全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (6): 682-693, w w w .chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.06.005
收稿日期 : 2008-12-05; 接受日期 : 2009-03-20
基金项目 : 国家自然科学基金 (No.30470114)
* 通讯作者。E-mail: hsdshenjiaheng@yahoo.com.cn
.研究报告.
甜菜无融合生殖单体附加系 M14成熟胚囊的超微结构特征
尚娅佳 1 , 申家恒1*, 郭德栋 2 , 丁常宏1, 李伟 1 , 陆俊萍 1
1哈尔滨师范大学生命与环境科学学院生物系 , 哈尔滨 150025; 2黑龙江大学生命科学学院生物工程系 , 哈尔滨 150080
摘要 以甜菜无融合生殖单体附加系M14(Beta vulgaris, 2n=18+1)为实验材料, 利用电子显微镜技术对成熟胚囊及其超微
结构进行研究。结果表明: M14成熟胚囊包括1个卵细胞、2个退化的助细胞、1个具有次生核的中央细胞和3-6个反足细胞。
其卵细胞具有3种不同的形态: (1)极性正常的卵细胞, 细胞核位于合点端, 细胞质含有大量核糖体、线粒体、内质网等细胞器;
(2)细胞核位于细胞中央; (3)细胞核位于珠孔端, 且后2种形态细胞器的种类与数量少。大多数胚囊中的2个助细胞在开花前已
退化。中央细胞的次生核位于反足细胞附近; 未经受精自发分裂前的卵细胞与中央细胞的细胞核大、核仁明显, 细胞器的种
类与数量多, 呈现旺盛代谢活动特征, 成为二倍体孢子无融合生殖过程中, 卵细胞与次生核自发分裂的细胞学标志。
关键词 自发分裂 , 甜菜 , 成熟胚囊 , 单体附加系, 超微结构
尚娅佳 , 申家恒 , 郭德栋 , 丁常宏 , 李伟 , 陆俊萍 (2009). 甜菜无融合生殖单体附加系 M14成熟胚囊的超微结构特征. 植物学
报 44, 682-693.
无融合生殖是指被子植物不经减数分裂和受精
作用, 直接进行胚的发育, 以形成种子的生殖方式
(Bicknell and Koltunow, 2004)。无融合生殖的研究
对农业生产和育种工作具有重要而深远的意义。植
物界中, 无融合生殖的现象分布很广泛, 但除了苹果
(Malus pumila)和柑橘属(Citrus )植物之外, 在重要的
经济植物中无融合生殖现象并不常见 (孙敬三等 ,
1996; 母锡金等, 2001)。要实现以无融合生殖固定重
要作物杂种优势的目的, 必须将野生种的无融合生殖
特性转育到栽培作物中。转育的途径主要是将栽培
种与具有无融合生殖特性的近缘种进行杂交、回交。
我们利用具有无融合生殖特性的野生种白花甜菜
(Beta corollif lora)与栽培甜菜(Beta vulgaris)杂交、回
交后, 选育出带有1条白花甜菜染色体的甜菜单体附
加系 M14新种质(郭德栋等, 1991, 2000, 2001)。经
形态学、细胞学以及胚胎学鉴定 , 发现甜菜单体附加
系 M14为兼性无融合生殖体 , 存在蝶须型与韭型的
二倍体雌配子体以及单倍体的蓼型雌配子体(申业等,
2006a, 2006b)。通过光学显微镜观察表明, M14的卵
细胞与中央细胞在未受精条件下自发分裂形成胚与
胚乳(申业等, 2006a)。本研究利用电子显微镜技术对
甜菜无融合生殖单体附加系 M14的成熟胚囊以及自
发分裂的卵细胞与次生核的超微结构特征进行研究 ,
为最终阐明甜菜单体附加系 M14无融合生殖的细胞
胚胎学机制提供新资料, 并为进一步利用甜菜无融合
生殖材料进行深入的遗传学和分子生物学研究提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
研究材料为甜菜无融合生殖单体附加系 M14(Be ta
vulgaris L. VV+1C, 2n=18+1)。以栽培甜菜(Beta vul-
garis L.)为母本, 白花甜菜(Beta corollif lora Zoss.)为
父本进行杂交 , 获得真实杂种 V C 88- 1 ( V V C C,
2n=4x=36)。利用栽培甜菜回交, 产生带有白花甜菜
染色体的单体附加系 , 经形态学和细胞学鉴定 , 获得
9种类型的单体附加系系列 , 其中M14为带有白花甜
683尚娅佳等: 甜菜无融合生殖单体附加系M14成熟胚囊的超微结构特征
菜第 9号染色体的栽培型(Ⅸ)单体附加系, 从而将携
带无融合生殖基因的一条白花甜菜染色体转移到栽
培甜菜, 使原来只进行有性生殖的栽培甜菜可以高效
表达无融合生殖特性(郭德栋等, 1991, 2000, 2001)。
将上述材料种植于黑龙江大学植物园内 , 于 2004-
2006年每年6月中旬至7月下旬, 自不同大小的花蕾
以及开花后的子房里剥取不同发育期的胚珠进行研
究。
1.2 方法
花蕾及小花经二钾砷酸盐缓冲液(0.1 mol.L-1, pH
7.2)配制的 3% 的戊二醛固定液前固定至少 2小时。
二钾砷酸盐缓冲液冲洗 3次, 每次 30分钟, 经 1%锇
酸后固定 3小时, 二钾砷酸盐缓冲液冲洗 , 梯度乙醇
(30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%)脱水, 每
级 30分钟, 环氧树脂渗透 21小时, spurr包埋剂包埋,
70°C温箱中聚合 9小时。从固定到包埋之前的步骤
均在振荡器上进行 , 并使吸湿机处于开启状态。然后
利用 Leica Ult racut R型超薄切片机切片 , 厚度为
70-80 nm。切片经醋酸双氧铀 -柠檬酸铅双染色后 ,
用 JEM-1230型透射电子显微镜观察并拍照。
2 结果与讨论
2.1 结果与分析
光镜水平研究表明, 甜菜无融合生殖单体附加系M14
存在 3种类型的胚囊 , 即二倍体孢子生殖的蝶须型、
韭型与有性生殖的蓼型, 其中以蝶须型胚囊占绝对优
势(郭德栋等, 2001; 申业等, 2006b)。电镜水平研究
支持上述结果(另文发表)。本研究共统计了 284个开
花后的胚囊的超微结构特征, 未观察到任何有性生殖
的图像, 表明M14主要进行二倍体孢子无融合生殖。
