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Study on the Genetic Diversity of Osmanthus fragrans Cultivars

桂花品种资源的遗传多样性分析



全 文 :植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (5): 559-564, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-01-02; 接受日期: 2008-05-09
基金项目: 国家自然科学基金(No.30670137)和河南省高校创新人才基金
* 通讯作者。E-mail: fudeshang@henu.edu.cn
.实验简报.
桂花品种资源的遗传多样性分析
韩远记, 董美芳, 袁王俊, 尚富德 *
河南大学生命科学学院, 农业生物技术研究所, 开封 475001
摘要 根据桂花(Osm anthus fragrans)品种的形态特征, 结合AFLP分子标记, 对部分桂花栽培品种进行了遗传多样性分
析。结果表明, 桂花品种之间存在着较为丰富的遗传多样性, AFLP分子标记检测到的多态性条带占总扩增条带的57.46%。
根据桂花品种的主要性状特征, 利用数值分类法对其进行分类, 并用UPGMA法对AFLP结果进行聚类分析, 结果均显示桂林地
区的桂花品种存在明显的区域性, 花色可以作为重要的分类标准, 同时对桂花品种的分类系统进行了探讨。
关键词 AFLP, 遗传多样性, 形态特征, 桂花品种
韩远记 , 董美芳 , 袁王俊 , 尚富德 (2008). 桂花品种资源的遗传多样性分析. 植物学通报 25, 559-564.
桂花(Osmanthus fragrans Lour. )又名木犀, 是木犀
科(Oleaceae)、木犀属(Osmanthus )植物, 原产我国,
且在我国的栽培历史悠久。秦岭以南至南岭以北的北
亚热带和中亚热带地区(北纬 23°-33°)是我国桂花分布
和栽培的主要地区。随着气候的变暖以及气候带的北
移, 桂花品种的分布范围也在向北推移。目前, 我国主
要有五大桂花产区, 分别是湖北咸宁、江苏苏州、浙
江杭州、四川成都和广西桂林。桂花是我国著名的芳
香植物, 不同品种的花有白色、黄色和橙红色等, 是著
名的园林绿化树种, 在香料、药材和食品工业等方面也
有很大的开发和利用潜力。桂花品种分类方面, 多数学
者以开花季节作为第一分类标准, 把桂花分为两类: 四季
桂类和秋桂类, 以花色作为第二分类标准把秋桂类又分
为银桂品种群、金桂品种群和丹桂品种群(刘玉莲,
1985; 鲁涤非, 1986)。目前, 桂花品种的分类主要是沿
用两类 4个品种群的分类系统。
我们对来自中国主要桂花产区的部分桂花品种采用
形态特征和AFLP分子标记相结合的方法进行了遗传多
样性分析, 以期为进一步了解我国桂花品种的遗传分化
程度, 探讨桂花品种之间的亲缘关系和桂花品种的分类
系统提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料来源
本研究共选用桂花(Osmanthus f ragrans Lour. )品种材
料 45个, 其中 21个材料取自桂林市黑山植物园, 22个
采自上海市桂林公园, 2个采自河南大学校园(表 1)。取
桂花的叶片, 用硅胶快速干燥后带回实验室, 用双蒸水冲
洗干净, 放入-70°C冰箱中保存备用。
1.2 方法
1.2.1 桂花品种形态性状的选取及编码
利用数值分类法对不同的桂花品种进行数量分类, 选取
桂花品种的 15 个性状, 分别是叶形、叶缘锯齿情况、
叶长、叶宽、叶面弯曲程度、叶柄长、侧脉对数、
花色、花冠形状、花直径、花梗长、每节有芽数、
叶缘波曲程度、叶基形状和叶尖形状。其中 8 个连续
数值性状, 分别是叶长、叶宽、叶柄长、侧脉对数、
花色、花直径、花梗长和每节芽数。45 个桂花品种
均采用测量的平均值。7个多态性状, 按照性状变化趋
势, 连续赋值。叶形: 长椭圆状披针形为 0, 椭圆状披
针形为 1, 椭圆形为 2, 卵状椭圆形为 3, 卵圆形为 4, 倒
560 植物学通报 25(5) 2008
表 1 供试的桂花品种
Table 1 Osmanthus fragrans cultivars used in this study
Group Osmanthus fragrans cult ivars Collection Or igin or main cultivated place
Fragrans group O. fragrans ‘Yueyuegui’ Shanghai China
O. fragrans ‘Tianx iangtaige’ Shanghai Jinhua, Zhejiang
O. fragrans ‘Daye Sijigui’ Shanghai China
O. fragrans ‘Fodingzhu’ Shanghai Chengdu, Sichuan
O. fragrans ‘Sijigui’ Shanghai China
O. fragrans ‘Rixianggui’ Shanghai Cangx i, Sichuan
Latif olius group O. fragrans ‘Zaoyingui’ Shanghai Hangzhou, Zhejiang?
