全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (5): 590-596, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-12-08; 接受日期: 2007-06-04
基金项目: 江苏省自然科学基金(No.BK2006211)
* 通讯作者。E-mail: hgli@njfu.com.cn
.研究论文.
利用 SSR分子标记对鹅掌楸自由授粉子代的父本分析
孙亚光, 李火根 *
南京林业大学林木遗传与基因工程重点实验室, 南京 210037
摘要 利用自行开发的12个EST-SSR分子标记, 采用最大似然法对鹅掌楸(L.chinense (Hemsl.) Sarg.)实验群体3个半同胞
家系的180个子代进行父本分析。结果表明, 每个SSR位点的等位基因数为3-7, 平均为4.67; 其平均观测杂合度(Ho)、平均
期望杂合度(He)及平均多态信息含量(PIC)分别为0.458、0.635和0.580。利用12个SSR标记可在95%的可信度确定114个
子代的父本, 占子代群体的 63.3%, 其累积排除概率为98.52%。自由授粉状态下, 鹅掌楸的自交率为11.6%, 而北美鹅掌
楸自交率为0, 且种内交配比例大于种间交配。鹅掌楸平均有效花粉散布距离为20-30 m, 最大散布距离为70 m。
关键词 鹅掌楸, 交配方式, 父本分析, 花粉流, SSR
孙亚光, 李火根 (2007). 利用 SSR分子标记对鹅掌楸自由授粉子代的父本分析. 植物学通报 24, 590-596.
花粉散布是植物基因流(gene flow)的重要组成因子,
花粉有效散布距离及散布模式是影响植物有性繁育过程
及种群遗传结构的重要因素(Hamrick and Nason,
2000)。早期花粉流的研究多采用花粉跟踪法, 一般应
用荧光染色(Levin and Kerster,1974; Waser et al.,1996)
和放射性同位素标记技术(Schlising and Turpin, 1971;
Reincke and Bloom,1979), 通过对花粉的捕获或标记
来定性地研究基因流, 但该法无法真实反映花粉的有效
散布模式。DNA分子标记技术的发展为花粉流的研究
提供了强有力的工具。与 RAPD等随机引物分子标记
相比, 共显性的分子标记, 如 RFLP、SSR和 SNP等
能够检测出丰富的遗传信息, 表现出高度的稳定性、可
靠性和高效性, 能够精确地估计群体遗传多样性和花粉
散布模式, 是研究植物种群遗传结构、基因流及交配系
统最理想的分子标记(Byrne et al., 1996; Streiff et al.,
1998,1999; Gerber et al., 2000)。
亲本分析是直接估算基因流的最常用方法之一
(Snow and Lewis,1993)。采用遗传标记研究种群及个
体间的亲缘关系, 即判定种子或幼苗是由哪个个体自交
或哪两个个体杂交产生的。亲本分析能够描述群体内
的交配方式, 估算个体繁殖贡献率, 对于了解群体间或世
代间的基因流及性选择适合度有重要的理论意义(张冬梅
等, 2003)。目前, 亲本分析的统计方法大致归为 3类,
即遗传排除法(genetic exclusion)、最大似然分析法
(maximum likelihood analysis)和父性拆分法(fractional
paternity assignment) (陈小勇, 1999; 何田华和葛颂,
2001)。
木兰科(Magnoliaceae)鹅掌楸属(Liriodendron)现仅
存2个种, 即鹅掌楸(L.chinense (Hemsl.) Sarg.)和北美
鹅掌楸(L. tulipifera L.)。鹅掌楸因现存个体数少且处
于片段化生境而被列为国家二级珍稀濒危保护树种。
该属2个种虽然地理分布间隔遥远, 分布与生存状况截
然不同, 但种间可配性高, 因而是植物系统进化、交配
系统和基因流研究的理想材料(王章荣, 2005)。关于鹅
掌楸花粉流的分子检测, 国内曾有过报道(黄双全等,
1998), 但以往所用的分子标记为随机引物标记RAPD,
所得结果有很大的局限性。本文旨在以特异性的 SSR
分子标记为工具, 通过父本分析研究鹅掌楸有效花粉散
