全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 505-510, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-01-05; 接受日期: 2007-01-18
基金项目: 江南大学人才引进基金(No. 006626)
* 通讯作者。E-mail: liaoxiangru@163.com
.技术与方法.
一种女贞叶抗冻蛋白的分离纯化
刘尚, 廖祥儒*, 张建国, 苗会娟
江南大学生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室, 无锡 214122
摘要 根据抗冻蛋白与冰结合的特性, 利用碎冰从女贞(Ligustrum lucidum)叶提取液中分离出抗冻蛋白。结果表明, 通过碎
冰吸附、凝胶过滤和离子交换层析可以获得4个组分的蛋白质, 其中的1个经鉴定具有热滞活性。在蛋白质浓度为5 mg.
mL-1时, 它的热滞活性(thermal hysteresis activity, THA)值为0.678°C, 对其进行全波长扫描(200-1 000 nm)发现在975
nm处有吸收峰; 该蛋白亲水性氨基酸含量较高。
关键词 抗冻蛋白, 性质, 冰结合, 女贞, 纯化
刘尚, 廖祥儒, 张建国, 苗会娟 (2007). 一种女贞叶抗冻蛋白的分离纯化. 植物学通报 24, 505-510.
冻害在我国南方和北方都常有发生, 尤其以西北、
东北的早春或晚秋以及江淮地区的冬季或早春危害最为
严重。抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)是一类能够
抑制冰晶生长的蛋白质, 具有影响冰晶形态, 抑制重结晶
(recrystallisation inhibition, RI)和热滞活性(thermal
hysteresis activity, THA)3个基本特性, 能够增强细胞
抵御冰冻伤害的能力(Knigh et al., 1984; 鲍丽丽, 1995;
邓江明等, 2001; Tomczak and Christopher, 2003)。
AFP存在于鱼类(DeVries, 1971; Davis and Hew,
1990; Evans and Fletcher, 2004)、昆虫(Duman et
al., 2004)、细菌(Duman and Olsen, 1993)、真菌、
植物等生物体中(费云标等, 1994; Duman, 1994; 卢存
福等, 1998; 周晓蕾等, 2001; Atici and Nalbantoglu,
2003; Pudney et al., 2003; Zhang et al., 2004) , 已研
究的植物材料多达 40余种, 但真正被分离纯化的 AFP
只有黑麦(Secale cereale)、胡萝卜(Daucus carota)和
黑麦草(Lolium multiflorum)等。Kuiper等(2003)对
AFP纯化方法进行了改进, 利用“冰手指(Ice-finger)”在
降温过程中来吸附抗冻蛋白并取得了较大突破。但实
验装置复杂, 比较昂贵, 未能得到广泛应用。由于抗冻
蛋白特殊的性质, 其活性测定方法也相对较少, 已报道的
主要有相差显微镜直接观察、显示性热量扫描仪
(differential scanning calorimetry, DSC)和量热仪等方
法(邵强等, 2005)。我们利用抗冻蛋白在冰晶的生长过
程中可以结合到其表面的特性, 探讨了用冰提取女贞叶
AFP的方法, 并研究了该蛋白的部分性质。
1 材料与方法
1.1 植物材料
植物材料为越冬后的女贞(Ligustrum lucidum)叶片, 采
自江南大学校园内, 洗净后于-70 °C冷藏保存。
1.2 冰提方法
取100 g叶片, 加250 mL 20 mmol.L-1 Tris-HCl 缓冲
液捣碎并用8层纱布过滤, 滤液于12 500×g冷冻离心30
分钟。取上清加入碎冰进行提取, 通过实验确定用冰量
和提取时间。
1.3 冰提蛋白的分离纯化
凝胶过滤层析采用Sephadex G-100, 洗脱缓冲液为50
mmol.L-1 Tris-HCl, pH6.5。离子交换层析采用Cellu-
lose DEAE-52, 洗脱缓冲液为50 mmol.L-1 Tris-HCl,
pH6.5, 0-2 mol.L-1 NaCl梯度洗脱。所得各组分经透
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析冷冻干燥后于-70 °C保存备用。
1.4 女贞叶片AFP部分性质分析
蛋白质含量测定采用Bradford(1976)的方法。用DSC-7
热差分析仪测定蛋白质的热滞活性, 对照采用的小牛血
清蛋白(BSA), 所用样品量为 10 mg.mL-1(周晓蕾等,
2001)。蛋白质纯度鉴定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方
法(Laemmli , 1970), SDS-PAGE分离胶浓度为12%(w/v),
NATIVE-PAGE 分离胶浓度为 7.5%(w/v)。用 PLUS
384酶标仪对样品进行全波长扫描, 波长范围200-1 000
nm。采用日立 835-50氨基酸自动分析仪测定样品中
17种氨基酸的含量,方法参见中国国家标准GB/T18246-
2000。
2 结果与讨论
2.1 提取时间和冰的用量对AFP纯化效果的影响
当250 mL上清液使用30 g碎冰进行冰提时, 冰提2分
钟蛋白质含量明显增加(P<0.05), 但冰提时间继续增加
蛋白质含量差别不大(图 1); 说明冰提 2分钟已达到饱
和。将冰提时间设定为 2分钟, 冰的用量从 10.0 g到
40.0 g范围内, 蛋白质含量逐渐增加, 并在30.0 g时最
大, 因此冰的用量可选 30 g或 100 g叶片(图 2)。
2.2 女贞叶片AFP的纯化
收集的冰提蛋白浓缩后经凝胶过滤可分为 3个组分(图
3), 蛋白质含量高的组分经离子交换可分为 A1、A2、
