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Species-specific Identification of Larix gmelini, L. olgensis and L. principis-rupprechtii by RAPD Markers

兴安、长白及华北落叶松RAPD 分子标记的物种特异性鉴定



全 文 :植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 498-504, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-07-19; 接受日期: 2007-01-15
* 通讯作者。E-mail: wqyll@sina.com
.技术与方法.
兴安、长白及华北落叶松 RAPD 分子标记的
物种特异性鉴定
曲丽娜 1, 王秋玉 2*, 杨传平 2
1大庆师范学院, 大庆 163454; 2东北林业大学, 哈尔滨 150040
摘要 以中国北方地区主要乡土落叶松树种兴安落叶松(Larix gmelini)、长白落叶松(L. olgensis)和华北落叶松(L. principis-
rupprechtii)的针叶及种子胚乳为研究材料, 采用RAPD分子标记技术对3种落叶松进行不同物种的种间鉴别。结果表明, 通过
引物筛选得到了4个可以鉴别3种落叶松的RAPD引物, 其中有2个引物在落叶松针叶和种子胚乳基因组中都扩增出相同的条
带。引物OPB-11在兴安和长白落叶松基因组DNA中1 500 bp处扩增出特异条带, 而在华北落叶松中没有; 引物OPX-14在兴
安落叶松基因组DNA中1 200 bp处扩增出特异条带, 而在长白落叶松中没有; 还有2个引物可分别作为3种落叶松苗木和种子
鉴别的辅助标记。本研究从分子水平上为落叶松的种间鉴别提供了新的鉴定方法。
关键词 兴安落叶松, 长白落叶松, 华北落叶松, RAPD标记, 物种特异性鉴定
曲丽娜, 王秋玉, 杨传平 (2007). 兴安、长白及华北落叶松 RAPD分子标记的物种特异性鉴定. 植物学通报 24, 498-504.
兴安落叶松( La r i x g me l in i )、长白落叶松( L .
olgensis)及华北落叶松(L. principis-rupprechtii)是我国
北方重要的造林用材树种。兴安落叶松主要分布在我
国黑龙江省的大、小兴安岭; 长白落叶松主要分布于黑
龙江省东南部, 吉林东部长白山地区以及辽宁省; 华北落
叶松产于河北和山西2省, 分布在北京百花山、灵山及
河北小五台山(海拔 2 000-2 500 m)、河北围场、承
德雾灵山(海拔 1 400-1 800 m)、山西五台山、恒山
(海拔 1 800-2 800 m)等高山地带(胡新生和王笑山,
1999)。这3种落叶松的幼苗及种子外部形态极其相似,
单凭肉眼很难区分, 给落叶松种子的收购、经营和调配
带来很大困难。而林业生产中用种出现问题将会在经
济上造成巨大损失。为了解决落叶松属种子的鉴别问
题, 许多林业工作者进行了大量的研究(程凤琴和周铁程,
1994; 弓彩霞和乔辰,1994; 王建中和王瑞勤,1994; 杨茜
和乔辰, 1995, 2005; 于海中等,1999), 但鉴别结果都不
理想。
本文采用 47个 RAPD随机引物先后对兴安落叶
松、长白落叶松以及华北落叶松的针叶二倍体基因组
DNA和胚乳单倍体基因组DNA分别进行了RAPD-PCR
扩增, 目的是寻找各落叶松物种的特异性DNA片段, 为
鉴别 3种落叶松提供简单又准确的分子标记。
1 材料与方法
1.1 实验材料
针叶材料来自东北林业大学帽儿山实验林场30年生落
叶松种间对比试验林, 每个物种随机选择10个样本, 分
别采集针叶并装袋登记, 冷冻保存。种子材料来自不同
地区: 兴安落叶松(Larix gmelini)种子来自黑龙江省乌伊
岭林业局, 长白落叶松(L. olgensis)种子来自黑龙江省小
北湖和白刀山林业局, 华北落叶松( L . p r i n c i p i s -
rupprechtii)种子来自北京市林业局, 每个物种随机选择
50粒种子组成样本群体。
1.2 实验方法
1.2.1 种子的处理
选择饱满的种子, 在温度为 28°C、相对湿度 80%以上
499曲丽娜等: 兴安、长白及华北落叶松 RAPD分子标记的物种特异性鉴定
的环境中进行发芽。待种子开裂后, 剥掉种皮, 去胚, 留
下胚乳进行基因组 DNA的提取。
1.2.2 基因组DNA的提取与检测
本研究采用改良的CTAB法(Doyle and Doyle, 1990) 先
后对落叶松针叶和种子胚乳进行基因组DNA提取。操
作步骤如下: 取单株针叶约 0.3 g在研钵中用液氮仔细
