全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (1): 112-120, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-10-24; 接受日期: 2007-05-15
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30370087)和教育部“春晖计划”(No. Z2004-1-62002)
* 通讯作者。E-mail: w angcy@lzu.edu.cn
.专题介绍.
T-DNA介导的基因诱捕技术及其在植物功能
基因组学研究中的应用
杨珍珍, 李萍, 王崇英 *
兰州大学生命科学学院, 细胞生物学研究所, 兰州 730000
摘要 T-DNA介导的基因诱捕技术是近年来发展起来的鉴定和分离基因的方法。在拟南芥和水稻基因组测序已经完成的今
天, 该技术将在两者基因功能的研究中扮演举足轻重的角色。本文就T-DNA介导的基因诱捕系统、 基因克隆和突变体库构建
的研究进展及其在植物功能基因组学上的应用等内容进行了综述, 并讨论了该技术应用中的一些问题。
关键词 功能分析, 基因鉴定, 基因诱捕, 突变体库, T-DNA
杨珍珍 , 李萍 , 王崇英 (2008). T-DNA介导的基因诱捕技术及其在植物功能基因组学研究中的应用. 植物学通报 25, 112-120.
随着拟南芥和水稻基因组测序工作的完成, 功能基
因组学成为生物科学当前的研究热点。功能基因组学
的主要研究内容包括基因的识别、鉴定和克隆, 基因结
构、表达调控、功能分析以及基因相互作用等。近些
年来, 利用转座子和T-DNA作为转化载体的基因诱捕技
术为植物基因分离、鉴定和功能分析的研究提供了强
有力的工具。T-DNA 介导的基因诱捕技术是以 T-DNA
作为转化载体, 对其进行适当修改后整合报告基因, 通过
报告基因的表达来研究目的基因表达并进而分离、鉴
定基因的一门遗传学技术。其基本原理是将含有已知
DNA序列的T-DNA 载体通过转化插入到受体基因组中,
使插入位点基因的功能缺失或获得从而造成突变, 并在
被诱捕序列启动子的控制下表达插入的报告基因, 以鉴
定可见或非可见的突变。T-DNA 不仅可作为诱变剂产
生大量突变体, 而且转化载体中的报告基因还可作为克
隆整合位点内源基因的标签, 分离和鉴定突变体相关基
因。到目前为止, 通过基因诱捕已经发现了很多新基
因。在拟南芥已经克隆的 620多个有表型的突变体基
因中, 有 40% 是通过 T-DNA 介导的基因诱捕技术分离
的(Meinke and Scholl, 2003)。
随着新技术新方法的不断发展, 分析鉴定基因功能
的方法越来越多, 但最直接最有效的方法是构建饱和的
基因突变群体, 通过突变体分析鉴定基因功能。因此突
变群体的构建是功能基因组学的基础。随着农杆菌介
导的植物转基因技术的不断完善, 通过创造大量的 T-
DNA 独立转化子来建立 T-DNA 突变体库的方法已成
为快速构建插入突变体库的主要方法。 至今已构建了
225 000多个拟南芥 T-DNA 插入突变体, 获得了 360
000个 T-DNA 插入位点序列, 这几乎可以代表拟南芥
的整个基因组(Li and Zhang, 2006)。同样, 科学家
们构建了 200 000个水稻T-DNA插入系, 这些突变体
库已经比较大, 可以从中以 90% 的几率找到一个特定
的基因(An and Lee, 2005)。现在利用 T-DNA 突变
体库分离和鉴定基因功能的报道越来越多, 说明其在植
物功能基因组学中的应用潜力很大。目前拟南芥和水
稻等植物的基因组测序已经完成, 人们正想尽办法将这
庞大的新遗传信息与基因功能联系起来。为此本文将
主要介绍 T-DNA 介导的基因诱捕技术在植物基因分
