定
细胞壁伸展活性实验参照McQueen-Mason等（1992）的方法，取-20℃下冰冻保存的黄
瓜幼苗下胚轴，迅速用金刚砂（45 mm）稠浆擦破表皮，沸水中煮 20 s，切取顶端 1.5 mm，
置于测定仪的样品室中，先给样品室中注入 1.5 mL酸性缓冲液（pH 4.5），确证细胞壁无伸展
活性后（约需 1 h），抽去酸性缓冲液，加入扩张蛋白提取液（约 6 mg.mL-1）。下胚轴延
伸时，传动装置会将运动传递给动片，使其通过滑轮向下运动，动片与传感器之间的距离变化
转变为电信号，然后经台式自动记录仪准确记录细胞壁的伸展曲线。所有伸展试验均重复3次。
3 结果和分析
3.1 仪器的结构及灵敏度检测
目前，国内外尚无商品化的植物细胞壁伸展测定仪，有关离体细胞壁伸展性研究所需的
①熊艳梅，2002. 拟南芥保卫细胞扩张蛋白表达载体构件、抗血清的制备及初步功能鉴定. 中国农业大学生物
学院植物学系硕士学位论文。
3152004 王文龙等：植物细胞壁伸展测定仪在蚕豆扩张蛋白特性研究中的应用
仪器均由研究者本人自行设计安装(Cosgrove, 1989)，这些仪器多采用杠杆传动和LVDT传感，
仪器结构或简单或复杂，但其核心部件均采用杠杆传动，灵敏度较差。本文中首次采用的传
感器为核心部件，利用传感器将样品的长度变化转变为电信号，再通过自动记录仪记录，大
大提高了仪器的灵敏度，对于连续测定离体组织切段的伸展性效果很好。
过去，已经证实活体黄瓜下胚轴在酸性条件下可以有限伸展，而在中性条件下不能伸展
（McQueen-Mason et al., 1992）。图 2是活体黄瓜幼苗下胚轴在酸性缓冲液（50 mmol.L-1
NaAc/HAC，pH 4.5）和中性缓冲液（50 mmol.L-1 Hepes，pH 6.8）中的伸展特性，表明
外界 H+可以诱导离体细胞壁的伸展，完全符合植物的酸生长学说(Rayle and Cleland, 1992;
Kutschera, 1994); 如果将活体黄瓜下胚轴先在中性缓冲液中伸展30 min，再将缓冲液更换为酸
性缓冲液，结果发现，原来不伸长的黄瓜下胚轴又恢复伸长能力，这说明本测定仪非常灵
敏，完全可以满足实验需求。
3.2 蚕豆中扩张蛋白的鉴定
3.2.1 蚕豆不同器官扩张蛋白的活性检测 分别提取蚕豆根、茎、上胚轴和成熟叶片的扩
张蛋白，然后，以热钝化的黄瓜幼苗下胚轴伸长区段为材料，在酸性缓冲液中分别加入蚕豆
上胚轴、根、茎和成熟叶片中的扩张蛋白提取液(6.0 mg.mL-1)，测定黄瓜下胚轴的伸展活性，
对照为未加蛋白的热钝化黄瓜下胚轴。结果表明，根、茎、叶和上胚轴的扩张蛋白提取液
均可以诱导热钝化的黄瓜下胚轴恢复伸展活性（图 3），说明在蚕豆上胚轴、根、茎和成熟
叶片中均存在扩张蛋白，进一步说明本伸展仪灵敏度较高。
3.2.2 酸碱度对扩张蛋白活性影响 以黄瓜幼苗下胚轴生长区为材料，在酸性（pH 4.5）
和中性（pH 6.8）缓冲液中分别加入相同浓度（6 mg.mL-1）的蚕豆叶片扩张蛋白提取液，
测定黄瓜下胚轴的生长变化。结果表明，pH 4.5时扩张蛋白活性强，pH 6.8时无活性(图 4)，
说明扩张蛋白活性与其环境的酸碱度相关性明显，且在酸性环境下其催化活性较强，在中性
条件下催化活性消失，这与McQueen-Mason等（1992）的研究结果一致，也充分说明我们
所安装的伸展仪灵敏且可靠。
3.2.3 扩张蛋白的提取及免疫印迹鉴定 扩张蛋白是近年来新发现的一种蛋白（McQueen-
Mason et al., 1992），其典型的特点是可以诱导热钝化的黄瓜下胚轴恢复伸展活性。目前，
图 2 酸碱度对活体黄瓜下胚轴生长的影响
Fig.2 The influence of pH on the extension of native cucumber
hypocotyls
已经从20多种植物中克隆到100多
个扩张蛋白基因（http://www.bio.
