全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (2): 147-153, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-07-18; 接受日期: 2006-12-25
基金项目: 国家自然科学基金(No.30430580)和青岛市科技发展计划项目(No.05-1-JC-96)
* 通讯作者。E-mail: boguangzhao@yahoo.com; lrg@qdu.edu.cn
.研究论文.
松材线虫携带一株荧光假单胞菌分泌毒素的初步研究
尹永华 1, 郭道森 2, 赵博光 3*, 杜希华 1, 赵遵田 1, 李荣贵 2*
1山东师范大学生命科学学院, 济南 250014; 2青岛大学生物系, 青岛 266071;
3南京林业大学森林环境与资源学院, 南京 210037
摘要 本文研究了离体情况下松材线虫携带的致病菌一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens GcM5-1A)在LB、NB
和PD三种培养基中的毒性, 以及产生的毒素对黑松(Pinus thunbergii)切根苗和悬浮细胞的效应。结果显示, 菌体在LB和NB
培养液的毒性较高, 其中 LB培养液的毒性最高, 且培养液的pH值为7时比pH值为5时毒性高, 而该菌在PD培养基中几乎不产
毒。细菌培养液经硫酸铵分级沉淀, 得到了主要含有50 kDa蛋白的蛋白组分, 该蛋白组分对黑松悬浮细胞和切根苗均有较高
的毒性, 并能改变黑松悬浮细胞细胞膜的透性, 导致胞内可溶性糖和游离氨基酸外渗。
关键词 松材线虫, 一株假单胞菌, 毒素
尹永华, 郭道森, 赵博光, 杜希华, 赵遵田, 李荣贵 (2007). 松材线虫携带一株荧光假单胞菌分泌毒素的初步研究. 植物学通报 24 ,
147-153.
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)病是松树的
一种毁灭性病害, 主要由松墨天牛(Mon ocha mus
alternatus)传播, 可危害多种松属(Pinus)植物。由于该
病的发生和发展涉及寄主(松树)、媒介昆虫(主要是松
褐天牛(Monochamus alternatus))、松材线虫以及微生
物(细菌和真菌)等多种生物因素, 而这些因素之间关系复
杂, 从而给致病机理的研究增加了难度。
松材线虫病的发病机理一直以来是林业领域研究的
热点。松材线虫病是由松材线虫单一病原造成的单病
原学说在森林病理学领域一直占主导地位(Mamiya,
1983; Myers, 1988; 杨宝君, 2002)。但是很多现象用
松材线虫单一病原说很难或不能解释, 已有的研究证实
松材线虫虫体经表面灭菌后即丧失了其致病性
(Kawazu, 1997)。早在20世纪 80年代初, Oku(1980)
就观察到在患病组织的树脂道内和薄壁组织中有大量细
菌存在。之后, 有关线虫携带细菌并且由细菌产生毒性
物质导致松树致病的机理得到越来越多的证实(Kawazu,
1996,1997,1998,1999)。郭道森等(2002)证实感病黑
松组织中分离到的每条线虫平均携带 290个细菌。赵
博光等(2003)通过扫描电镜直接观察到松材线虫虫体携
带大量细菌。Zhao等(2003)对呈现松材线虫病典型症
状的黑松和马尾松(Pinus massoniana)的病样, 采用病
木组织分离法, 分离获得松材线虫所携带的细菌菌株24
株, 利用传统的细菌鉴定方法和自动快速鉴定系统相结
合 , 对 2 4 个菌株进行了鉴定 , 其中假单胞菌属
(Pseudomonas )有11株, 泛菌属(Pantoea )有6株, 还
有不解糖消化链球菌 ( P e p t o s t r e p t o c o c c u s
asaccharo ly t icus )、河生肠杆菌(Enterobac ter
amnigenus)、乡间步丘菌(Buttiauxella agrestis)和粘
质沙雷菌(Serratia marcescens)。利用黑松无菌切根
苗致萎生测方法测定的结果表明: 这24种细菌中的17
种有不同程度的致萎能力, 所有11种假单胞菌属的菌株
对无菌黑松切根苗均有致萎活性(Zhao, 2003)。综合以
上研究, 赵博光等(2003)提出了松材线虫病是松材线虫和
其携带细菌复合侵染性病害, 并且可通过抗生素控制致