离、突变体库构建以及在功能基因组学研究中的应用
及进展。
113杨珍珍等: T-DNA介导的基因诱捕技术及其在植物功能基因组学研究中的应用
1 T-DNA基因诱捕载体的发展
根据所构建的报告基因的结构, 目前已建立了 3种 T-
DNA 基因诱捕类型: 启动子诱捕、增强子诱捕和基因
诱捕, 关于它们的基本原理及其结构已经有很多报道
(Tang et al. , 2001; 江树业等, 2003; Li and Zhang,
2006)。近些年来, 研究者们在传统诱捕系统载体的基
础上发展了一些新的载体系统。 一个应用较广的增强子
诱捕系统是GAL4/VP16-UAS-报告基因系统。在此系
统中, 带有弱启动子的 GAL4基因定位于T-DNA的右边
界, 报告基因与 GAL4上游活化序列 UAS(upstream
activating sequence)融合, UAS 可与GAL4结合并激
活其表达, 所以报告基因的表达就可反映GAL4的表
达。还有一个较新的增强子诱捕载体是 pOp/LhG4系
统, 它由一个融合了报告基因的人工启动子 pOp和一个
转录激活子LhG4组成, LhG4能有效地受化学诱导而激
活 pOp表达, 所以可以了解受诱导的、组织特异性表达
的目的基因的表达模式, 该载体系统已成功应用于烟草
和番茄中(Moore et al. , 2006)。 至今, 这些诱捕系统
在分离和鉴定基因功能中发挥了巨大作用, 尤其是在新
基因的克隆和鉴定中。韩国的一个实验室利用启动子
诱捕技术, 从日本产水稻的T-DNA插入系中分离到一个
与花粉发育有关的基因RIP1 (RICE IMMATURE POL-
LEN 1)。通过各种分析方法, 发现 rip1突变体的花粉发
育延迟, 而且花粉的内壁层和淀粉粒的形成也被延迟了
(Han et al. , 2006)。
此外, 人们还构建了激活标签系统。此种标签系统
可以产生功能获得性突变体, 能够研究功能冗余或具有
高度多效性以及致死效应基因的功能。例如用此种方
法已经分离了拟南芥中控制叶柄发育的基因 LEP 以及
与茎秆强度有关的基因 STURDY等 30多种新基因, 并
对 FT (FLOWERING LOCUS T)、MYB 和生长素相关
基因进行了详细的研究 (郑继刚和李成梅, 2003)。 Ahn
等(2006)用激活标签法获得了80 650个独立的拟南芥转
化体, 从中分离了 129个发育异常的突变体, 并对它们
的 T-DNA插入位点进行了定位。利用携带有 35S 启动
子的 T-DNA 构建功能获得性突变体库在一定程度上克
服了传统方法的局限性, 但35S 启动子组成型表达同样
会造成一些致死性突变。因而, 近两年来发展了一种高
效且严格依赖于动物雌激素诱导的植物表达系统, 即化
学诱导型启动子XVE 系统, 从而解决了致死性突变的问
题。XVE 是一个融合转录因子, 分别表示细菌转录抑
制子 Lex的 DNA结合域(X)、病毒转录激活子 VP16的
转录激活域(V)及人类雌激素受体的调节亚基(E)。XVE
表达载体携带一个由人工合成的强组成型启动子G10-
90及一个由35S基础启动子和8个拷贝的LexA操纵子
序列融合形成的人工启动子。在G10-90 启动子的控
制下, XVE 融合转录因子组成型表达; 当加入雌激素后,
雌激素与其受体结合, 导致XVE融合蛋白构像发生改变,
并由细胞质转移进入核内, LexA 的DNA 结合域特异性
识别LexA操纵子区, 使VP16的转录激活域激活35S基
础启动子, 高水平表达其下游的目的基因。 靶基因的功
能获得和缺失受到 XVE化学诱导表达系统的严格控制,
使得被标记遗传学位点的表型可以在给定的发育时期表
达。张健等(2005)利用该系统构建了一个包含 40 000
余个独立转化株系的拟南芥突变体库, 并对代表性突变
体的表型和T-DNA插入位点侧翼序列进行了分析, 结果