2.1.1 成熟胚囊的超微结构特征
2.1.1.1 卵细胞
在开花前胚囊已发育成熟, 卵细胞表现出一定的极
性, 多数胚囊里的 2个助细胞退化 , 上、下极核融合
为次生核, 形成七细胞七核的成熟胚囊。开花不久,
成熟胚囊内卵细胞高度极性化, 形态发生一定的分
化, 大致可以区分为以下 3种类型。
第 1种类型的卵细胞呈洋梨形, 合点端最宽(图
1A-C), 珠孔端被一个大液泡占据, 细胞核和大部分
细胞质位于合点端。卵细胞仅在距珠孔端 1/3范围内
存在细胞壁, 其余部位仅被质膜包围 , 细胞壁在珠孔
端最厚, 未见壁内突或胞间连丝。卵细胞合点区域的
质膜与中央细胞的质膜之间, 以及卵细胞与助细胞质
膜之间被狭窄的空隙隔开, 这些空隙中常含有电子浓
密物质, 这些物质是退化助细胞质的一部分。卵细胞
核呈球形, 核膜附近存在一些染色质, 核仁较大, 有
许多大小不等的核仁泡。细胞质中含有大量的核糖
体、线粒体和丰富的内质网。内质网大部分区域与
核糖体相连, 属于粗面内质网 , 分布在细胞核周围的
内质网某些区域与核外膜相连; 线粒体成群分布在细
胞核周围的细胞质中, 有内嵴, 其余部位被基质填充;
质体相对较少, 形状不规则, 有淀粉粒或脂滴的存在;
偶见高尔基体 ; 细胞质中也有脂滴的存在。
第 2种类型的卵细胞合点端被一个大液泡占据 ,
细胞核及大部分细胞质位于细胞的珠孔端(图1D-I)。
细胞壁的分布与第1种类型的卵细胞相似 , 仅在靠珠
孔的极少部分区域有细胞壁的存在, 没有壁内突, 也
未见胞间连丝。其它区域的质膜与中央细胞的质膜
相互靠近, 一些部位存在狭窄的空隙并被退化助细胞
的细胞质填充。卵细胞核为椭球形, 核仁上的核仁泡
很少。细胞质中的细胞器很少 , 核糖体的密度较高;
粗面内质网含量很低 , 呈管状或分散的囊状; 质体分
布在细胞核周围的细胞质中, 含有明显的淀粉粒 ; 线
粒体较少, 其形态与第 1种类型卵细胞的相似 ; 有高
尔基体的存在 ; 未见脂滴。
在第3种类型中, 卵细胞的细胞核及大部分细胞
质位于细胞的中央 , 珠孔端和合点端各有 1个大液
泡。卵细胞的中部最宽, 两端稍尖(图 1J-L)。细胞壁
的分布与前2种类型的卵细胞相同 , 未见壁内突及胞
间连丝。卵细胞核周围细胞器的分布及特征与第2种
类型卵细胞的极其相似。
684 植物学报 44(6) 2009
685尚娅佳等: 甜菜无融合生殖单体附加系M14成熟胚囊的超微结构特征
2.1.1.2 助细胞
胚囊细胞化过程中或细胞化后不久就有助细胞退化
的现象。开花初期, 大多数胚囊里的 2个助细胞都已
经退化, 细胞质呈高电子密度, 细胞器难以识别 , 丝
状器依然存在(图 2A, B)。退化助细胞的细胞质流到
中央细胞与卵细胞质膜之间。少数胚囊中只有一个
助细胞退化, 另一个助细胞宿存至次生核自发分裂前
退化(图 2C, D)。宿存助细胞体积比卵细胞小 , 仅在
靠珠孔约1/2处范围内存在细胞壁 , 其余部位仅由质
膜包围, 与卵细胞及中央细胞的质膜相互靠近, 退化
的助细胞质流入质膜之间的缝隙。助细胞具有较强
的极性, 珠孔端有明显的丝状器 , 一个大液泡或几个
小液泡分布在合点端 , 大部分细胞质位于珠孔端 , 细
胞核比卵细胞核稍小 , 位于细胞的中央附近, 有一个
单独的核仁, 未见核仁泡, 细胞质中含有大量线粒体
和高尔基体及相对丰富的核糖体和内质网。线粒体
成群地分布在细胞核周围的细胞质中, 尤其在丝状器
附近分布较多 , 体积比卵细胞中的小但内嵴十分明
显; 质体相对较少 , 不含淀粉粒; 高尔基体膜囊多 , 并
活跃地分泌小泡 ; 有脂滴的存在。
2.1.1.3 中央细胞
中央细胞绝大部分区域被大液泡所占据, 细胞质被挤
到中央细胞的边缘形成一薄层, 其余大量的细胞质分
图 1 甜菜无融合生殖单体附加系 M14成熟胚囊中 3种类型卵细胞的超微结构
(A)极性正常的卵细胞 , 细胞核和大部分细胞质位于细胞的合点端, 珠孔端被大液泡占据, 可见退化助细胞的部分细胞质及中
央细胞的壁内突; 右下图为卵细胞的合点端与中央细胞相邻区域的放大; 中下图示二质膜之间退化的助细胞质; (B)极性正常
的卵细胞 ; (C)(B)中卵细胞的细胞核附近部分细胞质的放大 ; (D)极性相反的卵细胞 , 细胞核和大部分细胞质位于细胞的珠孔端 ;
(E)(D)中卵细胞部分细胞核及其周围细胞质的放大 ; (F)极性相反的卵细胞, 细胞核和大部分细胞质位于细胞的珠孔端 , 合点端
被大液泡占据 , 可见退化助细胞的部分细胞质以及另一个助细胞的丝状器 ; (G)(F)中卵细胞核附近部分细胞质的放大 ; (H)(D)中
卵细胞的合点端与中央细胞相邻区域的放大 , 示二质膜之间退化的助细胞质 ; (I)(D)中细胞核周围部分细胞质的放大 ; (J)(K)中
退化助细胞质的部分放大; (K)第 3种类型的卵细胞, 细胞核位于卵细胞的中央, 大液泡位于两端, 可见 2个退化的助细胞及其
丝状器 ; (L)(K)中卵细胞核附近部分细胞质的放大
所有图示胚囊的珠孔端向上, 合点端向下。CC: 中央细胞 ; D: 高尔基体 ; DSy: 退化助细胞 ; EC: 卵细胞 ; FA : 丝状器 ; L: 脂滴 ; M: 线
粒体 ; N: 细胞核 ; P: 质体 ; S: 淀粉粒 ; V: 液泡。 (A), (C) , (E), (G), (H), (I) , (J), (L) Bar=500 nm; (B), (D) , (F), (K) Bar=5 mm
Figur e 1 The ultras truc ture of three types of egg cells in mature embryo sacs of monosomic addition line M14 of Beta corollifl ora
in sugar beet
(A) Egg cell w ith regular polarity. The nucleus and most of the cy toplasm w ere localized at the chalazal end, a large vacuole w as