A3和 A4四个组分(图 4)。
通过离子交换层析得到了 4个不同的蛋白质组分
A1、A2、A3 和 A4。其中 A2 的含量占冰提蛋白的
50%以上, 因此首先对A2的部分性质进行研究。每100
g女贞叶片经冰提可获冰结合蛋白4.9 mg, 其中A2为
图 1 冰提时间对冰提蛋白质含量的影响
Figure 1 Effect of adsorption time on the content of ice
extractable protein
图 2 冰的用量对冰提蛋白质含量的影响
Figure 2 Changes in content of proteins extracted by differ-
ent quantity of ice for 2 min
图 3 冰提蛋白质的凝胶层析洗脱图谱
第 100到第 110管具有重结晶抑制活性
Figure 3 Elution profile of Sephadex G-100 gel filtration chro-
matography of ice extractable proteins
Recrytalization inhibition activity was found in fraction 100 to
110
507刘尚等: 一种女贞叶抗冻蛋白的分离纯化
0.59 mg, 占总蛋白量的 0.022%(表 1)。
2.3 女贞叶片AFP鉴定及部分性质
2.3.1 电泳结果
经NATIVE-PAGE和SDS-PAGE鉴定(图5)A2呈清晰
的单一条带, 其分子量约为 36 kDa。
2.3.2 THA的测定
从图6和图7的对比中可以看出, A2在部分熔融的条件
下重新冻结时放热曲线峰出现很明显的延迟现象, 重结
冰的起始温度出现了停滞, 这是一种BSA所不具备的性
质——热滞活性。
使用DSC数据图形处理系统对所得到的数据进行
处理, 获得了 BSA和 A2的熔融焓变、部分熔融的焓
变、熔点和起始温度等原始数据, 根据这些数据可以计
算出其冰晶含量和热滞活性(表 2, 3)。
表 1 100 g女贞叶片蛋白质纯化过程中蛋白质含量的变化
Table 1 Changes of protein concentration during protein
purification process (100 g leaves of Ligustrum lucidum)
Protein content (mg) Relative content (%)
Crude extracts 2 625 100
Ice extractable proteins 4.945 0.188
A2 0.592 0.022
A2: the purified antifreeze protein
图 4 冰提蛋白质的阴离子交换层析洗脱图谱
4个组分分别标记为 A1, A2, A3, A4
Figure 4 Elution profile of DEAE-cellulose anion exchange
chromatography of ice extractable proteins
Four different groups of fractions were obtained and denoted
A1-A4
图 5 纯化后抗冻蛋白 A2的电泳图谱
(A) SDS-PAGE 12% 聚丙烯酰胺(考马斯亮蓝染色);
(B) 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 7.5%聚丙烯酰胺(银染)
Figure 5 Eletrophoresis diagram of the purified antifreeze
protein-A2
(A) SDS-PAGE on a 12% polyacrylamide gel stained by
Coomassie brilliant blue;
(B) NATIVE-PAGE on a 7.5% plyacrylamide gel stained by sil-
ver nitrate
图 6 部分熔融重冻结的牛血清蛋白 DSC曲线
停留温度分别为-0.5 °C, -0.4 °C, -0.3 °C
Figure 6 DSC curves of refreezing (0.5 °C.min-1) of partially
melted BSA
The hold temperature (Th) of the curves is -0.5 °C, -0.4 °C, -0.3 °C
508 植物学通报 24(4) 2007
由表2和表3可以看出, BSA在本实验条件下没有
表现出热滞活性。而在0.5 mg.mL-1的浓度下, 冰晶含
量为7%时, A2的THA值可达到0.678°C, 说明所提取
的抗冻蛋白热滞活性较高, 较接近于鱼类抗冻蛋白(邵强
等, 2005)。
2.3.3 A2的全波长扫描
通过对抗冻蛋白A2的全波长扫描(图8)发现在975 nm
处有最大吸收值, 今后有可能可以根据该波长检测女贞
中的这种抗冻蛋白, 简化实验操作步骤。
2.3.4 A2的氨基酸含量分析
从表4可以看出, 天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸的摩尔比
分别达到 18.6%、25.2%、5.43%, 这与 Griff ith等
(1992)在冬黑麦草中所提取得到的质外体AFPs的氨基
表 2 牛血清蛋白(BSA)的停留温度、起始温度、冰晶含量和
热滞活性
Table 2 The hold and onset temperature (Th and To), ice
fraction and thermal hysteresis activity (THA) of BSA
Th (°C) -0.5 -0.4 -0.3 -0.2
To (°C) -0.5 -0.39 -0.3 -0.18
Nuclei (%) 62 24 8 -
THA (°C) 0 -0.01 0 -0.02
表 3 抗冻蛋白 A2 的停留温度、起始温度、冰晶含量和热滞
活性
Table 3 The hold and onset temperature (Th and To), ice