表明突变表型就是由于 T-DNA 的插入造成的, 而且这
些突变位点中包括前人发现的 AP2 和 AGAMOUS 的
等位基因。
2 T-DNA诱捕基因的克隆及其数据库的
建立
2.1 T-DNA诱捕基因的克隆
应用基因诱捕的最终目的在于获得被 T-DNA 标记的植
物基因。为了鉴定基因诱捕系统中控制报告基因表达
的目标基因, 这就需要一种能从植物基因组中找出插入
位点侧翼DNA 序列的方法, 来确定产生特定表型的基
因。目前最常用且比较有效地用于 T-DNA 诱捕基因的
克隆方法是质粒拯救(plasmid rescue)和 TAIL-PCR
(thermal asymmetric interlaced PCR)法。 质粒拯救
法是从植物突变体中分离到基因组DNA后, 用一种限制
性内切酶进行完全酶切, 经过 Southern杂交后, 将含有
114 植物学通报 25(1) 2008
T-DNA的DNA片段与克隆载体连接, 转化大肠杆菌, 筛
选阳性克隆, 提取质粒 DNA 后测序(Walden, 2002)。
TAIL-PCR法是根据已知的T-DNA序列设计3个嵌套的
特异性引物, 分别与简并引物组合, 进行连续的 PCR循
环, 利用不同的退火温度选择性地扩增, 使 T-DNA 及
其侧翼DNA序列成为主要的扩增对象, 所获得的片段可
以直接用作探针标记和测序模板。Sessions 等(2002)
用此方法从分离的 52 964个拟南芥 T-DNA插入系中获
得了 85 108个插入位点序列。至 2006年, 研究人员已
用此方法从 18 709个水稻 T-DNA 转化系中获得了 20
497个 FSTs, 其中大约有 56.18% (11 992 FSTs)已准
确定位于水稻的基因组中(Hs ing et al., 2007)。
质粒拯救法的效率主要取决于基因组 DNA 转化到
宿主细胞的效率; 而影响 TAIL-PCR效率的关键在于 T-
DNA边界序列的完整性, 当边界序列碱基缺失过大时会
影响到TAIL-PCR的效率, 甚至使TAIL-PCR失败, 此时
可用质粒拯救法获得侧翼序列。当 T-DNA 插入比较复
杂且用其它方法难以分离时, 构建突变体基因组文库, 用
与 T-DNA 左边或右边同源的序列从完整的或不完整的
基因组文库中获得 T-DNA及其侧翼 DNA序列是一个可
行的办法(杨奇志等, 2004)。研究表明, 质粒拯救法从
水稻转基因植株获得侧翼序列的效率是 72%, 比 TAIL-
PCR法高 18% (张帆等, 2004)。 如果基因诱捕插入导
致转录融合, 就可以用 5-RACE-PCR技术 (cDNA末端
快速扩增技术)扩增插入上游的外显子序列。 这种方法
对于鉴定相对高丰度表达的基因相当有效。因为
RACE-PCR技术扩增的是外显子序列, 可以直接用作探
针筛选 cDNA 文库, 从而获得目标基因 (Tang et al. ,
2001; 江树业等, 2003)。
2.2 T-DNA插入位点数据库的建立
T-DNA两端序列被测定后, 就可在基因数据库中进行检
索, 通过与已知基因序列(包括核苷酸序列、mRNA 序
列和蛋白质序列)的同源性比较可以预测许多未知基因的
假定功能, 确定相应T-DNA插入的图谱位置和插入区内
的基因及其候选基因。建立一个 T-DNA 插入位点的数
据库显得十分必要, 这种数据库一旦建立就会极大地方
便其他研究人员。至今, 大量的标签系和 F S T s
(flanking sequence of T-DNA tags)数据库及其网站已
经建立。这些都将会方便相关基因独立突变系的鉴
定。拟南芥的 FSTs 数据库早已建立, 从这些数据中不
仅可以获知序列信息, 还可知道T-DNA在植物染色体上
的分布。GABI-Kat Simple Search ( ht tp: / /www.