病细菌的方法控制该病。
148 植物学通报 24(2) 2007
Oku(1979)根据接种松材线虫后松树迅速枯萎的特
点,首先提出发病过程可能涉及毒素。Mamiya(1980)也
指出, 染病松树薄壁组织和泌脂细胞在松材线虫侵害之
前就已经发生变性和死亡, 说明毒素参与了病理学变
化。目前已经从感病松树中分离得到了以下几种毒素:
苯甲酸、邻苯二酚、2-氢松柏醇、2-羟基香芹鞣酮、
10-羟基马鞭草烯酮、苯乙酸和 2-甲氧基肉桂酸(Oku,
1979, 1988, 1990)。
Oku(1979)在研究松材线虫病毒素时, 曾怀疑致蔫毒
素是由一种与松材线虫有关的假单胞菌(Pseudomonas
sp.)产生的。Kusunoki(1987)用电子显微镜观察松材线
虫病的感病组织时, 发现受到破坏的树脂道内和薄壁组
织细胞间存在大量细菌, 细胞壁酶解类型与细菌引起的
病害相似。Kawazu(1990)推测松材线虫的共生菌可能
是松材线虫病的致病原因。此后, 他从松材线虫上分离
得到了 3 种致病细菌 : 枯草芽孢杆菌 ( B a c i l l u s
subtilis)、蜡状芽孢杆菌(B. cereus)和巨大芽孢杆菌
(B. megaterium), 并且分离鉴定出这3种菌所产生的毒
性物质为苯乙酸。
本文对松材线虫携带的一株荧光假单胞菌所产生的
毒素进行研究, 并对细菌的生长及产毒条件进行了初步
探讨, 以此来探讨松材线虫携带的细菌在松材线虫病发
生和发展中的作用, 为进一步研究松材线虫病的致病机
理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌种来源
南京林业大学提供的从松材线虫(Bursaphelenchus
x y l o p h i l u s )虫体上分离得到的一株荧光假单胞菌
(Pseudomonas fluorescens GcM5-1A)。
1.2 黑松愈伤组织培养
组织培养参照Zhao(2003)的方法进行。挑选饱满的黑
松种子, 除去硬皮, 浸泡于无菌水中 1-2天, 换水 1-2
次。将泡好的种子放在 50 mL的烧杯中, 用 75%的乙
醇表面消毒45秒, 然后用0.1%的升汞溶液处理4分钟,
无菌水冲洗 5次。在超净工作台上无菌操作剥除胚乳,
取出成熟的胚, 接入愈伤组织诱导培养基上(1/2MS培养
基, 附加 0.5 mg.L-1 NAA、0.1 mg.L-1 IBA、1.0 mg.
L-1 GA3、1.0 mg.L-1 2,4-D、100 mg.L-1 LH和 30
mg.L-1蔗糖, pH值调至5.86), 置于27 °C的温箱中黑
暗培养。培养2周左右, 选取未褐变的愈伤组织进行继
代培养。
1.3 黑松幼苗培养
将黑松种子用蒸馏水冲洗5次后, 放入0.1%的升汞溶液
中浸泡10-15分钟。再用无菌水冲洗5次, 然后平摆于
铺有3层无菌滤纸的大培养皿中并用无菌水湿润, 盖上
盖, 放在 27 °C的温箱中催芽。每隔 3-4天加 1次水,
每周换 1次无菌滤纸。待胚根长到 3-4 cm长时, 移到
灭菌珍珠岩中, 先置于 27 °C的光照培养箱培养, 后置
于室温培养, 根长至 7-8 cm时取出备用。
1.4 细菌培养
取斜面培养的P. fluorescens GcM5-1A两环接种于30
mL LB液体培养基中, 30 °C培养 24小时, 各取 30 µL
分别接种于 30 mL的 LB、NB和 PD培养基中, 同样
的条件下继续培养 24小时。
1.5 细菌培养液对黑松悬浮细胞毒性的测定
细菌培养液经17172×g离心20分钟, 取上清。 分别取
400 µL的黑松愈伤组织单细胞悬浮液加入具塞无菌试管
中, 加入上述上清液 100 µL。分别以加入 100 µL未接
种细菌的 LB、NB和PD培养基的细胞悬液为对照, 27
°C恒温培养。定期取样, 细胞用双醋酸盐荧光素进行
染色后, 荧光显微镜下统计细胞死亡率, 具体方法参照赵
博光等(2005)建立的荧光染色显微生测法。每次统计
100 个细胞。
1.6 细菌培养液对黑松切根苗毒性的测定
无菌条件下, 选择茎长的苗, 将黑松幼苗用刀片在其根茎
相接处切开。 取盖上有孔的(使黑松幼苗刚好插入)无菌
Eppendorf管, 加入150 µL的待测溶液, 放入光照培养
149尹永华等: 松材线虫携带一株荧光假单胞菌分泌毒素的初步研究
箱内 28 °C进行光照培养, 每24小时观察1次, 记录萎
蔫情况。每组测定 5 0 株幼苗。