研磨成白色粉末; 同样, 将单粒种子胚乳用液氮在低温下
研磨成白色粉末, 分别放入700 mL预热的CTAB提取液,
再加入 20 mL巯基乙醇, 65°C保温 30分钟, 期间每隔
5-10分钟轻轻摇动使材料与提取液充分混匀; 加入700
mL氯仿: 异戊醇(24:1, v/v), 混匀, 10 600×g 离心10分
钟, 取上清; 重复2次; 加入700 mL异丙醇室温放置10
分钟沉淀, 10 600×g 离心 10分钟, 弃上清; 70%乙醇
清洗2次沉淀以去除沉淀表面的无机盐离子及小分子物
质; 37°C气干; 加入 50 mL无菌去离子水, -20°C保存
备用。
以提取的2种基因组DNA为模板, 根据Williams等
(1990)给出的框架, 在保持基本成分不变的基础上, 逐一
对其RAPD反应成分进行调整, 最终得到优化的RAPD
反应体系。总体积(20 µL)包括: 2 mmol·L-1的 dNTP
1.5 µL, 10×buffer 2 µL, 2 mmol·L-1的Mg2+ 1.6 µL, 4
µmol·L-1的引物2.0 µL, 5 U·µL-1 Taq聚合酶0.2 µL, 浓
度约为 30 ng的模板 DNA 1.5 µL, 灭菌去离子水 11.2
µL。RAPD扩增程序: 94°C预变性, 4分钟; 94°C变性
1分钟, 37°C退火1分钟, 72°C延伸2分钟, 40个循环;
72°C延伸, 10分钟。扩增产物用 1.5%的琼脂糖凝胶
(含0.5 µL·mL-1 EB)电泳检测分析, Bio-image Systems
(GG/D2-GeneGenius2) 照相, 保存图片。
2 结果与分析
2.1 引物的筛选
通过文献检索预选了47个RAPD随机引物(Arcade and
Anselin, 2000; Scheepers et al., 2000)用于对2种落
叶松的针叶二倍体和种子胚乳单倍体基因组DNA的扩
增, 每个物种取 2个样本, 从中选出带型清晰、重复性
好、稳定性高、种内一致性较高且种间具有特异性的
RAPD引物。针对二倍体基因组DNA筛选出3个引物:
OPB-11、OPN-07和OPX-14。针对种子胚乳单倍体
DNA筛选出 3个引物: OPB-11、OPN-17和OPX-14。
引物碱基序列如表 1。
2.2 针叶二倍体D N A为模板的物种特异性引物
的扩增
研究表明, 引物OPB-11 在 1 500 bp处扩增出特异片
图 1 引物OPB-11对针叶 DNA模板的扩增结果
1-10: 长白落叶松; 11-20: 兴安落叶松; M: Marker
Figure 1 Amplified result of the template DNA from the needles by primer OPB-11
1-10: Larix olgensis; 11-20: L. gmelini; M: Marker
500 植物学通报 24(4) 2007
段, 由图1和图2可以清楚地看出, 兴安和长白落叶松在
1 500 bp处有特异片段, 华北落叶松在 1 500 bp处没
有特异片段。
由图3可见, 引物OPX-14在约1 200 bp处扩增出
特异片段, 即兴安落叶松在1 200 bp处有特异片段, 而
长白落叶松在 1 200 bp处没有特异片段。
此外, 由图4也可以清晰地看见, 引物OPN-07在约
600 bp处扩增出特异片段, 即兴安落叶松在 600 bp处
有特异片段, 而长白落叶松在600 bp处没有特异片段。
因此, 针对3种落叶松的针叶材料, 可以采用引物OPB-
11的扩增结果, 首先将华北落叶松与兴安和长白落叶松
区分开来, 然后再用引物OPX-14和OPN-07的扩增结
果鉴别兴安落叶松和长白落叶松。
由于种内个体间存在遗传差异, 在对每个物种10个
样本进行检测时 , 特异片段的检出频率没有达到
100%, 3个引物对3种落叶松的所有针叶样本检测的
结果见表 2。
2.3 种子胚乳单倍体DNA为模板的物种特异性引物
的扩增
在对3种落叶松针叶基因组RAPD分子标记物种特异性
检测的基础上, 又以种子胚乳DNA为模板进行了检测。
研究发现, 引物OPB-11在约1 500 bp处扩增出清晰的
物种特异片段(图5), 华北落叶松几乎没有条带或条带很
弱, 而兴安落叶松和长白落叶松有很清晰的特异条带。
此外, 由图6可见, 引物OPX-14在兴安落叶松基因
组约1 200 bp处扩增出特异片段, 而长白落叶松没有。
表 1 引物碱基序列及特异片段大小
Table 1 Sequence of the primers and the size of specific
fragment
Name of primer Sequence Size of specific fragment (bp)
OPB-11 GTAGACCCGT 1 500