GABI-Kat . de) 是由德国科学家创建的一个专门的拟南
芥 T-DNA 插入突变体库。该数据库包含了 108 000多
个已定位的 FSTs。 这些 FSTs 覆盖了 64% 的已经注
释过的拟南芥蛋白编码基因, 该库已在2002年对外开放
(Li et al. , 2007)。另外, 还有 2个主要的对外开放的
拟南芥 FSTs 数据库, 即 SIGnAL(ht tp: / /signal.salk .
edu/)和 FLAGdb(http://genoplante-info.infobiogen.fr),
它们都包括了大量的拟南芥 T-DNA 侧翼位点和突变基
因的信息。
水稻的 FSTs 数据库也已经建立并且发展迅速, 据
报道, TRIM数据库(http:/ /trim.sinica.edu.tw)对外释放
了大约 19 000个 FST (Hsing et al. , 2007)。 华中农业
大学的研究人员用 T-DNA 介导的增强子诱捕法得到了
129 000多个水稻突变体, 并且创建了一个专门用于收
集、管理和搜索水稻 T-DNA 插入突变信息的突变体数
据库(RMD, http:// rmd. ncpgr. cn)。从该数据库中可以
查知突变体的表型、报告基因的表达模式和 T-DNA 插
入位点的侧翼序列等; 而且还可以查知新基因和调控序
列, 以及它们特异的时空表达模式(Zhang et al., 2006)。
以上这些数据库将最终包含序列的表达资料及其表
型信息。 因为要精确了解每个基因的功能及基因间的互
作功能, 必须分析单个基因和多个基因的突变表型以及
它们的时空表达模式。有了这些序列信息就可进行反
向遗传学筛选, 确定先前克隆基因及基因家族的功能。
所有这些信息将为全面弄清拟南芥和水稻基因组全部基
因的功能提供强大的工具。
3 T-DNA 插入突变体库的构建及其研究
进展
T-DNA介导的基因诱捕技术已经在拟南芥中被广泛用于
115杨珍珍等: T-DNA介导的基因诱捕技术及其在植物功能基因组学研究中的应用
获得插入突变体库。Sess ions 已经创建了 100 000个
T-DNA 插入系 (An and Lee, 2005)。近来已有报道表
明, 一个接近饱和的插入突变体库包含 225 000多个独
立的 T-DNA 插入系。对插入突变体的分析表明, 在预
测的29 454个基因中有21 700个基因发生了插入突变;
插入序列随机分布于整个染色体基因组中, 即使插入内
含子和启动子中也出现表型突变( Alonso et al., 2003)。
我国陈章良教授领导的课题组用 T-DNA 插入突变的方
法构建了拟南芥(Columbia)突变体库, 初步建成了拟南芥
突变体的筛选、突变位点鉴定、突变体的培养和保存
以及突变基因功能研究的技术平台。李志邈等(2005)
用 T-DNA 介导的激活标签法构建了拟南芥的功能突变
体库, 共得到约 20 000个独立转化系, 并从中筛选了感
兴趣的突变体, 之后用质粒拯救法对相应的突变基因进
行了克隆。
鉴于 T-DNA 介导的基因诱捕技术在拟南芥中的成
功应用, 在水稻全基因组测序工作完成后, 生物学工作者
利用T-DNA以及转座子Tos17, 采用Ac/Ds插入突变的
方式开展了水稻突变体库的研制和功能基因组的研究。
因为 T-DNA 插入诱变快捷、方便且可行, 世界上很多
国家建立了水稻T-DNA插入突变体库。 Wu等(2003)采
用带有GAL4/VP16-UAS 的增强子诱捕系统构建了 T-
DNA 突变体库, 得到了 31 44 3 个独立的转化株。
Jeong等(2006)用激活标签法获得了 50 000个突变系,
分离到 27 621个插入位点序列, 经研究表明在预测的
57 888个基因中共有15 166个发生插入突变。 我国学
者在这方面也取得了一定的成就, 如张启发院士主持的
水稻重要农艺性状相关功能基因组研究课题组到 2005