at the mic ropylar end, and cytoplasm of degenerated synergid and protrus ion of the central cell w all w ere show n as w ell; A
magnif ication of the chalazalmost of the egg cell and the central cell w as show n at the r ight sec tion; The cy toplasm of degenerated
synergid in betw een the plasma membranes w as show n at the middle section; (B) Egg cell w ith regular polarity; (C) Magnif ication
of (B), show ing the cytoplasm adjacent to the nucleus in egg cell; (D) Egg cell w ith reversed polarity. The nuc leus and most of the
cy toplasm w ere at the micropy lar end of the egg cell; (E) Magnif ication of (D), show ing part of the nucleus and cy toplasm of the
egg cell; (F) Egg cell w ith reversed polar ity. The nucleus and most of the cytoplasm w ere at the mic ropylar end of the egg cell, w hile
the chalazal end w as occupied w ith large vacuoles. Cytoplasm of degenerated synergid and f ilif orm apparatus w ere also present
close to the chalazal end; (G) Magnif ication of (F), show ing cytoplasm sur rounding the nucleus; (H) Magnif ication of (D), show ing
the chalazalmost of egg cell and central cell, and the cytoplasm of degenerated synergid in betw een the plasma membranes; ( I)
Magnif ication of (D) , show ing the cy toplasm sur rounding the nucleus; (J) Magnif ication of (K), show ing cy toplasm w ith small
vacuoles and mitochondria in degenerated synergid; (K) Egg cell w ith a nucleus at central and tw o large vacuoles located at
chalazal and micropy lar end, respectively. Furthermore, tw o degenerated synergids and the f iliform apparatus w ere also show n
in the image; (L) Magnif ication of (K), show ing the cytoplasm close to the nucleus of egg cell.
Figures w ere arranged w ith the mic ropy lar end tow ards the upside. CC: Central cell; D: Dictyosomes; DSy: Degenerated synergid;
EC: Egg cell; FA: Filif orm apparatus ; L: Lipid droplet; M: Mitochondr ia; N: Nucleus; P: Plastids; S: Starch grain; V: Vacuole.
Bar=500 nm in (A), (C) , (E), (G), (H) , ( I), (J) and (L); Bar=5 mm in (B), (D), (F) and (K).
®
686 植物学报 44(6) 2009
布在次生核的周围。次生核位于反足细胞附近 , 呈不
规则椭球形, 长约 15 mm, 核仁球形, 有十分明显的
核仁泡, 染色质大多呈分散状态 , 只有少数集中 (图
3A-D)。与卵器相邻的细胞质以及次生核周围的细
胞质中含有大量的细胞器, 其它部位的细胞质中细胞
器很少。卵器附近的细胞质中含有大量的核糖体; 粗
面内质网发达, 经常沿着质膜的方向平行排列且贴近
质膜; 线粒体随机分布, 有内嵴; 质体很少, 不含淀
粉粒; 高尔基体末端膨大 , 有分泌小泡产生。次生核
周围的细胞质中含有大量的核糖体、质体、高尔基
体以及内质网。质体的体积比较小, 形状多样, 极个
别的含有淀粉粒 ; 粗面内质网丰富 , 具有强烈的扩张
片层, 核膜附近的内质网常与核膜平行排列 ; 高尔基
体常分布在内质网附近 , 极其发达, 片层较多, 末端
膨大并活跃地分泌小泡 ; 小液泡在细胞质中随处可
见, 内部常有一些物质, 分解活动旺盛 ; 线粒体含量
较少, 内嵴不明显, 基质也很少, 多呈电子透明状; 有
脂滴。中央细胞与卵器相邻的区域没有细胞壁。中
央细胞与珠心细胞相连接的细胞壁有壁内突, 尤其靠
珠孔端的壁内突十分明显。中央细胞呈现十分旺盛
的代谢状态。
2.1.1.4 反足细胞
反足细胞的发育进程似乎依个体而异。个别成熟胚
囊的反足细胞已退化或消失, 细胞核变形, 染色质凝
集成块, 核仁消失, 细胞质浓密, 细胞器很难分辨(图
4A)。多数胚囊中存在反足细胞, 但已出现退化的迹
象: 细胞核球形, 直径约 5 mm, 有很多聚集的染色质