fraction and thermal hysteresis activity (THA) of the purified
antifreeze protein-A2
Th (°C) -3.0 -2.8 -2.5 -2.0
To (°C) -3.262 -3.062 -3.178 -14.43
Nuclei (%) 51 34 7 0
THA (°C) 0.262 0.262 0.678 -
图 7 部分熔融重冻结的抗冻蛋白 A2 DSC曲线
停留温度分别为-2.8 °C和-2.5 °C
Figure 7 DSC curvers of refereezing (0.5 °C.min-1) of par-
tially melted the purified antifreeze protein-A2
The hold temperature of the two curvers is -2.8 °C, -2.5 °C
图 8 抗冻蛋白 A2的全波长扫描光谱
Figure 8 Full spectrum scanning of the purified antifreeze
protein-A2, maximum absorption peak was found at 975 nm
表 4 抗冻蛋白 A2中各氨基酸的摩尔比和质量分数
Table 4 The molar ratio and mass ratio of amino acids of the
pur i f ied ant i f reeze protein-A2 f rom Ligust rum luc idum
leaves
A A
The molar ratio of amino The mass radio of amino
acid in A2 (%) acid in A2 (%)
Asp 18.6 24.9
Glu 5.43 8.03
Ser 1.55 1.63
His 4.02 6.24
Gly 25.2 18.9
Thr 1.86 2.22
Arg 1.37 2.39
Ala 4.39 3.91
Tyr 4.04 7.33
Cys-s 0.07 0.173
Val 1.92 2.25
Met 1.25 1.86
Phe 1.79 2.96
Ile 1.60 2.10
Leu 6.45 8.45
Lys 0.343 0.531
pro 5.33 6.13
509刘尚等: 一种女贞叶抗冻蛋白的分离纯化
酸含量类似。在本实验所得到的这种抗冻蛋白中, 亲水
性氨基酸占的比例较高, 抗冻蛋白与冰能特异性结合的
性质可能与其所含的亲水性氨基酸含量较高有关, 其结
构模型还需要进一步探索。
从我们的研究结果来看, 利用冰提的办法较易去除
杂蛋白、可以较为简便的获得抗冻蛋白。如果在冰提
之后直接用离子交换吸附, 再用凝胶过滤进行纯化就能
够达到大规模制备抗冻蛋白的目的, 以满足抗冻蛋白研
究与应用的需要。女贞叶抗冻蛋白的分子生物学特性
及其表达调控, 冰提的其它蛋白THA如何都还待研究。
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510 植物学通报 24(4) 2007
(责任编辑: 韩亚琴)
Purification of an Antifreeze Protein from Ligustrum lucidum
Leaves and Its Partial Characteristics
Shang Liu, Xiangru Liao*, Jianguo Zhang, Huijuan Miao
Educational Ministry Key Laboratary of Industrial Biotechnology, School of Biotechnology, Southern Yangtze University, Wuxi
214122, China
Abstract According to the ice-binding characteristic, antifreeze proteins in the leaves of Ligustrum lucidum were isolated by
adsorption to ice pieces at 0°C. Using Sephadex G-100 gel filtration and DEAE cellulose-52 anion exchange chromatography, we
obtained 4 protein fractions, including a 36 kDa protein, identified as antifreeze proteins by differential scanning calorimetry. The
THA value of the protein was approximately 0.678 °C when the protein concentration was 5 mg.mL-1. The maximal absorption peak
was 975 nm after full-spectrum scanning from 200 to 1 000 nm. The content of hydrophilic amino acids was relatively higher than
that of the other proteins.
Key words antifreeze protein, characteristic, ice-binding, Ligustrum lucidum, purification
Liu S, Liao XR, Zhang JG, Miao HJ (2007). Purification of an antifreeze protein from Ligustrum lucidum leaves and its part ial
characteristics. Chin Bull Bot 24, 505-510.
* Author for correspondence. E-mail: liaoxiangru@163.com