年时, 已创建了含有 2.7×105个独立转化子的 T-DNA插
入大型突变体库, 为利用反向遗传学策略大规模分离功
能基因提供了材料(Lei et al. , 2007)。该项目克隆出功
能基本明确且具有潜在应用价值的新基因 107 个, 其中
抗白叶枯病基因 Xa26和 Xa13、包台型恢复基因 Rf1a
和 Rf1b、矿物质吸收相关的柠檬酸合成酶基因 CS 及
抗逆基因OsNAC等 18 个基因对产量、品质、抗病、
抗逆和营养高效等主要性状改良有重要应用价值(王景
刚, 2006)。张治国等(2006)以粳稻品种日本晴为受体
建立了高效的农杆菌介导的转化体系, 包含了近100 000
份独立的T-DNA插入标签系, 其中基因激活标签系和增
强子标签系各 50 000份。他们获得了有明显表型改变
的突变体共 4 500 余份, 包括株高、生育期、育性、
叶型、叶色、分蘖力、株型、穗型、颖花、粒型
和大小等突变性状。 另外, 还筛选到一些特殊性状的突
变体, 如脆杆突变株系, 无中脉突变体株系以及整个生
长周期都白化但可以结实的突变体 , 并利用改进的
PCR-Walk ing 方法获得了5 000余条T-DNA插入位点
的侧翼序列, 确定了 10个由插入失活引起的具有重要
农艺性状功能的候选基因, 其功能研究正在进行中。 这
些突变体必将在水稻生理、发育和品质改良等方面发
挥作用, 甚至可以在研究单子叶植物生理发育方面发挥
重大作用。
不过, 利用插入突变体库对功能冗余基因、有致死
效应的基因及高度多效性的基因进行研究比较困难。
因此, 可以在突变体库的基础上进行转录组学、蛋白
质组学和代谢组学等方面的研究, 在更复杂的背景下
研究基因的功能。随着大规模随机插入突变体库及
相应数据库的建立, 可以比较容易地获得目的基因插
入突变的材料, 进而对目的基因的功能开展研究。 相
信通过世界各个研究机构的共同努力, 植物的饱和随
机插入突变体库会不断建立, 植物的基因功能将会全
部得到阐明。
4 T-DNA介导的基因诱捕技术在研究植
物基因功能中的应用
4.1 分离组织特异性表达的基因
基因诱捕系统多用于分离和鉴定可差异调控的特异表达
基因。具有细胞和组织特异性表达、暂时性表达或有
条件表达的基因, 可通过报告基因的表达得以分离。利
用根癌农杆菌介导的遗传转化, 将启动子诱捕元件插入
到棉花基因组中, 获得了 141个独立转化子, 发现GUS
报告基因在不同株系的植株间表达模式呈现较大差异,
在有些植株中GUS呈组织特异性表达, 有些是器官特异
性表达, 有些则在多个器官中均有表达 (Jin, 2005)。这
116 植物学通报 25(1) 2008
种组织特异性表达模式可被作为用于鉴定特殊细胞和组
织的分子标签。 此标签在分析植物发育的研究中是一个
非常有用的工具, 它可用来检测发育时的正常模式和鉴
定突变表型。
Farra r等 (2003 )通过研究拟南芥启动子诱捕系
AtEM201发现, GUS 报告基因在胚胎和幼苗活跃的细
胞分裂区尤其在顶端分生组织和幼叶中表现出较高的活
性, 由此捕获的基因称之为EXORDIUM(EXO)。EXO
基因在结构上与烟草的 PH1-I基因相关, 分析结果表明
它是控制细胞分裂和维持分生组织负调节系统的一个组
分。 此外, 为了鉴定低温条件下水稻中表达的基因, Kim
等 (2004) 筛选了在5°C冷胁迫条件下生长的 15 586个
基因诱捕系, 发现 81个系表现出了冷响应GUS 活性。
选取其中的 62个系作进一步分析, 发现 53个系表现出
GUS活性增强, 而9个系则活性减弱; 16个系受ABA的
影响, 表明这是 AB A 依赖性的冷响应。此外, 他们用
TAIL-PCR法获得了这些诱捕系中的 37个基因, 并对其
中的 2个诱捕基因从分子水平上进行了研究。其中一个
是编码富含重复亮氨酸类似受体的蛋白激酶基因
Os RLK 1。此基因的表达受低温和盐胁迫的诱导。另
