全 文 ：植物学通报 2004, 21 (2): 129~138
Chinese Bulletin of Botany
①北京市自然科学基金重点资助项目（5 0 2 1 0 0 1）。
②通讯作者。Auth or for correspondence.
作者简介：赵奂，男，1 9 7 9 年 1 月生，首都师范大学生物系硕士研究生。刘祥林，男，1 9 5 2 年 9 月
生，副教授，从事植物分子生物学研究。
收稿日期：2003-03-18 接受日期：2003-07-15 责任编辑：白羽红
植物分子生物学研究极具前景的模式
系统——小立碗藓①
赵 奂 赵晓刚 何奕昆 刘祥林②
（首都师范大学生物系 北京 100037）
摘要 小立碗藓作为植物分子生物学研究极具前景的模式系统已日益受到人们的重视，它的生活史周
期短，易于培养，转基因植株易于分析，核基因组容易和外源D N A发生同源重组，这些特点使它
成为研究基因功能的良好材料。一些成功的基因敲除和基因破坏已经在小立碗藓中实现，这些基因的
功能也通过小立碗藓转化植株的特点得以证实。小立碗藓标签突变文库已经建立，其应用为小立碗藓
基因的进一步研究打下了基础。关于小立碗藓的ESTs数据库已经建立，已有 67 000条ESTs信息。
关键词 小立碗藓，分子生物学，模式植物，基因重组，转化
Physcomitrella patens, a Potential Model System
in Plant Molecular Biology
ZHAO Huan ZHAO Xiao-Gang HE Yi-Kun LIU Xiang-Lin ②
(Department of Biology, Capital Normal University, Beijing 100037)
Abstract The moss Physcomitrella patens is now often used as a model system in plant molecular
biology. Its short life cycle, easy to culture, transformant analysis and allele replacement make it an
excellent material for studying plant molecular biology. Some gene targetings have succeeded and the
function of these genes has been proved. Tagged mutant library has been established for the further
researches of Physcomitrella patens. The ESTs datebase on Physcomitrella patens which contains
almost 67 000 ESTs has been established.
Key words Physcomitrella patens, Molecular biology, Model system, Gene recombination, Trans-
formation
小立碗藓（Physcomitrella patens）在分类上属于葫芦藓科，小立碗藓属，分布于欧洲、亚
洲、非洲及大洋洲，我国湖南省张家界地区有分布(李登科和吴鹏程，1995)。小立碗藓植物体
矮小，黄绿色，有光泽，稀疏丛集。其茎细而短。叶片呈卵形或披针形，茎基部的叶较小，
综述与专论
130 21(2)
中肋单一、细长。蒴柄短粗，孢蒴呈圆球形或梨形，对称、不伸出叶丛，无蒴盖分化，孢蒴
成熟后不规则开裂，蒴齿缺如，蒴帽极小，呈钟形。成熟后基部四瓣浅裂。孢子呈球状肾型
(高谦和张大成, 2000)。
小立碗藓是一种非常理想的植物分子生物学研究材料。它生长所需营养简单，容易培养；
其配子体在生活史中占优势，对其突变体的表型可以进行直接研究；其核基因组易于与有同源
片段的外源DNA发生高频率的同源重组，从而使得精确的基因破坏和基因敲除成为可能，为基
因功能的研究提供了良好的材料。小立碗藓与高等陆生植物有很多相似特点，而小立碗藓的一
