全 文 ：植物分类学报 46 (4): 573–585 (2008) doi: 10.3724/SP.J.1002.2008.07097
Journal of Systematics and Evolution (formerly Acta Phytotaxonomica Sinica) http://www.plantsystematics.com

高山植物条纹狭蕊龙胆的分子亲缘地理学研究
1,3陈生云* 2吴桂莉* 1,3张得钧 1,3高庆波 1,3段义忠 1,3张发起 1陈世龙**
1(中国科学院高原生物适应与进化重点实验室, 中国科学院西北高原生物研究所 西宁 810001)
2(兰州大学干旱与草地生态学重点实验室 兰州 730000)
3(中国科学院研究生院 北京 100049)
Molecular phylogeography of alpine plant Metagentiana striata
(Gentianaceae)
1,3Sheng-Yun CHEN* 2Gui-Li WU * 1,3De-Jun ZHANG 1,3Qing-Bo GAO
1,3Yi-Zhong DUAN 1,3Fa-Qi ZHANG 1Shi-Long CHEN *
1(Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota, Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810001, China)
2(Key Laboratory of Arid and Grassland Ecology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)
3(Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract Herbaceous plants have a short life cycle and are sensitive to environmental changes. Thus, they may
serve as good models to elucidate historical processes of plant populations since Quaternary glaciations. Molecular
phylogeographic analysis is a powerful tool to reveal the population history of plants and animals. To understand
the geographic history of alpine plants in the Qinghai-Tibet Plateau, which is still poorly known, we surveyed
sequence variation of the chloroplast DNA (cpDNA) noncoding fragment trnH (GUG)-psbA intergenic spacer
throughout the range of Metagentiana striata (Maxim.) T. N. Ho, S. W. Liu & S. L. Chen, an annual and herba-
ceous alpine plant in the Qinghai-Tibet Plateau and adjacent areas. Seven haplotypes were detected by analyzing
155 individuals from 13 populations of this species. One haplotype (A) was common and widespread, and three
haplotypes (E, F and G) were unique in their populations. The center of haplotype diversity is located in the
Hengduan Mountains of southeastern Qinghai-Tibet Plateau, with 2-3 haplotypes present in each of four popula-
tions. In populations from the northeastern and eastern Qinghai-Tibet Plateau as well as from adjacent regions,
however, only a single haplotype was found in each population, with different populations having different haplo-
types. An analysis of molecular variance (AMOVA) for populations of M. striata showed that the genetic varia-
tion mainly resided among populations (73.05%), and the estimates of interpopulation differentiation were very
high (GST=0.805, FST=0.731, NST=0.859). Further, a significant phylogeographic structure was present (NST > GST,
P<0.05) whereas the value of average gene flow was low (Nm=0.184) in the entire geographical range. Along with
the nested clade analysis (NCA), our results suggested that the Hengduan Mountains of southeastern Qing-
hai-Tibet Plateau served as a possible refugium during the Quaternary glaciations, and the interglacial or post-
glacial range expansion by plants from the refugium followed by allopatric and past fragmentation shaped the
present distribution patterns of haplotypes and populations.
Key words alpine plant, cpDNA, Hengduan Mountains, Metagentiana striata, molecular phylogeography,
refugium, trnH (GUG)-psbA.