一个是OsDMKT1基因, 它编码的DMKT (puta t ive
demethylmenaquinone methylt ransferase) 只受低温胁
迫诱导而不受高盐胁迫或干旱诱导。 这些研究结果表
明, T-DNA介导的基因诱捕技术对分离和鉴定水稻胁迫
响应基因是非常有效的。
4.2 分离功能冗余基因和多效性基因
基因敲除是一种有效地确定基因功能的方法, 然而某些
特定基因, 由于其特性, 在基因敲除后并不表现出功能的
丧失, 例如那些其编码产物在植物生命周期中执行重要
功能的基因(它被破坏将产生致死效应); 或者某些在功能
上冗余的基因, 与其它在序列水平相关或不相关的基因
分担着重叠的功能; 也可能某些基因是在多个发育阶段
产生作用, 这些基因的突变可以导致早期致死或者是高
度的多效性表型, 这种多效性表型会掩盖一个基因在特
定途径中扮演的角色 (Springer, 2000)。基因诱捕系统
的应用可以克服这些困难, 同时也能找出参与生化或发
育过程的靶基因。因为在分离基因之前, 根据GUS 表
达形态就可预测其功能。Groover等 (2004) 构建了白
杨树的基因诱捕和增强子诱捕系, 并对参与初级和次级
维管发育的基因进行了鉴定和分析。维管基因的表达
模式表明, 40%在叶片中表达而不在叶脉中表达的基因
大部分在初级和次级维管组织的发育和功能中发挥作
用。 同时发现这些基因在次级维管组织和其它器官中分
担重叠功能。 而且通过增强子诱捕系捕捉到一个新基因
Cet-1-pop1-145, 虽然它编码的蛋白还未确定, 但通过数
据库搜索, 发现该蛋白与在拟南芥和水稻中表达的蛋白
具有高度的相似性。 Nakazawa等(2003)应用激活标签
系统从 50 000个拟南芥突变系中分离到 4个显性突变
系, 命名为 isoginchaku (iso)。 iso-1D 和 iso-2D 中T-
DNA插入了 AS2 (ASYMMETRIC LEAVES2) 基因的
3下游区; 而 iso-3D 和 iso-4D 是由于 T-DNA的插入激
活了 ASL1/LBD36 基因的过量表达而得到的。这 2个
突变基因都属于拟南芥中由 42个基因组成的AS2基因
家族。这 2 个基因的突变体都具有向下生长的花和叶
片, 且缺少顶端优势。同时还发现该家族中另一个基因
ASL5 / LBD12被 T-DNA载体插入激活后, 得到了另一
个突变体 peacock1-D (pck1-D), 该突变体缺少顶端优
势, 叶片向上生长, 并且不孕。
生长素的功能至少部分受到那些在生长素响应早期
表达的基因调节, 其中一类生长素响应基因是 sm al l
aux in-up RNAs(SAURs)。拟南芥中有 72个 SAURs
基因, 由于其功能冗余, 它们在植物生长过程中所起的作
用大部分还未探明。通过 T-DNA 插入突变方法, 研究
了其中一种SAUR基因 AAM1 (abolished apical hook
maintenance 1)的功能。Park 等(2007)分离了该基因
的 T-DNA插入突变体 aam1, 该突变体的下胚轴要比野
生型长, 表现出正常的钩弯曲。但研究发现在黑暗条件
下, 突变体的表型与野生型并没有显著差异, 这可能与
SAUR基因之间的功能冗余有关。各种研究结果表明,
AAM1 基因的作用在于调节下胚轴的生长和顶钩(apical
hook)发育时分化细胞的延长。这些结果表明, 激活标
签法等技术对于获得和分析功能冗余基因和多效性基因
的功能是非常有用的。
117杨珍珍等: T-DNA介导的基因诱捕技术及其在植物功能基因组学研究中的应用
4.3 分离启动子
除了用于分离基因外, 基因诱捕技术也可用于分离驱动
特异表达的启动子。一旦启动子被鉴定, 还可驱动实验
基因的异位表达, 以此来检验该基因在发育中的表达模
式。Tsugeki 和 Fedoroff(1999)在一个增强子诱捕系中