OPX-14 AGGGCGTAAG 1 200
OPN-07 CAGCCCAGAG 600
OPN-17 GGGTAACGCC 400
图 2 引物OPB-11对针叶 DNA模板的扩增结果
1-10: 华北落叶松; M: Marker
Figure 2 Amplified result of the template DNA from the needles
by primer OPB-11
1-10: Larix principis-rupprechtii; M: Marker
图 3 引物OPX-14对针叶 DNA模板的扩增结果
1-10: 长白落叶松; 11-20: 兴安落叶松; M: Marker
Figure 3 Amplified result of the template DNA from the needles by primer OPX-14
1-10: Larix olgensis; 11-20: L. gmelini; M: Marker
501曲丽娜等: 兴安、长白及华北落叶松 RAPD分子标记的物种特异性鉴定
表 2 RAPD引物以及落叶松针叶基因组特异片段检测率
Table 2 RAPD primers and the percentage of specific fragment detected from the needle’s genome
Primers Species
Size of specific No. of detected No. of samples with Percentage of samples
fragment (bp) samples specific fragment with specific fragment (%)
OPB-11 Larix gmelini 1 500 10 10 100
L. olgensis 1 500 10 6 60
L.principis-rupprechtii 0 10 0 0
OPX-14 L. gmelini 1 200 10 10 100
L. olgensis 0 10 0 0
L.principis-rupprechtii 0 10 0 0
OPN-07 L. gmelini 600 10 10 100
L. olgensis 0 10 0 0
L.principis-rupprechtii 600 10 10 100
图 4 引物OPN-07对针叶二倍体 DNA模板的扩增结果
1-10: 长白落叶松; 11-20: 兴安落叶松; M: Marker
Figure 4 Amplified result of the template DNA from the needles by primer OPN-07
1-10: Larix olgensis; 11-20: L. gmelini; M: Marker
图 5 引物OPB-11对种子胚乳DNA模板的扩增结果
1-5: 华北落叶松; 6-10: 长白落叶松; 11-15: 兴安落叶松; M: Marker
Figure 5 Amplified result of the template DNA from the endosperm by primer OPB-11
1-5: Larix principis-rupprechtii; 6-10: L. olgensis; 11-15: L. gmelini; M: Marker
502 植物学通报 24(4) 2007
同时, 引物OPN-17在约400 bp处扩增出物种特异片段
(图 7), 华北落叶松有 400 bp片段, 长白落叶松没有。
因此, 针对3种落叶松的种子胚乳材料, 首先可以采
用引物OPB-11的扩增结果将华北落叶松与兴安和长白
落叶松区分开, 然后再用引物OPX-14的扩增结果将兴
安落叶松和长白落叶松鉴别分开。同时, 也可以用引物
OPN-17的扩增结果对华北落叶松和长白落叶松的物种
特异性进行辅助性鉴别。
对种子材料, 每个落叶松物种检测50个样本, 由于
物种内存在遗传多样性, 特异片段的检出率也没有达到
100%, 3个引物对3种落叶松的所有样品检测的数据统
计见表 3。
以上研究表明, 不论是以针叶为材料还是以种子胚
乳为材料, 采用4种引物中的2个特定引物组合可鉴别
3个落叶松物种, 即用引物OPB-11对3种落叶松基因组
DNA的PCR扩增可将华北落叶松鉴定出来, 然后再用
引物OPX-14将兴安落叶松与长白落叶松区分开。此外,
还可采用OPB-11和OPN-07, 或者OPX-14和OPN-07引
物对3种落叶松的针叶样品进行鉴定; 采用OPX-14和OPN-
17引物对来自 3种落叶松种子胚乳DNA进行鉴别。
图 6 引物OPX-14对种子胚乳单倍体 DNA模板扩增结果
1-10: 兴安落叶松; 11-20: 长白落叶松; M: Marker