布模式, 为鹅掌楸交配系统研究及保护策略的制定提供
技术参考。
591孙亚光等: 利用SSR分子标记对鹅掌楸自由授粉子代的父本分析
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料采自南京林业大学下属林场的鹅掌楸种源试验
林及其自由授粉子代。试验林概况参见文献(李火根等,
2005)。该试验林为孤立群体, 周围 2 km范围内无成
熟的鹅掌楸林分或个体。
选取3株位于种源试验林中部的个体作为本实验的
母本, 其中 1株为鹅掌楸(Lir iodendron chinense
(Hemsl.) Sarg.)(来自江西庐山, LS), 另2株为北美鹅掌
楸(L. tulipifera L.)(LYS 和 BM)。将母本 100 m半径
范围内的个体视为该母本半同胞子代的候选父本。因
鹅掌楸为雌雄同株同花, 自然状态下有低水平的自交现
象(王章荣, 2005), 故将3株母本也视为候选父本, 共得
候选父本 99个。2004年 10月下旬, 采集 3株母本所
有自由授粉种子, 并于2005年2月播种于南京林业大学
校园苗圃。2005年 4月, 从 3个半同胞家系实生苗群
体中各随机抽取60株构成父本分析的子代群体, 共抽取
180个子代, 每个子代采取数片新鲜无病斑的嫩叶, 放
入-70°C冰箱中保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 总 DNA的提取
基因组DNA采用改进的CTAB裂解-硅珠吸附法进行提
取(张博等, 2004), 紫外分光光度计检测纯度, 置于
-20°C冰箱保存备用。
1.2.2 引物来源及 SSR-PCR反应条件
实验所用的引物来自于本实验室从北美鹅掌楸EST序列
中开发出的EST-SSR引物 (Xu et al., 2006)。选取12
对通用性好且多态性高的 SSR引物用于研究。
SSR-PCR反应体系为10 µL, 包含10-20 ng样本
DNA, 1×PCR缓冲液(10 mmol.L–1 Tris-HCl pH 8.0, 50
mmol.L-1 KCl), 0.25 mmol.L-1 Mg2+, 0.2 mmol.L-1
dNTP, 正反引物各0.25 µmol.L-1 , Taq聚合酶 0.25 U
(TaKaRa)。扩增反应程序采用 Touch-down PCR：
94°C预变性4分钟, 随后15个Touch-down循环(94°C
变性 15秒, 60°C退火 15 秒, 72°C延伸 30秒, 每次循
环的退火温度依次降 0.7°C); 再进入主循环 94°C变性
15秒, 49.5°C退火15秒, 72°C延伸30秒; 最后1小时
延伸反应。SSR-PCR产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上
电泳, 银染检测。
1.2.3 数据处理与统计分析
利用 CERVUS (Version 2.0)软件对 99个候选父本及
180个自由授粉子代进行父本分析。CERVUS适用于
双亲或单亲未知情况下的亲本分析。该软件基于最大
似然法推断亲本, 要求用共显性标记的数据(Marshall
et al.,1998; 何田华和葛颂, 2001)。其原理为：借助
于观测位点的等位基因频率进行10 000次循环的模拟,
估算子代各候选父本的似然性值比率(LOD值), LOD值
最高者为“真实”父本。最大和次大的 LOD值之差定
义为D值, 通过比较D值与临界值以检验D值的显著性。
D值的显著性水平用可信度(confidence level, CL)表
示。可信度一般分 2种, 即 95%(strict CL, 相当于 P
=0.05的显著性水平)和 80% (relaxed CL)(Meagher,
1986; Marshall et al.,1998)。此外, 该软件还能获得
亲代与子代群体中各位点等位基因数目NA、等位基因
频率 Pi、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态性
信息含量(PIC)等信息。
2 结果与分析
2.1 SSR多态性分析
12个SSR位点在实验群体(候选父本群体与子代群体共
279个个体)中检测结果如表1。每个位点的等位基因数