些特性使得它比其他植物更易于进行分子生物学的研究。小立碗藓在国外已经成为植物分子生
物学研究的模式植物。在我国，研究小立碗藓的工作也已开始。
1 小立碗藓的研究历史
对小立碗藓较早的研究始于20世纪60年代。Engel(1968)成功的分离出小立碗藓的硫胺素和
烟酸的营养缺陷型突变株。 随后，一些科学家对小立碗藓的发育遗传学作了深入的研究,他们
利用化学诱变诱导出几种生化突变体和发育突变体(Engel, 1968; Ashton and Cove, 1977; Ashton
et al., 1979; Abel et al., 1989)。在此期间,小立碗藓的杂交实验也在进行,小立碗藓虽然是自交系
统，但其营养缺陷型，在缺乏营养条件下是自交不育的，不同营养缺陷型杂交可以通过互补作
用产生可育孢子体 (Engel, 1968; Ashton and Cove, 1977; Courtice et al., 1978)。这一时期的另一
个重要成果是利用PEG介导原生质体融合试验成功(Grimsley e t a l ., 1977)。1992年，Cove和
Knight(1993)完成了对小立碗藓生活史各个阶段的培养。这些工作为小立碗藓的研究打下了良
好的基础。
对小立碗藓分子水平上的研究始于20世纪90年代。Schaefer等(1991)利用PEG成功地将抗性
基因转入小立碗藓，使小立碗藓成为第一例转基因成功的苔藓。接着，利用基因枪法对小立碗
藓的转化又获得成功(Knight et al., 1995)。小立碗藓核DNA被证明极易与外源片段发生同源重
组（Kammerer and Cove, 1996；Schaefer and Zr?d, 1997），这是小立碗藓研究史上的重大突破，
为日后多种基因在小立碗藓中的敲除奠定了理论和实践基础。在这之后，科学家纷纷开始以小
立碗藓为试验材料，对所研究的基因进行敲除，以研究该基因的功能，其中所研究的基因有：
调节叶绿体分裂的ftsZ(Strepp et al., 1998)，26S蛋白酶体的一个亚基MCB1基因(Girod et al., 1999)，
一种保守的叶绿素结合蛋白Cab基因(Hoffman et al., 1999)，细胞外蛋白Expansins基因(Schipper
et al., 2002)，D6-延长酶PSE1基因 (Zank et al., 2002)，腺苷5-磷酸硫酸盐降解酶基因(Koprivova
et al.，2002)，一种在蛋白质折叠过程中重要的酶PID-like基因(Meiri et al., 2002)以及一种与蓝光
接受有关的隐花色素Cryptochrome基因(Imaizumi et al.,2002)。
20世纪90年代末，生物学的一些新技术开始在小立碗藓的研究中得到应用，这其中包括小
立碗藓ESTs数据库的建立(Machuka et al., 1999; Nishiyama et al., 2003)和利用半连续式光合自养
生物反应器(semi-continuous photoautotrophic bioreactor)对原生质体进行大量的培养(Reutter and
Reski, 1996; Hohe et al., 2002; Schween et al.，2003b)。
小立碗藓的研究在世界上已受到普遍的重视。在2001年的日本苔藓国际会议上,一半以上都
是关于小立碗藓的文章，其中很多文章是关于新基因的获得及功能的初步鉴定。
我国对小立碗藓的研究是从中国科学院植物研究所开始的。1995年，李登科和吴鹏程报道

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3 小立碗藓的培养方法
小立碗藓生长所需营养较简单，容易培养。可以用水培或用只含无机盐的培养基培养。
通常情况下，用铺有琼脂的培养皿或盛有水的锥形瓶培养即可(Cove et al., 1997)。小立碗藓再
生能力强，从配子体取下的任何组织都可以继续培养，而新生的原生组织生长最快(Cove and
Knight, 1993)。
一个得到原生组织的简单方法是将原生组织匀浆并接种于新鲜琼脂培养基上。在上面覆盖
一层玻璃纸可以减缓组织的生长速度，简化最终得到的组织。一周后，培养得到的组织大部分