Figure 6 Amplified result of the template DNA from the endosperm by primer OPX-14
1-10: Larix gmelini; 11-20: L. olgensis; M: Marker
图 7 引物OPN-17对种子胚乳单倍体DNA模板扩增结果
1-10: 长白落叶松; 11-20: 华北落叶松; M: Marker
Figure 7 Amplified result of the template DNA from the endosperm by primer OPN-17
1-10: Larix olgensis; 11-20: L. principis-rupprechtii; M: Marker
503曲丽娜等: 兴安、长白及华北落叶松 RAPD分子标记的物种特异性鉴定
表 3 RAPD引物以及落叶松种子胚乳 DNA特异片段检测率
Table 3 RAPD primers and the percentage of specific fragment detected in endosperm DNA from the seeds
Primers Species
Size of specific No. of detected No. of samples with Percentage of samples
fragment (bp) samples specific fragment with specific fragment (%)
OPB-11 Larix gmelini 1 500 50 42 84
L. olgensis 1 500 50 43 86
L.principis-rupprechtii 0 50 0 0
OPX-14 L. gmelini 1 200 50 43 86
L. olgensis 0 50 0 0
L.principis-rupprechtii 0 50 0 0
OPN-17 L. gmelini 400 50 3 6
L. olgensis 0 50 0 0
L.principis-rupprechtii 400 50 43 86
3 讨论
3.1 落叶松种间鉴别的重要性
落叶松属的各物种在外形上非常相似, 其种子以及幼苗
难以区别。许多学者在其物种鉴别上做了多方面的尝
试。王建中和王瑞勤(1994)通过对落叶松种子的表面结
构进行了扫描电镜观察, 对不同种的落叶松种子表面结
构进行了分类性的归纳。程凤琴和周铁程(1994)采用
对落叶松种子进行核型分析来达到鉴别目的。杨茜和
乔辰(2005)对落叶松种子的过氧化物酶、酯酶、 超氧
化物歧化酶和淀粉酶的同工酶进行了分析, 采用不连
续、垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳法, 得到不同落叶松
物种同工酶的酶谱, 根据各个酶的多态性及酶带数将几
种落叶松鉴别开来。但这些鉴别落叶松种间差别的方
法准确性不高, 易受偶然因素影响, 因此鉴定结果并不十
分准确。
3.2 RAPD标记用于落叶松物种鉴别的稳定性
对于不同的物种, 其基因组DNA所携带的遗传信息必然
有所不同, 只不过亲缘关系近的物种差异程度小, 亲缘关
系远的差异程度大。因此, DNA分子标记被越来越多
地用于物种鉴定和种间亲缘关系分析。特别是 RAPD
分子标记, 具有操作简单、快速和DNA用量少等特点,
近 10多年来受到人们重视, 并得到广泛应用。但同时
它也存在特异谱带的稳定性和重复性等问题。在对3种
落叶松针叶和胚乳基因组DNA进行PCR扩增时发现,
有些 RAPD 标记具有较好的遗传稳定性, 如用引物
OPB-11和OPX-14不论是在落叶松针叶还是在种子胚
乳中都扩增出相同的物种特异性条带。但在扩增时, 特
异条带出现的频率没有达到100%, 其原因可能是由于模
板上引物结合位点发生突变造成个体间在DNA指纹上
的差异。对每个物种10个针叶样本和每个种批的50粒
种子的扩增情况进行统计, 这种个别个体在特异片段处
表现出的不稳定性并不影响最终鉴别结果的可靠性。
因此, 可以通过增加检测样本数量来消除这种不稳定因
素带来的影响。
本研究以针叶二倍体DNA和种子胚乳单倍体DNA
为模板分别筛选出 3个物种特异性 RAPD引物, 其中
OPB-11和OPX-14两个引物在对2种不同材料的扩增
时得到完全相同的结果。其它 2个引物在二倍体DNA
和单倍体 DNA为模板的扩增结果中有所不同, 引物
OPN-07对二倍体基因组DNA扩增得到物种特异片段,
而针对单倍体基因组DNA的扩增没有出现相应的物种
特异片段。同样, 引物OPN-17在对针叶二倍体 DNA
上没有扩增得到物种特异片段, 而以单倍体基因组DNA
为模板却扩增出相应的物种特异片段。其原因可能是
由于二倍体的基因型有纯合体和杂合体之分, 而单倍体