为3-7, 平均等位基因数为4.67, 其中位点LTPR102的
等位基因数最多(7个); 位点LTPR026的等位基因数最
少(3个)。实验群体平均观测杂合度、期望杂合度及多
态信息含量分别为 0.458、0.635和 0.580。
2.2 自由授粉子代的父本分析
利用CERVUS软件对鹅掌楸自由授粉子代进行父本分
592 植物学通报 24(5) 2007
析, 结果见表 2。利用 12个 SSR位点以 95%可信度
可明确推断出 114个子代的父本(占子代群体总数的
63.3%), 其累积排除概率为 98.52%。其中, 引物
LTPR102排除概率最高, 达44.20%。此外, 其余66个
子代也可在 80%的可信度下确定其父本。
2.3 有效花粉的散布模式
图 1显示所有候选父本的空间分布与交配格局。不同
的母本与父本之间的交配距离及父本数量上存在差
异。相对而言, 母本 LS的交配距离(即有效花粉散布
距离)短, 且父本数量少(7个); 而母本BM及母本LYS
的交配距离远且父本数量多(分别为17和22个), 表明
鹅掌楸雌雄配子的结合具有选择性, 其机理有待于进一
步探究。
亲本之间的交配距离即为有效花粉的散布距离, 它
反映了种群内的交配格局。鹅掌楸为虫媒传粉, 该交配
距离能够很好地反映昆虫的大致飞行距离。 研究结果表
明：鹅掌楸个体间的交配距离存在差异, 总体上, 交配
距离呈近似正态分布。
在母本 LS已确定的 48个自由授粉子代中, 距离
15-35 m的个体间的交配比例最高, 占41.7%, 平均交
配距离为 26.2 m; 最大交配距离达 60 m。母本 BM和
母本LYS的交配距离也呈近似正态分布, 平均交配距离
分别为 34.9 m和 21.8 m, 两者分别有 32.3%和 60%
的有效花粉来自15-35 m区域内, 其最大交配距离分别
为 70 m和 48 m(图 1, 图 2)。
2.4 交配方式
由于本实验群体涉及鹅掌楸的2个种共17个种源, 因此,
自由授粉状况下, 其交配方式多样, 如自交与异交, 种间
交配与种内交配。种内交配又可分为种源间、种源内
不同个体间交配等。
表 1 鹅掌楸 EST-SSR的多态性
Table 1 Polymorphism of EST-SSR in Liriodendron L.
Locus
Number of alleles Pi Observed Expected Polymorphic
(NA) (Range) heterozygosity (Ho) heterozygosity (He) information content (PIC)
LTPR002 4 0.036 0-0.604 3 0.309 0.532 0.481
LTPR015 4 0.077 3-0.522 7 0.536 0.673 0.611
LTPR017 4 0.109 7-0.582 7 0.612 0.602 0.559
LTPR026 3 0.163 7-0.690 6 0.353 0.476 0.428
LTPR056 6 0.001 8-0.625 9 0.291 0.552 0.505
LTPR080 4 0.005 4-0.459 6 0.680 0.644 0.571
LTPR091 6 0.032 4-0.406 5 0.507 0.715 0.669
LTPR102 7 0.012 6-0.439 9 0.594 0.748 0.704
LTPR121 5 0.005 4-0.451 4 0.597 0.644 0.573
LTPR124 4 0.012 6-0.482 0 0.396 0.627 0.553
LTPR138 4 0.109 7-0.390 3 0.360 0.700 0.643
LTPR161 5 0.021 6-0.375 9 0.263 0.710 0.657
Mean 4.67 0.458 0.635 0.580
表 2 鹅掌楸自由授粉子代父本分析结果
Table 2 The number of paternity and its confidence level assigned by CERVUS software for 180 offspring among 3 half-sib
families of Liriodendron L.