O. fragrans ‘Baijie’ Shanghai Suzhou, Jiangsu
O. fragrans ‘Xuegui’* Shanghai Guilin Garden
O. fragrans ‘Changyezaoyingui’ Shanghai Guilin Garden
O. fragrans ‘Ziyingui’ Shanghai Guilin Garden
O. fragrans ‘Wanyingui’ Shanghai Guilin Garden
O. fragrans ‘Zaohuang’ Shanghai Guilin Garden
O. fragrans ‘Liuyegui’ Shanghai South of Yangzi River
O. fragrans ‘Jiulonggui’ Shanghai Sichuan
O. fragrans ‘Xiaoye Z iyingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Ziyun’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Baozhu’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Taoye Ziyingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Yuanji Yingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Xiaoye Yingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Zie’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Xiaojiabiyu’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Lijiangzhibo’
O. fragrans ‘Juanye Z iyingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Liuye Ziyingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Mantianxing’ Guilin Heishan Garden
Thunbergii group O. fragrans ‘Yuanban Jingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Heishanzhizhu’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Jinlian’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Taoye Jingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Zao Jingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Hanxiao’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Heishan Jingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Yuanye Jingui’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Zijingui’** Shanghai Guilin Garden
O. fragrans ‘Jingui’ Shanghai China
O. fragrans ‘Zhouye Jingui’ Shanghai China
Aurantiacus group O. fragrans ‘Zuijihong’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Danxin’ Guilin Heishan Garden
O. fragrans ‘Zhushagui’ Shanghai East China