的基因型只有一种可能, 而RAPD分子标记是显性标记,
不能区分显性纯合体和杂合体。因此, 对单倍体和二倍
体材料进行 RAPD-PCR时有可能出现不同扩增结果。
本研究中的针叶材料每个物种只有10个样本, 没有
达到小样本数量 , 但其特异片段的检出率基本达到
504 植物学通报 24(4) 2007
100%(OPB-11对长白落叶松除外), 并且在针叶和种子
胚乳2种不同器官中引物OPB-11和OPX-14检出的特
异片段完全相同, 从而保证了检测结果的稳定性。但如
果只以落叶松针叶为材料进行检测, 建议最好扩大样本
数量, 以保证鉴别结果的可靠性。
3.3 RAPD标记用于落叶松物种鉴别的可行性
研究结果表明, 采用特定的RAPD引物扩增3种落叶松
基因组DNA, 可检测到明显的差异条带。这说明3种落
叶松在基因组水平上存在明显的遗传变异, 分子标记技
术不仅可以用于落叶松种内群体遗传多样性检测, 也可
用于种间鉴定。也就是说, 只要引物筛选得当, 结合适
当的样本数量进行兴安落叶松、长白落叶松及华北落
叶松的物种鉴定是完全可行的。
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(责任编辑: 白羽红)
Species-specific Identification of Larix gmelini, L. olgensis and
L. principis-rupprechtii by RAPD Markers
Lina Qu1 , Qiuyu Wang 2*, Chuanping Yang2
1 Daqing Normal University, Daqing 163454, China; 2Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract This article describes the species-specific identification of the needle and seed endosperm of the main native larch
species (Larix gmelini, L. olgensis and L. principis-rupprechtii) from northern China by RAPD. Four primers with high polymor-
phism and repeatability were obtained to distinguish the three species. Use of the primer OPB-11 amplified the same species-
specific bands of genomic DNA in L. gmelini and L. olgensis at 1 500 bp but not in L. principis-rupprechtii. Use of the primer OPX-
14 amplified the species-specific band in L. gmelini at 1 200 bp but not in L. olgensis, both from needle and seed endosperm. The
other two primers were used to identify L. gmelini and L. olgensis with needles as the material and to identify L. olgensis and L.
principis-rupprechtii with endosperms as the material, respectively. This study provides a new method for species-specific
identification of these three larch species at the molecular level.
Key words Larix gmelini, L. olgensis, L. principis-rupprechtii, RAPD marker, species-specific identification
Qu LN, Wang QY, Yang CP (2007). Species-specific identification of Larix gmelini, L. olgensis and L. principis-rupprechtii by RAPD
markers. Chin Bull Bot 24, 498-504.
*Author for correspondence. E-mail: wqyll@sina.com