Confidence levels Maternal trees LS Maternal trees BM Maternal trees LYS
95% strict 48 (80%) 31 (51.7%) 35 (58.3%)
80% relaxed 12 (20%) 29 (48.3%) 25 (41.7%)
Total 60 (100%) 60 (100%) 60 (100%)
593孙亚光等: 利用SSR分子标记对鹅掌楸自由授粉子代的父本分析
2.4.1 自交与异交
CERVUS软件分析表明, 母本LS的7个自由授粉子代
来自于自交, 自交率达11.6%。而北美鹅掌楸(母本BM
和LYS)所有自由授粉子代所确定的候选父本均非母本
自身,表明北美鹅掌楸无自交现象, 自交率为0。实验结
果验证了在自由授粉状况下鹅掌楸的交配方式以异交为
主 。
2.4.2 种间与种内交配
图3反映了鹅掌楸交配方式与所形成子代数目的关系。
从图3可以看出, 不同母本的交配方式及获得的子代数
目与比例差异明显。
鹅掌楸(母本 LS)的种内交配和种间交配分别占
96.7%和 3.3%; 北美鹅掌楸母本 BM与 LYS也以种内
交配为主, 其种内交配比率分别为 90%和 57.1%。表
明鹅掌楸以种内交配为主。
依据交配亲本间的亲缘关系远近, 种内交配又可分
为种内不同种源间以及种源内不同个体间。分析自然
状况下种内不同交配方式及比例可为深入研究鹅掌楸交
配机制及物种保护提供相关的技术信息。
鹅掌楸(母本 LS)的子代群体中有 68.8%的父本来
自种内不同种源间; 而北美鹅掌楸(母本LYS)的子代群体
中有 37.1%的父本来自种内不同种源间。北美鹅掌楸
(母本LYS)的子代群体中有20%的父本来自同一种源不
同个体间, 而鹅掌楸(母本 LS)该类父本仅有 12.5%。
3 讨论
3.1 父本分析
目前, CERVUS软件是父本分析最常用的软件。与其
它父本分析方法相似, CERVUS软件分析结果给出每一
个子代最可能的亲本, 并给出相应的可信度(置信概率),
总体上属统计推断范畴。从统计学观点出发, 一般进行
推断的可信度(置信概率)至少要达到95%。本实验对来
自3个半同胞家系的180个子代进行父本分析, 在95%
的可信度水平下可推断114个子代的父本, 占总子代群体
的63.3%, 这种高亲本推断率源于实验所用的12个高信
息量的 EST-SSR位点, 其累积排除概率达 98.52%。
此外, CERVUS软件也为其余66个子代推断出最
可能的父本, 但可信度为 80%, 未达统计学要求, 因此,
图 1 候选父本的空间分布与交配格局
(A) 母本 LS; (B) 母本 BM; (C) 母本 LYS
O: 候选父本; — : 有效花粉流; 线的粗细表示有效花粉的数量
(bar=4 m)
Figure 1 The spacial distribution of paternal candidates and
mating pattern for 3 maternal trees in the experimental popula-
tion of Liriodendron L.
(A) maternal tree LS; (B) maternal tree BM; (C) maternal tree
LYS
Open circles (o) indicate the pollen parents; lines indicate the
pollen flow to the maternal tree; line thickness is proportional to
the number of successful pollen grains of the paternal tree
(bar=4 m)
594 植物学通报 24(5) 2007
本文没有将其作为 “真实 ”父本。
3.2 自交亲合性
大多数异交物种都有一些机制以避免近交衰退, 如自交
不亲合性。鹅掌楸的自交不亲合性机制主要表现为同
一朵花的雌蕊和雄蕊异熟, 即花期不遇。本实验结果显
示, 北美鹅掌楸(母本BM及LYS)的天然自交率为0, 自
交完全不亲合, 而鹅掌楸(母本LS)的自交率为 11.
6%。2个种间差异如此明显, 原因可能与2个种的自然
分布及生境状况有关。鹅掌楸为岛状分布, 生境片段化,
种群小甚至为孤立木(贺善安和郝日明, 1999)。笔者推
测, 鹅掌楸为保障种群的繁殖, 可能在一定程度上提高了
自交亲合性。而北美鹅掌楸分布广, 种群数量大, 选择
压小, 从而保持了其自交不亲合性。该推论尚有待于验
证 。
从开花特性方面考虑, 虽然鹅掌楸同一朵花雌雄异
熟, 但该树种花期较长, 同一棵树花期前后可达1个月,
因此, 自由授粉状态下, 鹅掌楸存在一定的自交率(黄坚
钦, 1998)。这从我们 2年的鹅掌楸传粉生物学野外观
察的结果中也得到证实。但本实验检测结果显示鹅掌
楸自交率达 11.6%, 比以往的检测数据高(Steinhubel,
1962; 黄坚钦, 1998)。原因可能与实验所用的母本LS
周围开花个体数较少及花期的同步性较低有关。
3.3 有效花粉的散布距离
父本的自身特性、种类、数量、密度、分布及其传
粉昆虫的类别、数量决定了有效花粉散布的距离和散
布模式。一般来说, 随着母本与父本距离的增加, 交配
成功几率变小, 花粉流强度减弱(Whitehead,1983)。
本实验结果显示, 鹅掌楸和北美鹅掌楸的平均有效
图 3 鹅掌楸的交配方式和形成的子代数
Figure 3 An illustrating diagram of the relationship between the mating pattern and the number of offspring generated
图 2 有效花粉的散布距离
Figure 2 The dispersal distance of effective pollen grains
595孙亚光等: 利用SSR分子标记对鹅掌楸自由授粉子代的父本分析
花粉散布距离在15-35 m, 表明来自母本周围这一区域
间的有效花粉流最多。在虫媒传粉树种的相关报道中,
桉树种子园中的平均有效花粉散布距离为32 m, 最大距