O. fragrans ‘Baiyu Dangui’ Shanghai Guilin Garden
O. fragrans ‘Yingye Dangui’ Shanghai Hubei, East China
O. fragrans ‘Yanhonggui’*** Shanghai Chengdu, Sichuan
* 雪桂暂归为银桂品种群; ** 籽金桂暂归为金桂品种群; *** 堰虹桂为暂定名
* O. fragrans ‘Xuegui’ is belonged to Latif olius group prov is ionally; ** O. fragrans ‘Zijingui’ is belonged to Thunbergii group
provisionally; *** O. fragrans ‘Yanhonggui’ is prov isional name
卵状椭圆形为 5; 叶缘锯齿情况: 全缘为 0, 全缘或先端
偶有锯齿为1, 1/2以上有锯齿为2, 2/3以上有锯齿为3,
叶缘密被锯齿为 4; 叶面弯曲程度: 叶面平展为 0, 微内
折为 1, 内折和中脉凹陷为 2, U形内折为 3; 花冠形状:
近平展为 0, 斜展为 1, 微内扣为 2, 内扣为 3; 叶缘波曲
程度: 叶缘平展为 0, 微波状为 1, 波状为 2; 叶基形状:
狭楔形为 0, 楔形为 1, 宽楔形为 2, 近圆形为 3; 叶尖形
状: 短尖为 0, 渐尖为 1, 长渐尖为 2, 长尖为 3。
561韩远记等: 桂花品种资源的遗传多样性分析
1.2.2 DNA的提取
取 0.6 g硅胶干燥的叶片提取DNA。提取步骤参照Ude
等(2002)的方法; 并用 5 mol.L-1的 NaCl和水饱和乙醚
除去叶片中的多糖(程运江等, 2001)。用紫外分光光度
计检测DN A 纯度。
1.2.3 AFLP 分子标记实验
取 2.5 mL DNA样品(大约含有 250 ng DNA), 用 EcoRI
和MseI进行双酶切。在 PTC-100TM PCR仪上进行扩
增, EcoRI和MseI预扩增引物序列分别为 5-GACTG-
CGTACCAATTCA-3和5-GATGAGTCCTGAGTAAC-3,
选择性扩增引物为 3个核苷酸(表 2)。扩增和银染程序
的具体步骤参见韩远记等(2008)的实验方法。
1.2.4 扩增条带的处理
每个样品的电泳条带用 1和 0进行赋值, 对扩增产生信
号较强且重复性较好的条带记为 1, 而同一位置上扩增
产生信号较弱、重复性较差的条带或者未出现条带的
记为 0。利用 DPSv3.11软件对结果进行统计分析, 计
算遗传距离 , 按照非加权算术平均数聚类方法
(unweighted pair-group method us ing arithmet ic
averages, UPGMA)进行聚类, 构建系统分析树状图。
2 结果与分析
2.1 形态性状的聚类结果
利用 NTSYS 软件对 41个桂花品种(不包括含笑、雪桂
和籽金桂)的形态特征数据进行标准化, 采用UPGMA法
进行聚类, 得到树状图(图 1)。从图 1可以看出, 在欧氏
遗传距离L=5.01处, 可以把41个桂花品种分为8类: 第
1类有 25 个品种, 分别是丹心、早金桂、圆瓣金桂、
圆叶金桂、圆基银桂、佛顶珠、醉肌红、满天星、
桃叶籽银桂、小叶籽银桂、漓江之波、宝珠、紫萼、
紫云、晚银桂、小叶银桂、小家碧玉、桃叶金桂、
卷叶籽银桂、黑山金桂、柳叶籽银桂、日香桂、籽
银桂、长叶早银桂和柳叶桂, 其中 19 个是桂林地区品
种。第 2类有 3个品种, 包括 2个银桂品种和 1个金桂
品种, 分别是早银桂、白洁和金桂。第 3 类为 3 个金
桂品种: 金莲、黑山之珠和皱叶金桂。第 4 类有 5 个
品种, 其中 1个银桂品种, 4个丹桂品种, 分别是早黄、
硬叶丹桂、败育丹桂、堰虹桂和朱砂桂。第 5 类是 1
个银桂品种: 九龙桂。第 6类包含 2个四季桂品种: 月
月桂和四季桂。第 7 类是 1 个四季桂品种: 大叶四季
桂。第 8类也是 1个四季桂品种: 天香台阁。
2.2 AFLP分子标记扩增结果
从64对引物中筛选出了5对引物(表2), 这5对引物可以
产生稳定的且重复性较好的扩增图谱。扩增片段的分
子量在 100-1 000 bp之间, 这 5对引物共产生 228条
DNA条带, 平均每对引物产生约 46个条带, 其中多态性
带共 131条, 占 57.46%, 与我们以前的研究结果(多态