图 2 甜菜无融合生殖单体附加系 M14成熟胚囊中助细胞的超微结构
(A) 2个退化的助细胞 , 丝状器明显 , 可见退化的助细胞质 , 一些细胞器仍可辨认 ; (B)(A )中细胞质的部分放大 ; (C)(D)中助细胞
部分细胞质的放大; (D)未退化的助细胞
所有图示胚囊的珠孔端向上, 合点端向下。DSy : 退化助细胞 ; FA: 丝状器 ; L: 脂滴 ; M: 线粒体 ; N: 细胞核 ; P: 质体 ; S: 淀粉粒。(A),
(D) Bar=5 mm; (B), (C) Bar=500 nm
Figur e 2 The ultrastructure of synergids in mature embryo sacs of monosomic addition line M14 of Beta corolli flora in sugar beet
(A) Tw o degenerated synergids w ith dis tinc t f iliform apparatus , some of the organelles could s till be distinguished in the cytoplasm;
(B) Enlarged portion of (A); (C) Enlarged portion of (D); (D) The persis tent synergid
Figures w ere arranged w ith the mic ropylar end tow ards the ups ide. DSy: Degenerated synergid; FA: Filif orm apparatus; L: Lipid
droplet; M: Mitochondria; N: Nucleus ; P: Plas tids; S: Starch grain. Bar=5 mm in (A) and (D); Bar=500 nm in (B) and (C)
687尚娅佳等: 甜菜无融合生殖单体附加系M14成熟胚囊的超微结构特征
连接在核内膜上, 核仁泡极少; 细胞质极其浓密, 内
质网和高尔基体发达 ; 液泡中含有电子浓密物 ; 质体
随机分布在细胞质中, 形状多样, 不含淀粉粒; 线粒
体内嵴不明显, 呈电子透明状(图 4B, C)。有的胚囊
中反足细胞未出现退化迹象, 细胞间的壁上有胞间连
丝存在, 个别的胚囊反足细胞发生增殖(图 4D-F)。
细胞核内有少量凝集的染色质, 核仁上有核仁泡 ; 内
质网非常丰富 , 充满整个细胞质 , 具有强烈的扩张片
层; 线粒体的数量较多 , 形态与前一种反足细胞的相
似; 质体相对较少, 不含淀粉粒; 有高尔基体和脂滴
的存在。
2.1.2 卵细胞、次生核的自发分裂
2.1.2.1 卵细胞自发分裂
卵细胞进入自发分裂前期时, 胚乳游离核的数量达到
4个。卵细胞发生了以下变化 : (1)体积缩小; (2) 细胞
核球形, 一般位于合点端 , 有一个单独的核仁, 其内
含有大小不等的核仁泡, 凝集的染色质分散在核仁的
周围(图 5A, C); (3) 细胞质变得浓密 , 细胞器发生很
大变化: 大液泡逐渐被许多小液泡所取代 , 主要分布
在卵细胞珠孔端 , 合点部位也有少量分布 , 液泡内几
乎没有任何分解物质。卵细胞核周围的细胞质中含
有大量的核糖体、线粒体和质体。线粒体不规则地
成群分布, 内部被基质填充 , 内嵴不明显; 质体多数
呈球状或棒状 , 随机分布在细胞质中, 含有明显的淀
粉粒; 内质网的含量相对下降 ; 高尔基体比较丰富 ,
常分布在液泡附近 , 活跃地分泌并产生小泡 ; 脂滴的
数量较多, 常与液泡、质体或线粒体相互靠近(图
5E-H)。
卵细胞的细胞壁很难观察到, 仅在珠孔端与胚囊
相连的小部分区域有细胞壁的存在。卵细胞与中央
细胞的质膜间形成大小不等的空隙, 空隙内的电子浓
密物逐渐被基质或与高尔基体分泌小泡相似的物质
所取代, 这些物质似乎正在合成细胞壁(图 5B, D, G,
H, I )。卵细胞两侧的空隙大, 但其内没有物质(图
5G)。
随后, 卵细胞自发分裂形成二细胞原胚。刚形成
的二细胞原胚细胞核形状不规则 , 细胞质极其浓密
(图 5 J, K)。细胞壁将顶细胞与基细胞分开 , 顶细胞
合点端的壁不完整 , 有些部位细胞壁缺失。顶细胞的
图 3 甜菜无融合生殖单体附加系 M14成熟胚囊中央细胞的
超微结构
(A)次生核 , 周围分布一层细胞质 ; (B)(A)中部分细胞质的放大 ;
(C)次生核 , 呈椭球形 , 周围分布一薄层细胞质 ; (D)(C)中部分
细胞质的放大
所有图示胚囊的珠孔端向上 , 合点端向下。D: 高尔基体 ; ER:
内质网 ; L: 脂滴; M: 线粒体 ; N: 细胞核 ; P: 质体。 (A) , (C) Bar=2
mm; (B), (D) Bar=200 nm
Figur e 3 The ultras truc ture of central cells in mature embryo
sacs of monosomic addition line M14 of Beta corol li fl ora in
sugar beet
(A) Secondary nucleus of central cell surrounded w ith a layer
of cy toplasm; (B) Enlarged por tion of (A); (C) A n ellipt ical sec-
ondary nuc leus w ith a thin layer of cy toplasm; (D) Enlarged
portion of (C)
Figures w ere arranged w ith the mic ropylar end tow ards the
ups ide. D: Dictyosomes; ER: Endoplasmic reticulum; L: Lipid
droplet; M: Mitochondr ia; N: Nucleus ; P: Plastids . Bar=2 mm in
(A) and (C); Bar=200 nm in (B) and (D)