摘要 草本植物由于较短的生活周期以及对环境变化的敏感性, 可能会更好地揭示第四纪冰期以来植物居群变化的历史过
程。分子亲缘地理学研究是揭示动植物居群历史的有力工具, 但到目前为止对青藏高原草本植物的分子亲缘地理学研究几乎
是空白。因此, 本文选择在青藏高原及邻近地区生长的一年生高山草本植物条纹狭蕊龙胆为研究对象, 进行了13个居群155
个个体的叶绿体基因组(cpDNA)非编码片段trnH (GUG)-psbA基因间区序列变异检测, 共发现7种单倍型, 其中单倍型Hap A
是分布最广的, 而单倍型Hap E、Hap F和Hap G是拥有的居群所特有的。青藏高原东北部、东部及邻近地区的每个居群拥有
的单倍型非常单一, 而高原东南部横断山区的单倍型分布很集中, 遗传多样性也相对较高。分子变异分析(AMOVA)结果表明

———————————
2007-07-16 收稿, 2007-12-10 收修改稿
* 两位作者对此工作贡献相同(These two authors contributed equally to this work)。
** 通讯作者(Author for correspondence. E-mail: slchen@nwipb.ac.cn; Tel.: 86-971-6110067)。
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整个分布区条纹狭蕊龙胆的遗传变异主要存在于居群间(73.05%), 且居群间的遗传分化很高(GST =0.805, FST=0.731, NST
=0.859), 有着显著的亲缘地理学结构(NST>GST, P<0.05)和较低的居群间的平均基因流(Nm=0.184)。结合巢式支系法分析
(NCA), 根据本文的研究结果推测青藏高原东南部横断山区是该植物第四纪冰期时可能的避难所, 而且在间冰期或冰期后,
伴随着异域片段化和过去片段化从避难所发生范围扩张而形成当前单倍型及居群的分布格局。
关键词 高山植物; 叶绿体DNA; 横断山区; 条纹狭蕊龙胆; 分子亲缘地理学; 避难所; trnH (GUG)-psbA
素有世界屋脊之称的青藏高原, 平均海拔超
过4000 m, 是世界上最高、最大、最年轻的高原。
这里有着独特的自然环境和生态系统, 是我国乃至
全球最珍贵的高山生物物种基因库, 被称为地球第
三极(施雅风等, 1998)。随着地形从东南向西北的渐
次升高, 气温和降水递减, 在青藏高原上植被出现
了森林、草原和荒漠水平地带特征, 而高原上巨大
的山体和断陷盆地形成的高差又使其植被的垂直分
布带亦十分明显(孙鸿烈, 郑度, 1998)。无疑, 青藏
高原现代植物区系的特征和组成, 不仅取决于植物
在现代生态条件下的适应进化, 而且也与晚第三纪
以来的高原隆升和第四纪冰期的地质与气候历史事
件有着密切的联系(孔昭宸等, 1996)。我国及世界各
国植物学家从20世纪30年代就开始对青藏高原植物
区系的起源与演化进行研究, 结果表明青藏高原植
物区系中的大部分属属于北温带分布型, 该区系与
中国－喜马拉雅植物区系密切, 是在喜马拉雅山和
青藏高原隆起的过程中逐步形成的一个年轻区系
(Ward, 1927, 1935; 吴征镒, 1980, 1987; 武素功等,
1995); 同时, 吴征镒(1980, 1987)认为青藏高原东
南部的横断山地区是第四纪冰期高原核心层面甚至
北温带地区植物的避难所, 冰期后成为这些地区植
物的重要起源地和辐射地之一。然而, 这些研究结
论都是根据该地区的古植物学、孢粉学、古气候学
和现代植物的区系特征分析得出的。由于能说明问
题的孢粉或化石证据往往很难找到, 不能明确某个
地区的区系来源及是否为避难所, 因此需要其他类
型的证据、方法和技术以更好地研究这一问题。年
来迅速发展起来的分子亲缘地理学 (molecular
phylogeography)为这方面的研究提供了十分有效的
工具, 目前主要通过直接检测物种不同居群DNA变
异和系谱分析来探讨该物种曾经发生的种群扩散以
及迁移路线, 从而可进一步推测物种当前分布格局
的历史成因, 特别是能揭示出由于受第四纪冰期与
间冰期反复交错的历史事件影响, 使得许多植物物
种在其历史分布上是动态的, 在冰期退缩到避难所
(refugium), 而在间冰期或冰期结束后又发生扩张
形成现代物种分布格局(Cheng et al., 2005; Ikeda &
Setoguchi, 2007; Meng et al., 2007)。在种群水平上直
接检测时更多地使用细胞器基因组(主要包括叶绿
体基因组(cpDNA)和线粒体基因组), 这是因为核基
因组结构过于复杂, 影响因素过多。然而细胞器基
因组具有单亲遗传的特点, 在有性繁殖时不发生重
组, 而是进行无性传递, 因而已被广泛运用于第四
纪冰期以来物种种群历史和迁移路线的研究中