1.7 细菌培养液中毒蛋白的毒性分析
细菌培养液 4 °C、15 093×g离心 20分钟, 取上清进
行硫酸铵分级沉淀。分别取 20%、20%-60%饱和度
的沉淀, 用蒸馏水溶解。对大量蒸馏水透析过夜后, 用
Amicon Ultra超滤浓缩管(5 kDa)浓缩。浓缩液用无菌
水稀释到一定浓度后用于对黑松悬浮细胞和切根苗的毒
性分析。
1.8 蛋白质浓度的测定
用考玛斯亮蓝法测定蛋白质浓度, 蒽酮比色法测定可溶
性糖, 茚三酮比色法测定游离氨基酸的浓度。详细步骤
参照张志良(1990)的方法。
2 结果分析
2.1 不同培养基的产毒情况
松材线虫携带的一株假单胞菌在3种培养基中均能良好
的生长。实验结果表明: 3种培养基对细菌的产毒情况
明显不同, 其中在PD培养基中供试菌的培养液无论对
黑松悬浮细胞还是对黑松切根苗都几乎没有毒性; 而LB
和NB培养基本身对这 2种实验材料均有一定毒性, 但
细菌培养液的毒性明显高于对照。处理 2天后, LB培
养液中悬浮细胞的死亡率较对照高2.09倍, 黑松切根
苗的死亡率较对照高1.03倍; NB培养液中悬浮细胞的
死亡率较对照高0.33倍, 黑松切根苗的死亡率较对照
高 0.67倍。
2.2 培养基pH值对细菌产毒条件的影响
以LB作为细菌生长的培养基, 实验结果表明: 培养基pH
值对细菌生长影响不大, 却对产毒情况有明显的影响,
pH7.0的培养液的毒性明显高于 pH5.0的培养液。用
pH7.0的培养液处理 3天后, 悬浮细胞的死亡率已达
88%, 而用pH5.0的培养液处理相同时间的悬浮细胞其
死亡率仅为 44%。用切根苗为材料进行的实验也得到
了相似的结果, 用 pH7.0的培养液处理 3天后, 黑松切
根苗的萎蔫率已达74%, 而用pH5.0的培养液处理3天
后, 黑松切根苗的萎蔫率为 34%。
2.3 细菌培养液中蛋白组分的初步纯化
为了研究培养液中毒素的化学本质, 假单胞菌的LB培养
图 1 不同培养基培养荧光假单胞菌的培养液对黑松悬浮细胞的
毒性
Figure 1 Toxicities of different media cultures of Pseudomo-
nas fluorescens GcM5-1A to Japanese black pine suspension
cells
图 2 不同培养基培养荧光假单胞菌的培养液对黑松幼苗的毒性
Figure 2 Toxicities of different media cultures of Pseudomo-
nas fluorescens GcM5-1A to Japanese black pine seedlings
150 植物学通报 24(2) 2007
液分别经饱和硫酸铵、20%饱和度的硫酸铵和 20%-
60%饱和度的硫酸铵沉淀, 沉淀溶解后对蒸馏水透析脱
盐, 然后进行SDS-PAGE分析, 并分别测定其对黑松悬
浮细胞和切根苗的毒性。结果表明: 3种处理方式得到
的样品均对实验材料产生很强的毒性, 说明该假单胞菌
分泌的毒素中有部分是蛋白质。SDS-PAGE分析结果
显示, 细菌分泌的胞外蛋白主要是分子量为 50 kDa蛋
白,20%饱和度的硫酸铵可将部分该蛋白沉淀, 所得样品
中其它杂蛋白量已非常少。活性分析结果显示: 初步纯
化的该蛋白对黑松悬浮细胞和切根苗均具毒性(图6, 图
7), 推测该蛋白可能是细菌分泌的一种毒素。此外, 由
图8可以看出, 60%饱和度的硫酸铵沉淀出的蛋白毒性
图 3 不同 pH值的 LB培养基的细菌培养液对黑松悬浮细胞的毒
性
Figure 3 Effect of pH values of LB medium on the toxicities of
cultures to Japanese black pine suspension cells
图 4 不同 pH值的 LB培养基的细菌培养液对黑松幼苗的毒性
Figure 4 Effect of pH values of LB medium on the toxicities of
cultures to Japanese black pine seedlings
图 5 荧光假单胞菌培养液及初步纯化蛋白的 SDS-PAGE分析
1: 20%饱和度硫酸铵沉淀的蛋白; 2: 60%饱和度硫酸铵沉淀的蛋
白; 3: 荧光假单胞菌培养液; M: 蛋白标准
Figure 5 SDS-PAGE analysis of total proteins in the culture