688 植物学报 44(6) 2009
细胞质中含有大量的小液泡 , 内有明显的分解物质 ;
质体形状不规则, 含有淀粉粒; 线粒体膜不清晰, 内
部充满浓密的基质 ; 有脂滴的存在 ; 内质网或高尔基
体等细胞器较少。
2.1.2.2 次生核自发分裂
次生核自发分裂早于卵细胞。成熟胚囊进一步发育 ,
胚囊体积纵向伸长 , 次生核移到反足细胞的下方 , 不
久就进入自发分裂前期。细胞核的核膜十分清晰 , 形
状不规则, 核仁大而明显 , 含有很多大小不等的核仁
泡, 染色质分散在核仁的周围 , 某些部位染色质聚集
(图 6A)。细胞核周围的细胞质中含有大量的内质网
和高尔基体, 核糖体数量较多。核膜附近的内质网呈
管状且与核膜平行排列 , 绝大部分区域为粗面内质
网。还有一些内质网呈短的管状或囊泡状分布在核
周围的细胞质中, 它们的某些区域有核糖体的附着 ;
图 4 甜菜无融合生殖单体附加系 M14成熟胚囊中反足细胞的超微结构
(A)已经退化的反足细胞 , 细胞核变形 , 染色质凝集 , 细胞器难以辨认 ; (B) 3个出现退化迹象的反足细胞 , 细胞核内染色质凝集 ;
(C)(B)中部分细胞质的放大 ; (D)发生增殖的反足细胞 , 细胞器较丰富 ; (E)未出现退化迹象的反足细胞, 含有丰富的细胞器 ; (F)
(E)中反足细胞部分细胞质放大
所有图示胚囊的珠孔端向上, 合点端向下。A : 反足细胞; CC: 中央细胞 ; D: 高尔基体; L: 脂滴 ; M: 线粒体 ; N: 细胞核; P: 质体 ;
RER: 粗面内质网 ; V: 液泡。 (A), (B) , (D), (E) Bar=2 mm; (C), (F) Bar=200 nm
Figur e 4 The ultrastructure of antipodal cells in mature embryo sacs of monosomic addit ion line M14 of Beta corol lif lora in sugar
beet
(A) Degenerated antipodals, the cells w ere charac tered w ith karyopyknos is, chromatin agglutination, and organelle illegibility; (B)
Three antipodals under degeneration, presenting the chromatin agglutinating in the nuc leus ; (C) Enlarged por tion of (B) ; (D)
Proliferated antipodal cells that r ich in organelles; (E) Antipodals that r ich in organelles; (F) Enlarged portion of (E)
Figures w ere arranged w ith the micropylar end tow ards the upside. A: Antipodal cells ; CC: Central cell; D: Dictyosomes; L: Lipid
droplet; M: Mitochondr ia; N: Nuc leus; P: Plas tids ; RER: Rough endoplasmic reticulum; V: V acuole. Bar=2 mm in (A), (B), (D) and (E);
Bar=200 nm in (C) and (F)
689尚娅佳等: 甜菜无融合生殖单体附加系M14成熟胚囊的超微结构特征
高尔基体丰富且发达 , 依旧分布在内质网的附近 , 膜
囊很多, 末端膨大, 周围有许多分泌小泡, 小泡内含
有电子浓密物质; 线粒体随机分布, 内嵴十分明显, 其
余部位被基质所填充 ; 质体的形状不规则, 淀粉粒少;
脂滴的数量较多 , 随机地分散在细胞质中(图6B, C)。
随后次生核进行有丝分裂 , 形成 2个胚乳游离核 , 它
们的特征与刚形成的次生核极其相似(图 6D-F)。不
久, 这2个胚乳游离核同时进入第 2次有丝分裂前期 ,
其超微结构的特征与自发分裂前的次生核相似。
2.2 讨论
通常被子植物的卵细胞具有相似的超微结构特征: 高
度液泡化, 线粒体内嵴少, 高尔基体和内质网不发达。
一般认为成熟的卵细胞在生理上较不活跃或合成代
谢水平较低, 但也有例外, 如甜菜、大豆(Gl yc ine
max)和天竺葵(Pelagonium hortorum)等(胡适宜和杨
弘远, 2002)。栽培甜菜(Beta vulgaris)卵细胞中含有
大量的核糖体、质体以及相对丰富的内质网 , 代谢活
跃(Bruun, 1987)。M14成熟胚囊中的卵细胞形态发生
一定的分化, 呈现出 3种类型。其中极性正常的卵细
胞中, 核大, 核仁明显, 细胞质中有大量核糖体、线
粒体以及丰富的内质网等, 与栽培甜菜卵细胞及纤毛
狼尾草(Pennisetum c iliare)无孢子生殖的卵细胞相似
(Naumova and Wil lemse, 1995), 即成熟胚囊的卵细
胞处于相当活跃的代谢状态, 推测此类卵细胞具有自
发分裂的能力。而细胞核位于细胞中央或珠孔端的
卵细胞类型, 其超微结构特征与一般的被子植物休眠
的卵细胞相似 , 代谢水平较低 , 推测这 2类卵细胞在
之后的发育过程中逐渐败育。在二倍体孢子无融合
生殖过程中, 关于卵细胞和极核(次生核)自发分裂前
的超微结构未见报道。M14中自发分裂前的卵细胞
超微结构特征可以归纳为 : 卵细胞体积明显缩小; 细
胞核位于合点端, 核大, 核仁明显, 并含有大小不等
的核仁泡; 细胞质浓密, 其内细胞器的种类与数量明
显增多; 卵细胞的合点端缺乏细胞壁; 细胞代谢活性
高。这些特征均可作为二倍体孢子无融合生殖的卵
细胞自发分裂的细胞学标志。
在有性生殖的植物中 , 卵细胞受精后 , 合点端的
细胞壁就逐渐形成。而从成熟胚囊阶段直到自发分
裂形成二细胞原胚 , M14卵细胞的合点端都没有完整
的细胞壁覆盖。这种现象在其它无融合生殖的植物
中也有过报道。例如, 在对橙红色小麦(Triticum spp.)