离为 85 m (Chaix and Gerber, 2003)。据我们观察,
鹅掌楸和北美鹅掌楸在种间及不同种源间的开花期存在
一定的差异。北美鹅掌楸开花较早且花量较大, 而鹅掌
楸开花较晚且花量偏少。这导致鹅掌楸的交配距离容
易受花粉源的影响而不局限于临近个体。
实验分析的3个母本最远交配距离均超过了60 m,
这与其它研究结果相似(黄双全等, 1998)。鹅掌楸传粉
昆虫种类较多, 主要有蜂类、蝇类、甲虫类和蚁类。
蝇类访花频率最高, 蜂类次之(黄双全等, 1998; 周坚和
樊汝汶, 1999)。 蜂类中胡蜂体型较大, 具有非常强的远
距离飞行能力, 使鹅掌楸远距离交配得以实现。
3.4 交配方式
影响种群交配方式的因素很多, 如传粉媒介、群体内繁
育个体间的遗传差异、空间分布、开花习性、花粉特
性以及花期的气候条件等。本实验结果显示鹅掌楸以
异交为主, 且种内交配大于种间交配。笔者推测这可能
与鹅掌楸 2个种间遗传差异有关。由于长期的地理隔
离, 导致两者在开花习性及性选择等方面差异较大。
本研究同时还将鹅掌楸种内交配方式进一步分解为
种内不同种源间交配、种源内不同个体间交配以及自
交等不同层次, 所得结果对于深入进行鹅掌楸交配系
统、种的系统发生以及杂交育种等方面的研究有一定
的参考价值。但由于本研究所用的母本数目有限, 所得
结论尚需进一步研究与验证。
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The Paternity Analysis for Open-pollination Progenies of
Liriodendron L. Using SSR Markers
Yaguang Sun, Huogen Li*
The Key Laboratory of Forest Genetics and Gene Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037,China
Abstract The patterns of effective pollen dispersal were explored in an experimental population of Liriodendron L. Paternities of
180 open-pollination progenies from 3 maternal trees were identified by twelve nuclear SSR polymorphic loci from expressed
sequence tags of Liriodendron A software, CERVUS, was used to assign the paternity of each progeny based on the method of
maximum likelihood analysis. The number of alleles per locus ranged from 3 to 7, with average of 4.67. The observed and expected
heterozygosities (Ho and He) ranged from 0.263 to 0.680 and from 0.476 to 0.748, with averages of 0.458 and 0.635, respectively.
The polymorphic information content (PIC) ranged from 0.428 to 0.704, with average of 0.580. The cumulative exclusion probability
of 12 SSR loci was 98.52%. Among 180 progenies, 114 (accounting for 63.3%) progenies could be assigned paternity at strict
confidence level of 95%, the remained 66 (accounting for 36.7%) progenies could also be assigned paternity at relaxed confidence
level (80%). The selfing rate of open-pollinated L. chinense Sarg. was 11.6%, while the selfing rate of L. tulipifera L. was zero. It
seems that intraspecies mating occurred more frequently than interspecies mating in Liriodendron. The average effective pollen
dispersal distance of Liriodendron ranged from 20 m to 30 m, with the maximum dispersal distance of 70 m.
Key words Liriodendron L., mating pattern, paternity analysis, pollen flow, SSR
Sun YG, Li HG (2007). The paternity analysis for open-pollination progenies of Liriodendron L. using SSR markers. Chin Bull Bot 24,
590-596.
* Author for correspondence. E-mail: hgli@njfu.com.cn
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(责任编辑: 白羽红)
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