由绿丝体细胞组成，是获得原生质体良好材料。一个标准培养皿（直径90 mm）接种一周可得
到干重50 mg的组织（25℃,白光）。用纤维素酶消化可以得到5×10 6个原生质体。小立碗藓
在22~27℃的环境中，生长最迅速，15℃时生长缓慢，但这个温度可以诱导配子体产生。植物
体在连续光照条件下生长良好，16 h光照、8 h黑暗的周期处理可以诱导原丝体组织的分化
( C o v e，2000)。
培养小立碗藓的原生质体可以利用半连续式光合自养生物反应器(semi-continuous photoau-
totrophic bioreactor)，使用这种方法不但可以获得用于转化的大量原生质体，并且可以利用小立
碗藓的原生质体生产蛋白。利用添加2.5 mmol/L酒石酸铵的Knop培养液，通入含2%CO2的空
气，pH值控制在4.5~7.0，可得到最大比生长速率（specific growth rate）为0.57/d。利用5 L的
生物反应器每天可得到1 100 mL的悬浮培养物，稀释率为22%(Hohe et al., 2002)。在培养基中
添加一些微量元素和一些辅酶、维生素等可以提高原生质体培养的最大成活率(Schween et al.，
2003b)。
利用生物反应器培养的目的之一是培养用于转基因的原生质体，因此，保证原生质体的同
步生长和减少细胞分化显得尤为重要，目前的方法是加入酒石酸铵促使细胞同步生长(Hohe et al.,
2002)。酒石酸铵能够阻止轴丝体的形成(Hohe and Reski, 2002)。进一步的实验证明，绿丝体
细胞处于G2期的细胞占多数，而轴丝体细胞处于G1期的细胞占多数，酒石酸铵阻止轴丝体形成
的原因可能是其对细胞周期的影响(Schween et al., 2003a)。
得到的小立碗藓突变体可以保存在液氮里, 但是其组织在冷冻和解冻过程中可能死亡，如果
不进行继代培养，将组织密封于培养皿中，置于15℃条件下，则至少可保持一年(Grimsley and
Withers, 1983)。
4 小立碗藓的分子生物学特点
与其他苔藓植物相比，小立碗藓的染色体较多，有27条(Reski et al., 1994)。利用流式细胞
仪(flow cytometry, FCM)分析得到的小立碗藓核基因组大约为511 Mb (Schween et al., 2003a)，比
一般开花植物的基因组低。Southern杂交表明：小立碗藓基因组中至少含有一个高度重复序列
的基因家族。温度变性试验表明：基因组中G+C含量为34.6%(Rscki, 1998)。
小立碗藓的基因组与其有同源序列的外源DNA片段易于发生同源重组。在某个小立碗藓的
转基因品系中，用相同的质粒对其进行再次转化，结果发现，原来转入的基因发生沉默，基因
分析表明: 第二次质粒的插入位点在第一次获得该转基因品系的质粒的插入位点上或在其附近
(Kammerer and Cove, 1996)。这表明在第二次转化过程中转入的质粒与重组品系的基因组之间
1332004 赵 奂 等：植物分子生物学研究极具前景的模式系统——小立碗藓
发生了同源重组。这就使基因打靶技术在小立碗藓中成为可能。对高等陆生植物进行转基因，
含有同源序列的质粒与基因组发生同源重组的几率很小，只有0.01%~0.1%(Hoffman et al., 1999)。
而在小立碗藓中，同源重组率大得多。表1归纳了一些近年来发表的在小立碗藓中发生同源重
组的结果。
5 小立碗藓的转化
植物转化常用的方法有农杆菌介导法、电激法、PEG介导法、基因枪法等，效果较好的是
表 1 转化植株的同源重组结果
Table 1 The result of homologous recombination in the transformated plant
同源重组基 转化使用 同源序列长度 分析的转基 同源重 使用的 DNA 同源重组率 参考文献
因位点 Transform- Length of 因个体数 组个数 DNA used Percent of Reference
Locus of the ation with homology Number of Number of homology