of Pseudomonas fluorescens GcM5-1A and primarily purified
proteins
1: Proteins precipitated by ammonium sulfate of 20% saturation;
2: Proteins precipitated by ammonium sulfate of 60% saturation;
3: Culture of Pseudomonas fluorescens GcM5-1A; M: Protein
marker
图 6 初步纯化的 50 kDa蛋白对黑松悬浮细胞的毒性
Figure 6 Toxicity of the primarily purified 50 kDa proteins to
Japanese black pine suspension cells
151尹永华等: 松材线虫携带一株荧光假单胞菌分泌毒素的初步研究
比 20%饱和度的硫酸铵沉淀出的蛋白毒性稍强。
2.4 初步纯化的50 kDa蛋白对悬浮细胞膜通透
性的影响
2.4.1 毒蛋白对悬浮细胞可溶性糖外渗的影响
悬浮细胞经毒蛋白处理后, 导致胞内可溶性糖的大量外
渗, 胞外可溶性糖的含量随着处理时间的延长而逐渐增
高, 处理 3天后较对照组的胞外可溶性糖含量提高了
2.55倍。这说明细胞膜的结构经毒蛋白处理后发生了
改变, 导致细胞膜通透性增加, 胞内可溶性糖外渗(图 9)。
2.4.2 毒蛋白对悬浮细胞游离氨基酸外渗的影响
毒蛋白处理黑松悬浮细胞不但可以导致胞内可溶性糖的
外渗, 而且也导致胞内游离氨基酸的大量外渗。毒蛋白
处理3天后, 胞外溶液游离氨基酸的含量较对照高2.33
倍。这说明毒蛋白改变了细胞膜的通透性, 导致游离氨
基酸大量外渗(图 10)。
从图9和图10可以看出, 用毒蛋白处理愈伤组织后,
处理液内可溶性糖和游离氨基酸的含量都大大高于对
照。这说明用毒蛋白处理愈伤组织后引起了细胞膜结
图 7 初步纯化的 50 kDa蛋白对黑松幼苗的毒性
Figure 7 Toxicity of the primarily purified 50 kDa proteins to
Japanese black pine seedlings
图 8 初步纯化的 50 kDa蛋白对黑松悬浮细胞的毒性
Figure 8 Toxicities of the primarily purified 50 kDa proteins
precipitated by ammonium sulfate of different saturations to
Japanese black pine suspension cells
图 9 初步纯化的 50 kDa蛋白对黑松细胞可溶性糖渗漏的影响
Figure 9 Effect of the primarily purified 50 kDa proteins on
the leakage of soluble carbohydrates of suspension cells
图 10 初步纯化的 50 kDa蛋白对黑松细胞游离氨基酸渗漏的影
响
Figure 10 Effect of the primarily purified 50 kDa proteins on
the leakage of free amino acids of suspension cells of Japa-
nese black pines
152 植物学通报 24(2) 2007
构的变化, 导致其通透性增加。
3 讨论
本文研究了松材线虫携带的一株假单胞菌在LB、NB和
PD三种培养基中的产毒情况, 结果表明: 该菌在 LB和
NB培养基中培养时培养液的毒性最强, 而在PD培养基
中生长良好, 培养液几乎没有毒性。比较这3种培养基
的组成可以发现, LB和NB培养基中都含有动物蛋白的
水解成分, 而PD培养基中仅含植物蛋白成分。考虑到
该菌最初分离自松材线虫的体表, 是否在黑松体内松材
线虫促进细菌毒素的分泌, 尚需更多的实验证实。我们
在实验中还发现, LB培养基的pH值明显影响细菌的毒
素分泌, 中性培养基的细菌培养液的毒性明显高于酸性
培养液, 由于生长良好的松树体内为酸性环境, 因此推测
细菌生长在线虫的体表也可促进毒素的分泌。
Oku (1979)根据接种线虫后松树迅速枯萎这一特点,
首先提出发病过程可能涉及毒素。从感病的 3年生和
15-25年生黑松、赤松(P. densiflora)、多脂松(P.