孤雌生殖的研究中发现 , 开花后17小时, 卵细胞的合
点区域仍无细胞壁覆盖(Naumova and Matzk,1998)。
但在纤毛狼尾草无孢子生殖的研究中发现, 授粉后不
久卵细胞合点端就被无中层的细胞壁覆盖。有人认为
细胞壁的存在形成一道障碍, 从而阻止精子与卵细胞
质膜的接触(Naumova and Willemse, 1995)。对M14和
橙红色小麦的研究并不支持该观点, 因此位于合点端
的细胞壁可能不是防止卵细胞受精的唯一条件。
M14的助细胞在胚囊细胞化过程中或细胞化不
久就发生退化。开花初期, 绝大多数胚囊中的 2个助
细胞都已经退化消失, 这种助细胞提前退化的现象在
其它无融合生殖的植物中也曾有报道。如纤毛狼尾
草的无孢子生殖中未授粉的雌配子体都有助细胞退
化的现象, 在授粉后的雌配子体中未观察到宿存助细
胞, 因此认为助细胞也许并不需要分化, 而且助细胞
的退化可能不受花粉萌发和花粉管生长的影响
(Naumova and Willemse, 1995)。由于卵细胞和退化
助细胞在空间上紧密联系, 所以有学者认为卵细胞的
活化或抑制可能与助细胞的退化活动有关, 助细胞的
退化也许是卵细胞进行孤雌生殖的信号(Tamara and
Jean-Philippe, 2001)。本研究支持上述观点。在有性
生殖种中, 助细胞是花粉管进入胚囊和释放内含物的
地方, 接受花粉管的助细胞在花粉管进入前或进入后
退化。助细胞的退化被认为有积极的作用 , 包括引导
花粉管进入, 终止花粉管的生长以及促使花粉管释放
精子和帮助精子转移(Tamara and Jean-Phil ippe,
2001)。M14中 2个助细胞在开花前均退化。开花后
1天左右, 退化的助细胞质完全消失 , 丧失了吸引花
粉管进入胚囊的功能 , 阻止受精过程的进行, 并引发
卵细胞与次生核的自发分裂。光镜水平的研究表明 ,
M14开花后的胚珠珠孔部位观察不到花粉管(申业等,
2006a), 这与我们的推断是一致的。
690 植物学报 44(6) 2009
与多数被子植物相似 , M14成熟胚囊里, 中央细
胞的细胞质中含有大量的细胞器 , 包括质体、线粒
体、核糖体和粗面内质网, 代谢旺盛。次生核自发分
裂前的中央细胞超微结构特征主要表现为 : 次生核
大, 核膜清晰; 核仁大, 含有核仁泡; 染色质明显; 细
胞质中的核糖体、线粒体、内质网、高尔基体、质
体与脂滴等数量增加, 整个细胞仍处于高代谢活性状
态。这些特征可作为二倍体孢子无融合生殖的次生
核自发分裂的细胞学标志。
多数被子植物的成熟胚囊中, 中央细胞的极核
(或次生核)紧贴卵细胞的合点端 , 这为双受精的进行
提供了最佳位点(胡适宜, 2005)。栽培甜菜的胚囊细
胞化阶段两极核位于卵器的合点端, 随着胚囊发育至
成熟, 两极核融合为次生核并转移至反足细胞附近,
691尚娅佳等: 甜菜无融合生殖单体附加系M14成熟胚囊的超微结构特征
甚至盲囊内(申家恒等, 1986a, 1986b)。Bruun(1987)
认为, 在栽培甜菜中次生核位于反足细胞附近是不正
常的状态。然而事实上我们在 M14中仍然观察到次
生核位于反足细胞附近的现象, 并在此位置进行自发
分裂。极核(或次生核)远离卵细胞是否与自发分裂相
关, 仍需进一步研究。
我们在未开花的胚珠中发现 1例次生核分裂成4
个游离核的现象。这说明次生核的分裂也许并不需
要花粉的刺激。由于只发现 1例, 所以这是否仅是一
种偶发事件, 还有待进一步深入研究。
在卵细胞与次生核自发分裂发育成无性胚与胚
乳的过程中存在一定数量的败育, 其成胚率只有15%
左右(申业等, 2006a)。有些胚囊的卵细胞或次生核发
育到成熟胚囊就不再继续发育, 卵细胞体积缩小 , 细
胞质着色变深 , 细胞器辨认不清 , 与退化助细胞的细
胞质超微结构相似(图 5L)。无融合生殖物种生殖发
育过程中败育现象的普遍存在, 被认为是无融合生殖
的标志性特征(Czapik, 2000)。
3 结论
(1) 甜菜无融合生殖单体附加系 M14成熟胚囊包括1
个卵细胞、2个退化的助细胞、1个具次生核的中央
细胞以及 3-6个反足细胞。
(2) M14具有3种不同类型的卵细胞。极性正常、
代谢活性高的卵细胞可能自发分裂 ; 极性不正常的2
类卵细胞代谢活性低 , 推测其后败育。卵细胞合点端
缺乏完整的细胞壁。
(3) 未经受精自发分裂前的卵细胞与中央细胞具
有细胞核大、核仁明显、细胞器的种类与数量多且
图 5 甜菜无融合生殖单体附加系 M14成熟胚囊中卵细胞的自发分裂
(A)即将分裂的卵细胞 , 细胞核内染色质聚集 , 细胞内的大液泡逐渐转变为小液泡, 可见退化助细胞的部分细胞质 ; (B) (A)中卵
细胞合点区域部分细胞质的放大 , 示卵细胞与中央细胞质膜缝隙间退化的助细胞质 ; (C)即将分裂的卵细胞 , 体积缩小 , 细胞核
内染色质聚集 , 细胞内的大液泡已经转变为许多小液泡 ; (D)即将分裂的卵细胞 , 内部有许多液泡 , 卵细胞与中央细胞质膜之间
形成宽度不等的缝隙; (E) (C)中卵细胞部分细胞质的放大 ; (F) (D)中细胞核附近部分细胞质的放大; (G)即将分裂的卵细胞, 体
积纵向伸长 ; (H) (D)中卵细胞与中央细胞质膜相邻区域的放大 , 示质膜缝隙间的小泡(箭头所示) ; ( I) (G)中卵细胞合点区域与中
央细胞质膜相邻区域的放大, 箭头示质膜缝隙间的小泡 ; (J) (K)中二细胞原胚部分细胞质的放大, 示似乎处于脱分化状态的细
胞器 ; (K)刚形成的二细胞原胚 , 细胞质浓密 , 细胞核弯曲变形 ; (L)退化的卵细胞 , 体积缩小 , 细胞质着色变深 , 细胞器辨认不清
所有图示胚囊的珠孔端向上 , 合点端向下。FA: 丝状器 ; L: 脂滴 ; M: 线粒体 ; N: 细胞核。 (A), (C) , (D), (G) , (K), (L) Bar=5 mm; (B),