homology 1 2 transgenics homology (%)
analyzed
转基因位点 质粒 1.8 kb 3 3 基因组 DNA 100 Kammerer and Cove, 1996
Transgenics Plasmid Genomic DNA
转基因位点 质粒 3.0 kb 7 6 基因组 DNA 86 Kammerer and Cove, 1996
Transgenics Plasmid Genomic DNA
基因组随机序列 质粒 3.6 kb 6 6 基因组 DNA 100 Schaefer and Zrÿd, 1997
Random genomic Plasmid Genomic DNA
sequence
基因组随机序列 质粒 2.7 kb 4 4 基因组 DNA
Random genomic Plasmid Genomic DNA 100 Schaefer and Zrÿd, 1997
sequence
基因组随机序列
Random genomic 质粒 2.3 kb 6 4 基因组 DNA
sequence Plasmid Genomic DNA 67 Schaefer and Zrÿd, 1997
Cab 质粒 1 kb 9 3 基因组 DNA
Plasmid Genomic DNA 33 Hoffman et al., 1999
CRY1a 质粒 4.6 kb 2 2 基因组 DNA
Plasmid Genomic DNA 100 Imaizumi et al., 2002
CRY1b 质粒 4.3 kb 2 2 基因组 DNA
Plasmid Genomic DNA 100 Imaizumi et al., 2002
Aps 片段 847 b 771 b 8 8 基因组 DNA
Fragment Genomic DNA 100 Koprivova et al.，2002
Des 6 片段 900 b 900 b 5 5 基因组 DNA
Fragment Genomic DNA 100 Girke et al., 1998
Exp 片段 412 b 841 b 10 0 cDNA 0 Schipper et al., 2002
Fragment
Exp 片段 432 b 263 b 10 1 cDNA 10 Schipper et al., 2002
Fragment
Exp 片段 430 b 494 b 5 4 cDNA 80 Schipper et al., 2002
Fragment
Exp 片段 387 b 408 b 4 4 cDNA 100 Schipper et al., 2002
Fragment
Exp 片段 616 b 282 b 5 4 cDNA 80 Schipper et al., 2002
Fragment
Fts Z 片段 247 b 685 b 51 7 cDNA 14 Strepp et al., 1998
Fragment
Mcb 片段 435 b 420 b 55 2 cDNA 4 Girod et al., 1999
Fragment
134 21(2)
农杆菌介导法，但由于农杆菌不侵染苔藓植物而无法使用。对小立碗藓进行转化的方法主要是
PEG介导法和基因枪法。第一例对小立碗藓的成功转化是利用PEG法转入抗性基因(Schaefer et
al., 1991)，基因枪法转化小立碗藓于1995年获得成功(Knight et al., 1995)。两种转化方法的转化
效率是不同的，使用两种方法每次得到的转基因植株的数量基本相等。但是，PEG介导法每次
需要更多的DNA(20 mg)，基因枪法每次需要对材料喷射两次，每次需要1 mg。因此，就每微克
DNA的转化效率而言，基因枪法的转化率比PEG介导法的高。
利用抗性质粒转化的小立碗藓，不管通过上述两种转化方法中的那一种，得到的转基因植
株一般都有3种表型：暂时抗性、弱抗性和强抗性。转基因后，有些转化株的抗性会逐渐消
失；在抗性持续的转化株中，很多只能显示弱抗性，把这些突变株移到非选择型培养基中，
14 d后转化株的抗性便消失，这种转化株属于非整合型，由外源DNA构建的重组体以质粒的形
式存在于细胞染色体外；有很少一部分显示出强抗性，转入非选择性培养基后，抗性不消失，