性条带占 60.80%)较为接近(韩远记等, 2008)。说明桂
花品种之间有着较为丰富的遗传多样性。
2.3 供试桂花品种的聚类分析
根据桂花品种AFLP图谱上DNA条带的统计结果, 利用
DPS软件中的UPGMA聚类法对供试的43个桂花品种
(不包括堰虹桂)进行聚类, 得到树状分支图(图 2)。在遗
传距离 L=0.315处, 可以把桂花品种分为 4大类。第 I
大类有 20 个品种, 这 20 个桂花品种全部来自桂林地
区。在遗传距离 L=0.285处, 又可以将其中 19个品种
分为 2类, 第 1类包括9个银桂品种和2个金桂品种, 分
别是满天星、柳叶籽银桂、卷叶籽银桂、漓江之波、
小家碧玉、紫萼、小叶银桂、圆基银桂、桃叶籽银
表 2 引物组合、序列和扩增结果
Table 2 Primer combinations, sequence and results of ampli-
f ication
Pr imer Number of f ragments Number of
combinations scored polymorphic
fragments
E-ACG/M-CTA 50 28
E-AAC/M-A AG 43 25
E-ACG/M-CTT 42 25
E-ACG/M-CAG 45 26
E-AAG/M-CAT 48 27
E: GA CTGCGTACCAATTC; M: GATGAGTCCTGA GTA A (5-3)
562 植物学通报 25(5) 2008
桂、圆瓣金桂和黑山之珠, 这一类中多数为花色较浅的
银桂品种。第 2 类包括 5 个金桂品种、2 个丹桂品种
和 1 个银桂品种, 分别是金莲、桃叶金桂、早金桂、
含笑、黑山金桂、醉肌红、丹心和宝珠, 这一类多为
花色较深的金桂和丹桂品种。第 II大类有21个品种, 其
中除小叶籽银桂外, 其余的均采自上海市桂林公园。在
遗传距离 L=0.270处, 这 21个品种又可以分为 4类, 第
1类包括6个银桂品种和1个丹桂品种, 分别是小叶籽银
桂、九龙桂、柳叶桂、早黄、晚银桂、籽银桂和
朱砂桂, 此类中多为花色较浅的银桂品种。第 2类包括
5个四季桂品种、2个银桂品种、3个金桂品种和 2个
丹桂品种, 分别是月月桂、天香台阁、大叶四季桂、
佛顶珠、四季桂、长叶早银桂、雪桂、籽金桂、金
桂、皱叶金桂、败育丹桂和硬叶丹桂。此类群虽然包
图 1 41个桂花品种的形态特征聚类分析树状图
1: 月月桂; 2: 天香台阁; 3: 大叶四季桂; 4: 佛顶珠; 5: 四季桂; 6: 日香桂; 7: 早银桂; 8: 白洁; 10: 长叶早银桂; 11: 籽银桂; 12: 晚银桂; 13:
早黄; 14: 柳叶桂; 15: 九龙桂; 16: 小叶籽银桂; 17: 紫云; 18: 宝珠; 19: 桃叶籽银桂; 20: 圆基银桂; 21: 小叶银桂; 22: 紫萼; 23: 小家碧
玉; 24: 漓江之波; 25: 卷叶籽银桂; 26: 柳叶籽银桂; 27: 满天星; 28: 圆瓣金桂; 29: 黑山之珠; 30: 金莲; 31: 桃叶金桂; 32: 早金桂; 34: 黑
山金桂; 35: 圆叶金桂; 37: 金桂; 38: 皱叶金桂; 39: 醉肌红; 40: 丹心; 41: 朱砂桂; 42: 败育丹桂; 43: 硬叶丹桂; 44: 堰虹桂
Figur e 1 A dendrogram of 41 Osmanthus fragrans cultivars drived by UPGMA based on morphological data
1: O. fragrans ‘Y ueyuegui’; 2: O. fragrans ‘Tianxiangtaige’; 3: O. fragrans ‘Daye Sijigui’; 4: O. fragrans ‘Fodingzhu’; 5: O.
fragrans ‘Sijigui’; 6: O. fragrans ‘Rixianggui’; 7: O. fragrans ‘Zaoyingui’; 8: O. fragrans ‘Baijie’; 10: O. fragrans ‘Changye
Zaoyingui’; 11: O. fragrans ‘Ziy ingui’; 12: O. fragrans ‘Wanyingui’; 13: O. fragrans ‘Zaohuang’; 14: O. fragrans ‘Liuyegui’; 15: O.