(E), (F) , (H) , ( I), (J) Bar=500 nm
Figur e 5 Autonomous division of the egg cells in mature embryo sacs of monosomic addition line M14 of Beta corolli flora in sugar
beet
(A) Egg cell ready to div ide. The chromatin w as condensed in the nucleus, large vacuoles w ere changed into small ones gradually,
and cy toplasm of degenerated synergid w as present; (B) Magnif ication of (A), show ing cytoplasm at the chalazal end of egg cell,
and the cytoplasm of degenerated synergid in betw een the plasma membranes (PM) of the egg and the central cell; (C) A ready-
to-divide egg cell. The volume of cell w as reduced. The chromatin w as condensed in the nuc leus, and large vacuoles had been
changed into small ones; (D) Egg cell just bef ore division contained numerous vacuoles, and there w ere uneven small gaps formed
betw een the plasma membranes of the egg cell and central cell respec tively ; (E) Enlarged por tion of (C), show ing a part of
cy toplasm in the egg cell; (F) Enlarged portion of (D), show ing a part of c ytoplasm surrounding the nucleus of the egg cell; (G) Egg
cell jus t before div ision. The cell elongated lengthw ays; (H) Magnif ication of (D), show ing vesicles in betw een the PM of egg cell
and central cell (arrow s); (I) Enlarged portion of (G), show ing the adjacent region betw een the egg cell and central cell at chalazal
end, w herein some vesic les w ere v isible (arrow s ); (J) Magnif ication of (K), organelles in cytoplasm of the 2-celled proembryo
show ed charac ter of dedif ferentiation; (K) Freshly formed 2-celled proembryo w ith thick cy toplasm and curved nuclei; (L)
Degenerated egg cell w ith reduced size, dark cytoplasm, and the illegible organelles
Figures w ere ar ranged w ith the mic ropylar end tow ards the ups ide. FA: Filiform apparatus ; L: Lipid droplet; M: Mitochondria; N:
Nucleus. Bar=5 mm in (A), (C) , (D) , (G), (K) and (L); Bar=500 nm in (B), (E) , (F) , (H), (I) and (J).
®
692 植物学报 44(6) 2009
呈现旺盛代谢活动的特征, 这些特征成为二倍体孢子
无融合生殖过程中卵细胞与次生核自发分裂的细胞
学标志。
致谢 美国纽约州立大学石溪分校医学院田国伟博
士审阅全文; 鲁东大学刘林德教授和王艳杰老师在电
镜技术方面予以指导 , 特此深表谢意！
参考文献
郭德栋 , 方晓华 , 刘丽萍 , 康传红 , 李勇 , 王桂芝 (2000). 无融
合生殖甜菜单体附加系的获得与鉴定 . 云南大学学报 21,
180-181.
郭德栋 , 刘丽萍 , 康传红 , 李海英 , 韩晓云 , 唐艳 , 王桂芝
(2001). 甜菜无融合生殖单体附加系的繁殖传递特性 . 黑龙
江大学自然科学学报 18(3), 104-107.
郭德栋 , 王桂芝 , 王继志 , 李汉卿 (1991). 栽培甜菜(Beta vul-
gari s L.)×白花甜菜(B. corol iflora Zoss .)种间杂交的研究 . 中
国遗传学会编. 中国遗传学研究 . 北京 : 中国科技出版社 . pp.
93-94.
胡适宜 (2005). 被子植物生殖生物学 . 北京 : 高等教育出版社 .
pp. 134-176.
胡适宜 , 杨弘远 (2002). 被子植物受精生物学 . 北京 : 科学出版
社 . pp. 78-115.