分子生物学分析证明：外源DNA已与基因组整合(Ashton et al., 2000)。通常多拷贝的质粒插
入染色体的相同位点。
6 小立碗藓基因的同源重组
基因打靶技术是研究基因功能的实用方法，它是利用同源重组将细胞的某一特定基因破坏
或敲除，得到的突变型失去该基因的功能，通过这种方法，基因的功能就可以得到确定。基因
打靶技术在酵母和细菌以及小鼠细胞的研究中取得了很好的效果，但是在植物中，外源DNA片
段与基因组发生同源重组的频率很小，所以通常植物的基因打靶很难实现。而小立碗藓基因组
很容易与外来片段发生同源重组，这就使精确的基因打靶技术在植物中的应用成为可能(Schaefer,
2002)。通过同源重组技术已获得了一些缺失某一特定功能基因的突变株。
Strepp等(1998)破坏了小立碗藓的ftsZ1基因。ftsZ是控制原核生物分裂的基因，它编码的FtsZ
蛋白与微管蛋白结构上有相似的特点。在小立碗藓中ftsZ1存在于核基因组中，控制叶绿体的分
裂。野生型小立碗藓每个细胞中大约有50个叶绿体，而敲除了ftsZ1的小立碗藓细胞中含有一个
大的叶绿体，从而证明了ftsZ1在叶绿体分裂过程中的作用。
由腺苷5-磷酸硫酸盐降解酶催化的腺苷5-磷酸硫酸盐（APS）的降解是高等植物中硫酸盐消
化的关键步骤。有人提出，在植物中还存在着磷酸腺苷5-磷酸硫酸盐（PAPS）支路，但其相
关酶磷酸腺苷5-磷酸硫酸盐降解酶是否在植物体中存在并不能确定。Koprivova等(2002)利用同
源重组技术将小立碗藓中编码腺苷5-磷酸硫酸盐降解酶的基因破坏，使其不能正常转录，酶活
性完全丧失。结果发现，转化得到的植株仍可利用硫酸盐作为惟一硫源。结果证明了PAPS支
路在小立碗藓中的存在。
26S蛋白酶体是泛素介导的蛋白质降解途径中的主要蛋白酶，MCB1是蛋白酶体的一个亚基。
26S蛋白酶体存在于所有真核生物，而其功能尚待阐明。敲除MCB1基因的酵母并不表现出表型
上的突变，而小鼠则表现出胚胎阶段致死(Kawahara et al., 2000)。Girod等(1999)敲除了小立碗
藓的MCB1基因，结果表现为其轴丝体不能发育成芽和配子托。
7 表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)在小立碗藓中的应用
表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)是通过对随机挑选的cDNA克隆进行3端或5端
1352004 赵 奂 等：植物分子生物学研究极具前景的模式系统——小立碗藓
的测序鉴定出该cDNA中一单边的序列，一般长度为300~500 bp。近年来，ESTs数据库的发展
十分迅速，公共数据库中可查到的关于小立碗藓的ESTs已达67 000条，来自不同组织的cDNA代
表了小立碗藓整个生活史的基因表达情况(Rensing et al., 2002)。
利用小立碗藓的ESTs数据库一方面可以寻找其新基因，另一方面可以通过与其他植物ESTs
数据的对比，探索基因的同源性。经ABA处理的小立碗藓cDNA文库的ESTs中，有69%与已知
序列有同源性，61%与植物起源的序列有明显的同源性，其中11个基因与ABA诱导基因有同源
性(Machuka et al., 1999)。对经生长素、细胞分裂素处理的以及未经处理的小立碗藓的富集cDNA
文库进行测序，得到的ESTs表明：在15 883个可能的基因中，有9 907个与已知维管植物基因高
度相似，占所分析基因总数的6 2 %。分析还表明，6 6 %的拟南芥基因与小立碗藓有同源性
(Nishiyama et al., 2003)。
ESTs数据库的建立和使用是基因组学研究的重要方法，它的特点是每次检测的基因数量大，
并且可以与所作的相应处理对应起来，推测基因功能。但ESTs数据库要与其他基因组学方法
（如基因芯片技术、基因全序列分析等）相结合使用才能发挥更大的作用。在小立碗藓中，很
多基因组学的方法还没有得到应用。
8 小立碗藓标记突变文库(tagged mutant library)的建立
近年来，标记突变文库(tagged mutant library)已经建立，小立碗藓的基因功能可以利用标记
突变文库进行研究。其主要步骤是，首先，要在大肠杆菌中构建一个小立碗藓的基因文库。