fragrans ‘Jiulonggui’; 16: O. fragrans ‘Xiaoye Ziy ingui’; 17: O. fragrans ‘Ziyun’; 18: O. fragrans ‘Baozhu’; 19: O. fragrans ‘Taoye
Ziyingui’; 20: O. fragrans ‘Yuanji Yingui’; 21: O. fragrans ‘Xiaoye Yingui’; 22: O. fragrans ‘Zie’; 23: O. fragrans ‘Xiaojiabiyu’; 24:
O. fragrans ‘Lijiang zhibo’; 25: O. fragrans ‘Juanye Z iyingui’; 26: O. fragrans ‘Liuye Ziyingui’; 27: O. fragrans ‘Mantianxing’; 28:
O. fragrans ‘Yuanban Jingui’; 29: O. fragrans ‘Heishanzhizhu’; 30: O. fragrans ‘Jinlian’; 31: O. fragrans ‘Taoye Jingui’; 32: O.
fragrans ‘Zao Jingui’; 34: O. fragrans ‘Heishan Jingui’; 35: O. fragrans ‘Yuanye Jingui’; 37: O. fragrans ‘Jingui’; 38: O. fragrans
‘Zhouye Jingui’; 39: O. fragrans ‘Zuijihong’; 40: O. fragrans ‘Danxin’; 41: O. fragrans ‘Zhushagui’; 42: O. fragrans ‘Baiyu Dangui’;
43: O. fragrans ‘Yingye Dangui’; 44: O. fragrans ‘Yanhonggui’
563韩远记等: 桂花品种资源的遗传多样性分析
括了 4个品种群的桂花品种, 但是它们多是花色较深和
花色较浅的品种分别先聚在一起, 然后花色深浅不同
的两类品种才聚在一起。第 3类包括 1个银桂品种白
洁。第 4 类有 1 个银桂品种早银桂。第 I I I 大类是 1
个四季桂品种: 日香桂。第 IV 大类是 1 个金桂品种:
圆叶金桂。
3 讨论
桂花在我国的栽培历史悠久, 由于自然选择和人工选择
的共同作用, 使桂花品种之间出现了较大的遗传变异, 形
成了众多的品种, 目前, 我国有 157个桂花品种。在本
研究中, 桂花品种之间的遗传和分化非常明显, 利用数值
分类法, 在欧氏遗传距离 5.01处可以把 41个桂花品种
明显地分为 8类, 而且很好地区分了每一个品种。AFLP
图谱上统计的多态性条带占总扩增条带的 57. 46% ,
每对引物的扩增图谱上均有某些桂花品种出现特异性
条带, 这都说明桂花品种之间存在着较为丰富的遗传
多样性。
陆瑞林(1989)认为桂花花色的变化因开花季节不同
而异, 由于花色的不稳定故未立其它变种或变型。而事
实上, 桂花各个个体的花色是很稳定的, 因此, 我们不能
只把桂花当成一个大的复合种群 (刘玉莲和向其柏,
2000)。深入开展桂花品种的分类研究工作, 对合理开
发和利用桂花具有重要的意义。目前, 桂花品种的 2类
4个品种群的分类标准较为合理, 无论是在园林绿化, 还
是在桂花新品种的培育以及香料的提取等方面都有很好
的实用性。在本研究中, 利用数值分类法, 在欧氏遗传
距离 4.80处, 把 41个桂花品种分为 9类。在这 9类中,
或者是花色较深的多数桂花品种聚在一起, 或者是花色
较浅的多数桂花品种聚在一起。分子标记聚类结果也
显示, 花色深或者浅的多数品种分别先聚在了一起。这
说明花色色质较近的桂花品种之间存在着较近的亲缘关
系, 因此花色可以作为桂花品种分类的一个重要标准, 这
也分别从形态和分子水平上支持了现有的桂花品种分类
标准; 同时也表明刘玉莲(1985)和朱长山(1992)等根据花
色对桂花品种进行分类具有一定的合理性。
无论是用数值分类法还是用 AFLP 分子标记分析,
聚类结果都显示: 桂林地区的多数桂花品种首先聚在一
起, 然后再与其它地区的桂花品种聚在一起, 说明桂林地
区的桂花品种具有明显的区域性。本实验中所用的桂
林地区的桂花品种多数为本地品种, 可能很少与外地桂
花品种交流, 所以其遗传多样性程度较其它地区的桂花
品种要低。基于形态特征和 AF LP 分子标记分析的结
图 2 43个桂花品种的AFLP分子标记聚类分析树状图
1-8、10-32、34-35和 37-43: 同图 1; 9: 雪桂; 33: 含笑; 36:
籽金桂
Figur e 2 A dendrogram of 43 Osmanthus fragrans cultivars
dr ived by UPGMA based on A FLP data
1-8, 10-32, 34-35 and 37-43: See Figure1; 9: O. fragrans