分离到了一个根冠特异性的启动子。后来这个启动子
被用来驱动白喉毒素基因 (DT-A) 的表达以检测去除根
冠细胞后的发育结果, 在这个技术中利用了酵母转录激
活子GAL4作为报告基因。Filichkin 等(2006)从杨树的
增强子诱捕系中分离到一个新的在根部特异表达的基因
ET304, 推测它所编码的蛋白含有一个保守的 AT-hook
区和DNA结合域, 属于某类转录因子家族的成员; 同时
还发现分离到的ET304的启动子决定了GUS在不定根
的发生和发育中的强烈表达依赖于生长素的特异表达。
这种能够驱动根部细胞基因特异表达或使靶基因沉默的
启动子对鉴定在根部发育中扮演角色的基因非常有用,
故 ET 304启动子的应用潜力很大。
对于那些编码 rRNAs 的基因或是其开放阅读框
ORFs 太短难以鉴定的基因, 它们的启动子在正常情况
下没有活性而不易分离, 被称为隐藏性启动子(c rypt ic
promoters)。利用启动子诱捕技术可将这种启动子有
目的地定位于上述基因附近, 并可通过GUS的表达来检
测其表达, 这是因为T-DNA的插入激活了本不具活性的
启动子。Foster等 (1999) 利用启动子诱捕系统成功地
从烟草中分离到植物中第一个组成型Crypt ic 启动子—
— tCUP。 tCUP不同于植物其它组成型启动子, 比如它
缺少 TATA box。 通过修改其上游的增强子元件和转录
增强子, tCUP 作为启动子元件被大范围用于苜蓿、烟
草和拟南芥等双子叶植物中。同样用启动子诱捕技术
从拟南芥突变体中克隆和鉴定了一个新的, 在根部特异
表达的隐藏性启动子序列(Sivanandan et al., 2005)。
传统的方法只注重分离和鉴定那些已表达的基因以及与
它们相关的序列, 而忽略了那些有用的却隐藏的基因调
控序列。 T-DNA 介导的基因诱捕技术将会克服这一缺
点, 成为分离这些调控序列的有效方法。
我们利用 T-DNA介导的启动子诱捕载体转化拟南
芥(WTC24), 分离到了一个多效突变体, 称为 155系。
该突变体表现出了许多形态发育方面的改变, 如子叶圆
而肥厚, 下胚轴粗短, 根长缩短, 莲座叶体积减小, 叶柄
缩短, 叶尖向下卷曲, 叶色深绿, 从营养生长到生殖生长
的转化延迟, 整个植株的高度明显低于野生型。组织化
学分析表明, GUS基因特异性地在突变体茎顶端分生组
织和维管组织中表达。突变体的解剖学分析表明, 其茎
顶端分生组织和维管组织的发育模式明显不同于野生
型。我们用 TAIL-PCR法对突变体的相关基因进行了克
隆, 通过核苷酸序列比对分析发现, 该基因位于第4号染
色体上, 与热激蛋白 101(Hsp101)相关。该基因功能的
进一步研究必将为揭示植物抗逆性、茎顶端分生组织
和维管组织发育的遗传控制提供重要信息(待发表)。
5 T-DNA介导的基因诱捕技术在研究基
因功能中遇到的问题
5.1 报告基因表达的真实性
利用基因诱捕技术分离基因, 并研究其功能的前提是报
告基因必须能真正反映染色体基因的表达情况。初步
结果表明, 报告基因的表达能够反映植物基因的表达。
但事实并非完全如此。Stangeland等 (2005) 在他们所
构建的拟南芥启动子 LDC::GUS诱捕系中发现 GUS在
合点胚乳中没有表达活性。他们认为这种启动子 -报告
基因可能太短, 不能包含LDC表达时所需的所有调控序
列。另一方面, 如果所构建的基因诱捕元件刚好插入到
基因组调控元件的位置上时, 可能会导致报告基因不表
达。如在构建的启动子诱捕系 Linguince6/619中发现,
T-DNA插在了 AtHD2C (histone deacetylase) 基因启
动子下游, 所用的检测方法未曾检测到GUS在幼苗和叶
子中的活性。而用Northern 印迹分析表明, AtHD2C在
这些器官中均有微弱表达 (Stangeland et al. , 2005)。