小立碗藓文库是构建在适于穿梭突变的细菌质粒载体上的，插入片段大约3.5~6 kb。其次，将
小转座子随机插入到小立碗藓文库，从而获得标记突变文库。通过这种处理，就可能在小立碗
藓的基因内部插入片段，从而使该基因失活。最后，用突变标记文库对小立碗藓进行转化，方
法是将标记突变文库中的质粒提出，并对小立碗藓的原生质体进行转化，如果转座子插入到小
立碗藓的基因中，那么，转座子两端就是原来小立碗藓的基因序列，这样，转化后，同源重组
就容易发生，而该基因也随之被破坏(Egener et al., 2002)。
标记突变文库的建立有两种策略，一种是利用小立碗藓的基因组文库获得标记突变文库，
另一种是通过cDNA文库构建标记突变文库。利用基因组文库获得标记突变文库方法的缺点
是：转座子插入所破坏的并不一定是功能基因，而有可能是功能基因以外的DNA序列，这样，
利用突变标记文库转化的小立碗藓突变株许多是无效的。反之，如果利用cDNA文库构建标记
突变文库，由于cDNA文库同源序列的连续性差，转化效率也会降低(Cove, 2000)。表1所列的
一些转化植株的同源重组率也证明了这一点。
目前，已经利用标记突变文库对小立碗藓进行转化，Egener等(2002)用转座子Tn1000对小立
碗藓低频重复cDNA文库进行诱变，用所得的基因标记文库转化小立碗藓，在16 203株转化个体
中有2 636株与野生型不同，占总数的16.2%。
9 展望
小立碗藓作为植物分子生物学的研究材料，有着其他材料无法比拟的优势。它容易培养，
突变型易于分析，基因组容易和外源基因发生同源重组，这些特点使它成为研究基因功能的良
好材料。一些成功的基因敲除和破坏也从实践上证明了这一点。小立碗藓标记突变文库的建
136 21(2)
立为小立碗藓基因的进一步研究打下了基础。但是，由于小立碗藓是新兴的植物分子生物学模
式系统，对它的研究还有很多不足之处。
首先，小立碗藓的研究平台还不完善。在国际上，并没有小立碗藓核基因组物理图谱的发
表，由此可见，小立碗藓核基因组的测序工作尚未进行。核基因组包含整个植物体的全部信
息，一些不转录的信息（如启动子、内含子），通过ESTs是无法研究的，但都可以在序列图中
得到反映，所以，对基因组的测序是对小立碗藓基因组进行高通量研究的基础。在国内，一方
面，建立分子生物学研究所必要的小立碗藓cDNA文库和基因组DNA文库是非常迫切的；另一
方面，随着小立碗藓研究的广泛进行，需要利用半连续式光合自养生物反应器获得大量原生质
体 。
其次，对小立碗藓同源重组率高的机理的研究工作不够。现在科学家往往把精力集中在通
过基因敲除研究某一基因的功能上。然而，小立碗藓的基因组只能代表所有陆生植物基因的一
部分，而大量的基因并不能通过基因敲除进行研究。那么是否可以通过研究并应用小立碗藓基
因同源重组率高的机理来解决这一问题呢？科学家已经开始研究小立碗藓同源重组的机理，一
种与同源重组有关的蛋白RAD51的基因已经从小立碗藓的基因组中分离出来(Markmann-Mulisch
et al., 2002)。有的观点认为，小立碗藓的同源重组率高与其特殊的细胞周期有关(Schween et al.,
2003a)，但这方面的工作还很有限，距离同源重组机理的说明还有相当的差距。
最后，对小立碗藓特有基因的研究较少。小立碗藓这一系统的诱人之处在于其核基因组能
够高频率地与外源片段发生同源重组，实现基因打靶，这就为研究未知基因功能提供了良好的
条件。但是，现在所进行的基因打靶多数集中在已知功能的基因中，对功能未知的基因进行得
较少，从小立碗藓的ESTs文库的信息中，我们了解到，这种植物有很大一部分基因是特有的
(Nishiyama et al., 2003)，与已知基因没有同源性，这些基因无疑可以丰富植物基因资源，对于
植物分子生物学的发展和应用都是极有益的。
小立碗藓本身所表现出的分子生物学特点是非常诱人的，它与高等陆生植物基因的相似性
更成为解决在高等植物中难以解决问题的有利工具。随着对小立碗藓这一系统的研究，小立碗
藓有希望成为新的分子生物学模式植物并对植物分子生物学的发展起到促进作用。
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