resinosa)树上提取出4种健康松树所没有的有毒物质。
关于毒素来源, 有人认为受害松树内产生的致萎毒素是
由于线虫的侵染而使寄主产生异常代谢的产物 (Oku,
1990)。另有观点认为, 受害松树体内的有毒物质与线
虫携带的细菌有关(Kawazu, 1996, 1998)。Kawazu等
(1999)认为松材线虫本身并不致病,松材线虫病的真正病
原是伴随线虫侵入的能产生苯乙酸的细菌, 而真正的病
原毒素是苯乙酸(Kawazu, 1990,1997, 1999)。
本文研究发现, 松材线虫携带的一株假单胞菌在体
外培养时能向培养基中分泌毒性蛋白, 初步分离纯化得
到了一种分子量为50 kDa的蛋白组分。该组分能改变
细胞膜的通透性, 导致黑松悬浮细胞内的可溶性糖和游
离氨基酸的大量外渗。切根苗的生测结果表明, 该蛋白
组分具有明显的致萎活性。由于黑松感染松材线虫出
现的症状是真叶萎蔫, 因此, 若体内松材线虫携带的假单
胞菌也能分泌蛋白类毒素, 而该蛋白又可随着水分运输
传递到真叶, 从而导致真叶细胞的细胞膜通透性改变, 水
分外渗造成萎蔫。体内情况是否如此, 需要进一步通过
Western blot等方法来确定这些蛋白类毒素与细胞萎蔫
的关系, 研究结果可为深入了解松材线虫病的发病机理
以及抗松材线虫的育种奠定基础(袁翠萍等, 2006)。
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(责任编辑: 白羽红)
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Yonghua Yin1, Daosen Guo 2, Boguang Zhao 3*, Xihua Du 1, Zuntian Zhao1, Ronggui Li2*
1College of Life Sciences,Shandong Normal University, Jinan 250014, China;
2Depertment of Biology, QingDao University, Qingdao 266071, China;
3College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
Abstract Pseudomonas fluorescens GcM5-1A carried by pine wood nematodes was cultured in LB, NB and PD medium. The
cultures free of bacteria were used to analyze their toxicity to suspension cells and shoot seedlings of Pinus thunbergii. The
cultures of LB and NB were toxic, with LB culture showing the highest toxicity, whereas almost no toxicity was detected for PD
culture. pH values of the LB medium affected the toxicity of the final culture: the culture with an initial pH 7.0 was more toxic than
one with pH 5.0. The proteins in the LB culture were precipitated by ammonium sulfate, and toxicity analysis showed the proteins
toxic to both suspension cells and seedlings. As well, a component mainly containing a protein of 50 kDa, which also showed
relatively strong toxicity, was partially purified on precipitation with ammonium sulfate of 20% saturation; treatment with the
component could lead to leakage of soluble carbohydrates and free amino acids.
Key words pine wood nematode disease, Pseudomonas fluorescens GcM5-1A, toxins
Yin YH, Guo DS, Zhao BG, Du XH, Zhao ZT, Li RG (2007). Primary study on the toxins secreted by Pseudomonas fluorescens GcM5-1A
carried by pine wood nematodes. Chin Bull Bot 24, 147-153.
* Author for correspondence. E-mail: boguangzhao@yahoo.com; lrg@qdu.edu.cn
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生物医学编辑—— Laura Heraty简介
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所及医院的许多期刊编辑部做兼职英文编辑。许多作者的英文文章经她编辑修改后，首次被国际顶尖刊物录用。她擅长
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