p s u . e d u / e x p a n s i n s /）。研究证
明，扩张蛋白普遍存在于正在生
长的组织和正在成熟的果实中，
但是，蚕豆中是否存在扩张蛋
白，特别是在成熟的叶片中是否
存在扩张蛋白国内外尚无报道。
为进一步证实测定仪的研究结果，
将所提取的蚕豆上胚轴、根、茎
和成熟叶片的扩张蛋白质经 12%
SDS-PAGE电泳分离，转移至硝酸
316 21(3)
纤维素膜上，经扩张蛋白抗体结合及
酶显色反应。结果显示，在约 25 kD
处均出现特异带（图 5），说明上胚
轴、根、茎和成熟叶片中确实存在扩
张蛋白。这进一步印证了测定仪的研
究结果，说明测定仪所测定的结果真
实且可信，也进一步说明本仪器灵敏
且可靠。
4 讨论
扩张蛋白(expansin)是近年来发现
的一类细胞壁蛋白。由于它可以诱导
热钝化的细胞壁恢复伸展活性，因
此，植物细胞壁伸展测定仪成为研究
图 3 蚕豆不同器官扩张蛋白对热钝化黄瓜下胚轴伸长的影响
Fig.3 The effect of expansins from different organs of Vicia faba on the extension of heat-inactivated cucumber
hypocotyls
图 4 不同 pH条件下扩张蛋白对热钝化黄瓜下胚轴伸长的
影响
Fig.4 The effect of expansins on the extension of heat-inacti-
vated cucumber hypocotyls in different pH buffer
该蛋白不可或缺的仪器之一。为此，我们以电涡流传感器为核心元件装配而成一种新的植物
细胞壁伸展测定仪，具有结构简单、操作方便、测量准确和灵敏度高等优点。由于该仪器
的核心部件灵敏度较高，而且可以根据实验要求定制，因此，是一种较为理想的准确测量植
物细胞壁伸展的自动化仪器。
McQueen-Mason 等(1992)首先从黄瓜下胚轴伸长区同时分离纯化出两种扩张蛋白（29 kD
和 30 kD）以来，已相继从拟南芥（Cho and Cosgrove, 2000）、番茄(Rose et al., 2000)、
草莓(Civello et al., 1999)、水稻(Cho and Kende, 1997)和燕麦胚麦鞘(Li et al., 1993)等多种植物中
发现扩张蛋白的存在，但是蚕豆中是否存在扩张蛋白国内外尚无报道。本研究首次利用植物
3172004 王文龙等：植物细胞壁伸展测定仪在蚕豆扩张蛋白特性研究中的应用
留的扩张蛋白，免疫印迹结果也显示叶片中扩张蛋白的含量较高，进一步说明成熟叶片中确
实存在扩张蛋白而绝非残留。但是，成熟叶片已经停止生长，扩张蛋白在其中起什么作
用呢？这是否意味着扩张蛋白除促进形态建成(Fleming et al., 1997; 1999)、果实成熟
(Cosgrove, 2000)、根毛发生(Cho and Cosgrove, 2002)、细胞扩张 (Cosgrove, 1996; 1997;
1998)、渗透调节(Wu et al. , 1996; Wu and Cosgrove, 2000)和禾本科植物花粉管生长
（Cosgrove, 1997）等功能外还具有其他的功能？目前，我们利用 RT-PCR技术成功地从蚕
豆成熟叶片中克隆到扩张蛋白基因 VfEXP1，从分子水平进一步证实了本研究结果的正确性，
该基因的具体功能正在研究中。
参 考 文 献
李连朝，荆家海，王学臣，1997 . 一种自动化的植物细胞壁伸展性能测定仪及其应用. 植物生理学报，2 3：
363~367
汪家政，范明, 2002. 蛋白质技术手册. 北京：科学出版社，38~39
Cho H T, Cosgrove D J, 2000. Altered expression of expansin modulates leaf growth and pedicel abscission in
Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA, 97:9783~9788
Cho H T, Cosgrove D J, 2002. Regulation of root hair initiation and expansin gene expression in Arabidopsis. Plant
Cell, 14: 3237~3253
Cho H T, Kende H, 1997. Expansins in deepwater rice internodes. Plant Physiol, 113: 1137~1143
Civello P M, Powell A L T, Sabehat A, Bennett A B, 1999. An expansin gene expressed in ripening strawberry fruit.