‘Xuegui’; 33: O . fragrans ‘Hanxiao’; 36: O . fragrans ‘Zijingui’
564 植物学通报 25(5) 2008
果, 推测桂林地区的桂花品种可能有着单独的起源, 下一
步我们将对桂花的自然分布居群进行系统学研究, 以确
定桂林地区的桂花品种是否为单独起源。
本研究结合数值分类法和 AFLP分子标记技术2种
手段对 44个桂花品种进行了分析, 得到了 2个树状图。
聚类结果基本上相吻合, 都体现出桂林地区桂花品种具
有明显的区域性, 并支持把花色作为桂花品种重要的分
类标准。但是, 2个树状图也有一些差异, 有些桂花品
种在用数值分类法所得的树状图中聚在了一起, 而在用
AFLP 分子标记分析所得树状图中却显示遗传距离较远,
其主要原因是形态特征是环境和基因共同作用的结果,
在所选的 15个性状中, 有 10个是叶部的形态特征, 叶
作为营养器官比花更容易受到环境的影响, 因此, 形态特
征聚类结果体现的是环境和基因双重作用的结果。而
AFLP分子标记是从分子水平上分析不同品种之间DNA
序列的差异, 不受环境影响, 其聚类结果体现的是不同桂
花品种DNA 序列的相似性。所以, 两种聚类结果会出
现一定的差异。另外, 所选的形态性状尤其是受环境影
响较小的性状较少也是出现差异的一个原因。
晚银桂异名小叶银桂(臧德奎和向其柏, 2004), 但是,
本研究结果显示桂林地区的小叶银桂和华东地区的晚银
桂有着较大的差异, 因此, 我们认为应该区别对待这2个
品种。圆叶金桂属于金桂品种群, 应与桂花品种之间有
较近的亲缘关系, 但是在AFLP分子标记的聚类图上, 圆
叶金桂与其它桂花品种之间的遗传距离为 0.44, 已经达
到了木犀属某些种之间的遗传距离(韩远记等, 2008), 其
具体原因我们将做进一步研究。
参考文献
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Study on the Genetic Diversity of Osmanthus fragrans Cultivars
Yuanji Han, Meifang Dong, Wangjun Yuan, Fude Shang*
In sti tute of Ag ricultura l Bi ote chn olo gy, Co lleg e o f L ife Sciences, He nan Un ive rsit y, Kai fen g 4 7500 1, Chi na
Abstr act We used morphological f eatures and amplif ied fragment-length polymorphism (A FLP) markers to analyze the genetic
diversity of 45 Osmanthus fragrans cultivars and found high levels of genetic diversity among the cult ivars. Of the AFLP bands
detec ted, 57.46% are polymorphic. We class if ied the cultivars biometr ically according to their major morphological features and
performed c lus ter analys is of the AFLP data by the unw eighted pair-group method using arithmetic averages . The results of both
approaches show ed that O. fragrans cultivars of the Guilin region form a dis tinc t subgroup, and f low er color is a viable c lass if ica-
tion criterion. We discuss systems for O. fragrans cultivar classif ication.
Ke y w ords a mpli fie d f rag ment -le ngth po lym orp hism, g ene tic di versity, mo rph olog ica l characte rs, Osman thu s fragrans cul tiva rs
Ha n YJ , Dong MF, Yuan WJ, Sha ng FD (2 008). Study o n th e ge neti c diversi ty o f Osman thu s fragrans cult iva rs. Chi n Bu ll Bot 25 , 5 59-
56 4.
* Author for correspondence. E-mail: fudeshang@henu.edu.cn (责任编辑: 孙冬花)