以上这些原因都会导致在分析报告基因表达的真实性时
出现错误。 当GUS 检测不能真实反映诱捕基因的表达
时, 可以用G F P 作为替代的报告基因。因为它具有
GUS所没有的优势, 如GFP 的检测不需要外源的作用
因子和底物; GFP 的荧光是细胞自主性的, 因此允许各
种环境刺激下的检测, 同时还可监视报告基因遗传的稳
118 植物学通报 25(1) 2008
定性。 或者构建一个在T-DNA 右边界携带无启动子的
GUS 基因, 左边界携带无启动子的 GFP 基因的二元载
体, 可使其检测更加准确且高效。
5.2 T-DNA插入的复杂性
最初的研究结果表明, T-DNA整合进基因组时不会引起
植物基因组大的重排。但最近研究结果显示, T-DNA整
合到染色体会引起染色体重排。 当在基因组中导入大片
段的外源DNA时, 会发生大范围的染色体重组 (Nakano
et al. , 2005), 这将为随后的突变体分析带来相应的困
难。另外, 众多的研究结果表明, T-DNA只有一部分是
单拷贝插入, 而通常检测到的情况是多个T-DNA插入到
一个转化植株中; 一个位点包含多个T-DNA插入或多个
位点包含多个插入; 而且并非所有的位点T-DNA都是完
全插入, 会产生 T-DNA 的正向和反向重复。其中比较
常见的情况是 T-DNA 的左右边界与基因组结合处缺失
一部分或插入小片段的填充序列, 也有部分或整个载体
序列整合进基因组中。这些都会导致随后基因分离和
基因功能分析的复杂性, 但目前还没有可行的办法来解
决此问题, 因此对许多基因功能的分析还应结合其它方
法进行综合研究。
5.3 组织培养中产生的变异
在 T-DNA 诱捕系中表型上的改变并不一定是由T-DNA
的插入引起的。这是因为组织培养是一个容易诱发基
因突变的因素, 经常会引起点突变, 小的插入和删除, 因
而通过组织培养转化技术建立的 T-DNA 突变体库就可
能会得到许多与 T-DNA 插入无关的突变体。不过, 尽
量缩短组培时间可减少非 T-DNA插入引起的突变。 因
此为提高转化效率, 有必要发展一种新的不需组织培养
的转化技术。对于像拟南芥、苜蓿、甜菜和油菜等小
型植物, 可以用农杆菌介导的花序浸蘸法(f loral -di p)
(Clough et al., 1998)进行转化。这种方法最大的优势
在于能直接获得转化的种子, 避开了组织培养和继代培
养, 排除了组织培养中因体细胞变异带来的不利遗传背
景, 同时为一些不易建立体外再生体系的植物提供了基
因转化的新途径。另外还可采用对植物花序进行农杆
菌菌液直接喷雾(floral spray)处理, 同样可获得转化株,
这是比floral-dip法更为简便的转基因方法(Chung et al.,
2000)。此外, 在突变体的鉴定中必须经过突变性状和
T-DNA 共分离检测, 以确定突变性状是否真正由于 T-
DNA的插入所造成。 用图位克隆法可以鉴别非 T-DNA
插入引起的突变。
6 结语
拟南芥和水稻等植物基因组全序列的测定为细胞和发育
生物学研究提供了大量信息。如何利用这些信息来揭
示蛋白质的功能和鉴定与发育有关的重要基因成为科学
家们面临的挑战。 随着农杆菌介导的转基因技术的不断
完善, T-DNA诱捕技术已成为快速构建插入突变体库的
主要方法。通过转基因创造大量的 T-DNA 独立转化子
可以建立T-DNA突变体库, 进而方便地进行正向和反向
遗传学研究。目前, 以 T-DNA 为基础的几种诱捕技术
已经得以发展, 基因诱捕系统已成为分离、鉴定和分析
基因功能的有效工具, 在决定基因组基因功能的研究中
逐渐扮演重要角色。可以预见, 在不久的将来会有更多
的植物基因被克隆和鉴定, 特别是控制重要农艺性状的
基因, 这无疑将会给农业生产带来极大的收益。
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