图 6 甜菜无融合生殖单体附加系 M14成熟胚囊中次生核的自发分裂
(A)自发分裂前的次生核 , 细胞核呈椭球形, 核仁上有明显的核仁泡, 有额外核仁的存在 , 染色质明显, 细胞核周围分布着较丰
富的细胞质 ; (B) , (C)(A )中次生核周围部分细胞质的放大 ; (D)即将分裂的 2个胚乳游离核 , 核仁大而明显 , 有很多核仁泡 , 染色
质聚集 ; (E) , (F)(D)中胚乳游离核附近部分细胞质的放大
所有图示胚囊的珠孔端向上 , 合点端向下。D: 高尔基体 ; M: 线粒体 ; N: 细胞核 ; P: 质体 ; RER: 粗面内质网。 (A), (D) Bar=2 mm;
(B), (C) , (E), (F) Bar=200 nm
Figur e 6 Autonomous division of the secondary nuc leus in mature embryo sacs of monosomic addition line M14 of Beta
corol lifl ora in sugar beet
(A) A ready-to-divide secondary nucleus . The ellipsoidal nucleus w as enc losed by cytoplasm, the chromatin, nucleolar vacuoles,
and ex tra nuc leolus w ere visualized; (B) , (C) Enlarged por tion of (A); (D) Tw o f ree endosperm nuclei ready- to-divide, show ing the
large nucleoli, nuclear vacuoles , and the condensed chromatin; (E) , (F) Enlarged portion of (D)
Figures w ere arranged w ith the micropylar end tow ards the upside. D: Dictyosomes; M: Mitochondria; N: Nucleus; P: Plas tids ; RER:
Rough endoplasmic reticulum. Bar=2 mm in (A) and (D); Bar=200 nm in (B), (C), (E) and (F)
693尚娅佳等: 甜菜无融合生殖单体附加系M14成熟胚囊的超微结构特征
Ultrastructural Characterization of the Mature Embryo Sac in the
Chromosome-9 Monosomic Addition Line of Beta corolliflora in
Sugar Beet
Yajia Shang1, Jiaheng Shen1*, Dedong Guo2, Changhong Ding1, Wei Li1, Junping Lu1
1De partmen t o f B iol ogy, Co lle ge of L ife an d Environmental Scie nce , Harbi n Normal University, Harbi n 1 500 25, Chi na; 2De partme nt
of Bi olog ica l Engi nee ring , Coll ege of Life Scie nce , Heilo ngjian g Universi ty, Ha rbi n 1 5008 0, Chi na
Abstr act We investigated by electron mic roscopy the ultrastruc tural character of the mature embryo sac in the chromosome-9
monosomic addition line of Beta corolli flora Zoss . in sugar beet, designated M14. The mature embryo sac of M14 cons isted of an
egg cell, tw o synergids, a central cell w ith a secondary nucleus , and 3-6 antipodal cells. The egg cells in dif ferent embryo sacs
show ed diff erent polarity and metabolic activity. They w ere c lass if ied into three types according to the polarity of egg cells: (1) egg
cell w ith regular polarity— the nucleus w as located at the chalazal end, and its cytoplasm w as r ich in organelles such as ribosomes,
mitochondria and endoplasmic reticulum; (2) egg cell w ith a nucleus at the micropylar end, and (3) egg cell w ith a centrally located
nucleus. The eggs of the third type contained few er organelles in cytoplasm. The tw o synergids degenerated before anthes is in
most mature embryo sacs. The secondary nuc leus , w hich w as close to the antipodals, show ed strong metabolic activ ity . Both the
egg cell and the central cell contained large nuclei w ith dis tinc t nucleoli and numerous organelles. The egg and the central cell w ere
suggested to be ac tive in metabolism, w hich could be a label of the autonomous div ision of unfertilized egg cell and central cell in
diplospory.
Ke y w ords a uto nom ous div isi on, Be ta vulg ari s, mature emb ryo sac, m ono som ic a ddi tio n l ine, ul tra stru ctu re
Shang YJ, Shen JH, Guo DD, Ding CH, Li W, Lu J P (200 9). Ul tra structu ral ch ara cte rizati on of the ma ture e mbryo sac in the ch rom o-
so me-9 m ono som ic a ddi tio n l ine of Be ta coroll ifl ora in su gar be et. Ch in Bull Bo t 44 , 68 2-69 3.
* Author for correspondence. E-mail: hsdshenjiaheng@yahoo.com.cn
(责任编辑: 刘慧君)
母锡金 , 蔡雪 , 孙德兰 , 时光春 , 朱至清 (2001). 被子植物的无
融合生殖和它的应用前景 . 作物学报 27, 590-599.
申家恒 , 李慧蓉 , 韩晓华 , 王镨 (1986a) . 甜菜受精作用的观
察 . 植物学报 28, 251-255.
申家恒 , 李慧容 , 殷华 (1986b). 甜菜大小孢子发生与雌雄配
子体发育 . 作物学报 12, 205-213.
申业 , 申家恒 , 郭德栋 , 方晓华 , 刘丽萍 (2006a). 甜菜单体附
加系M14无融合生殖的细胞胚胎学研究 . 西北植物学报 26,
957-963.
申业 , 申家恒 , 郭德栋 , 方晓华 , 刘丽萍 (2006b). 甜菜无融合
生殖单体附加系 M14雌配子体的发生与发育 . 武汉植物学
研究 24, 106-112.
孙敬三 , 刘永胜 , 辛化伟 (1996). 被子植物的无融合生殖 . 植
物学通报 13, 1-8.
Bickne ll RA, Koltunow AM (2004) . Unders tanding apomixis:
recent advances and remaining conundrums . Plant Cell 16,
S228-S245.
Bruun L (1987). The mature embryo sac of the sugar beet, Beta
vulgaris: a structural investigation. Nord J Bot 7, 543-551.
Czapik R (2000). Apomixis in monocotyledons. In: Jacobs SWL,
Everett J, eds. Grasses, Systematics and Evolution. Melbourne:
CSIRO. pp. 316-321.
Naumova TN, Matzk F (1998). Dif ferences in the initiation of the
zygotic and par thenogenetic parthw ay in the Salmon lines of
w heat: ultrastructural studies. Sex Plant Reprod 11, 121-130.
Naumova TN, Willem se MTM (1995). Ultrastruc tural charac-
terization of apospory in Panicum maximum. Sex Plant Reprod
8, 197-204.
Tamara NN, Jean-Philippe VC (2001). Ultrastructural analysis of
apomictic development. In: Savidan Y, ed. The Flow ering of
Apomixes: from Mechanisms to Genetic Engineering. Mexico,
DF: Cimmyt, IRD, Europen Commission DGVI (FAIR). pp. 44-63.