Plant Physiol, 121:1273~1279
Cosgrove D J, 1989. Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.
Planta, 177:121~130
Cosgrove D J, 1993. Wall extensibility: its nature, measurement and relationship to plant cell growth. New phytol,
124:1~23
Cosgrove D J, 1996. Plant cell enlargement and the action of expansins. BioEssays, 18: 553~540
图 5 蚕豆不同器官扩张蛋白免疫印迹鉴定
Fig.5 Western blot of expansins from different
organs of Vicia faba
M. Molecular weight marker, 1. Hypocotyls
2. Roots, 3. Leaves, 4.Stems
细胞壁伸展测定仪和免疫印迹两种方法证明，
在蚕豆根、茎、上胚轴和成熟叶片中同样存在
扩张蛋白，而且符合扩张蛋白的一般特点，进
一步证实扩张蛋白可能普遍存在于双子叶和单
子叶植物中(Cho and Cosgrove, 1997)。由于实
验用蚕豆根、茎和上胚轴均处在生长阶段，细
胞仍在不同程度地扩大，其中存在扩张蛋白应
是情理之中；而成熟叶片的生长已经完全停
止，细胞的大小不再发生变化，其中不应该再
存在扩张蛋白。关于成熟叶片中是否存在扩张
蛋白国内外目前也尚无报道。本研究利用活性
重组实验和免疫印迹鉴定，首次证明蚕豆成熟
叶片中存在扩张蛋白，而且其活性要明显高于
茎和上胚轴，因此它不可能是叶片生长期所残
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Cosgrove D J, 1997. Creeping walls, softening fruit, and penetrating pollen tubes: the growing roles of expansins. Proc
Natl Acad Sci USA, 94: 5504~5505
Cosgrove D J, 1998. Cell wall loosening by expansins. Plant Physiol, 118:333~339
Cosgrove D J, 2000. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature, 407: 321~326
Fleming A J, Caderas D, Wehrli E, McQueen-Mason S, Kuhlemeier C, 1999. Analysis of expansin-induced morphogen-
esis on the apical meristem of tomato. Planta, 208:166~174
Fleming A J, McQueen-Mason S, Mandel T, Kuhlemeier C, 1997. Induction of leaf primordia by the cell wall protein
expansin. Science, 276: 1415~1418
Rose J K C, Cosgrove D J, Albersheim P, Darvill A G, Bennett A B, 2000. Detection of expansin proteins and activity
during tomato fruit ontogeny. Plant Physiol, 123:1583~1592
Kutschera U, 1994. The current status of the acid-growth hypothesis. New Phytol, 126:549~569
Li Z C, Durachko D M, Cosgrove D J, 1993. An oat coleoptile wall protein that induces wall extension in vitro and that
is antigenically related to a similar protein from cucumber hypocotyls. Planta, 191:349~356
McQueen-Mason S, Daniel M D, Cosgrove D J, 1992. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in
plants. Plant Cell, 4:1425~1433
Rayle D L, Cleland R E, 1992. The acid growth theory of auxin-induced cell elongation is alive and well. Plant Physiol,
99:1271~1274
Ruan Y L, Llewellyn D J, Furbank R T, 2001. The control of single-celled cotton fiber elongation by developmentally
reversible gating of plasmodesmata and coordinated expression of sucrose and K+ transporters and expansin.
Plant Cell, 13:47~60
Wu Y J, Cosgrove D J, 2000. Adaptation of roots to low water potentials by changes in cell wall extensibility and cell
wall proteins. J Exp Bot, 51:1543~1553
Wu Y J, Sharp R E, Durachko D M, Cosgrove D J, 1996. Growth maintenance of the maize primary root at low water
potentials involves increases in cell wall extension properties, expansin activity, and wall susceptibility to
expansins. Plant Physiol, 111: 765~772
Zhang N, Hasenstein K H, 2000. Distribution of expansins in graviresponding maize roots. Plant Cell Physiol, 41:
1305~1312