(Avise, 2000; 沈浪等, 2002; Templeton, 2004; Qu et
al., 2005; Yang et al., 2006; Afzal-Rafii & Dodd,
2007)。cpDNA在绝大多数被子植物中为母体遗传,
不经受遗传重组, 提供了一个描述种子专一基因流
的遗传标记, 能真实地反映由于种子扩散而引起的
遗传结构差异, 在许多植物的分子亲缘地理学研究
中被成功应用。尤其是一些cpDNA的非编码区域,
能区分出种内多种单倍型(haplotype) (Mogensen,
1996; Tremblay & Schoen, 1999; Petit & Griver,
2002), 利用单倍型来构建网络关系树, 并结合其地
理分布格局用来探讨物种形成历史以及地质和气候
等历史事件引起的物种扩散及其迁移路线(Petit et
al., 2003; Alsos et al., 2005)。当前该领域对欧洲、北
美部分木本植物以及北极地区的草本植物研究较多
(Hewitt, 1996, 2000; Abbott et al., 2000; Stehlik et al.,
2002; Abbott & Comes, 2004; Schönswetter et al.,
2006; Belaj et al., 2007; Naciri & Gaudeul, 2007), 但
以青藏高原地区特征性植物类群为代表的研究工作
很少 , 仅对该地区分布的木本植物祁连圆柏
Juniperus przewalskii Kom.和青海云杉Picea crassi-
folia Kom．进行了分子亲缘地理学研究(Zhang et al.,
2005; 张茜等, 2005; Meng et al., 2007), 而有关青藏
高原地区草本植物的研究尚未见报道。
条纹狭蕊龙胆Metagentiana striata (Maxim.) T.
N. Ho, S. W. Liu & S. L. Chen隶属于龙胆科Gentia-
naceae狭蕊龙胆属Metagentiana(Ho et al., 2002), 它
的前身是该科龙胆属Gentiana (Tourn.) L.狭蕊组
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sect. Stenogyne Franch. 中 的 条 纹 龙 胆 Gentiana
striata Maxim.(Ho & Pringle, 1995)。该种植物主要
分布于青藏高原东北部及邻近高山地区, 为一年生
草本植物, 生长在海拔2200–4300 m的林缘、灌丛及
高山草甸中。由于草本植物生活周期较短以及对环
境变化的敏感性, 对该植物开展分子亲缘地理学研
究可能会更好地揭示青藏高原地区第四纪冰期以
来植物居群变化的历史过程。因此, 本研究通过检
测覆盖条纹狭蕊龙胆整个地理分布范围的13个居
群155个个体cpDNA非编码片段trnH (GUG)-psbA
基因间区 (intergenic spacer)的序列变异 (单倍型 ,
haplotype), 来进行分子亲缘地理学研究, 从而揭示
该植物单倍型的地理分布式样、居群遗传结构以及
冰期时的避难所及冰期后的迁移路线。
1 材料和方法
1.1 样品采集
本研究共分析了条纹狭蕊龙胆13个居群共155
个个体, 覆盖了其分布范围。材料采自青海、四川、
甘肃和宁夏, 每个居群随机选择5–20个体(表1; 图
1), 居群内个体之间至少相隔5 m以上, 新鲜叶片被
采集后, 迅速用硅胶干燥。凭证标本存于中国科学
院西北高原生物研究所标本馆(HNWP)。
1.2 实验方法
硅胶干燥的叶片采用改进的CTAB法(Doyle &
Doyle, 1987)提取总DNA。在对所有居群个体进行大
规模测序前, 首先选取在地理位置上相隔较远的5
个居群共25个个体(即每个居群5个个体)的总DNA
进行3个cpDNA非编码片段 (psbB-psbF、 rpl20-5
rps12和trnH (GUG)-psbA基因间区)的扩增和测序,
以求寻找能在居群水平上表现出差异的片段。这3
个片段的引物序列依据Hamilton (1999)所述, 分别
为 : psbB (5′-GTTTACTTTTGGGCATGCTTCG-3′)
和 psbF (5′-CGCAGTTCGTCTTGGACCAG-3′) 、
rpl20 (5′-TTTGTTCTACGTCTCCGAGC-3′) 和 5′
rps12 (5′-GTCGAGGAACATGTACTAGC-3′)、trnH
(GUG) (5′-ACTGCCTTGATCCACTTGGC-3′) 和
psbA (5′-CGAAGCTCCATCTACAAATGG -3′)。研
究结果发现, trnH (GUG)-psbA片段表现出了最高的
种内变异, 因此采用这对引物对条纹狭蕊龙胆的所
有个体进行扩增和测序, 统计每个居群的单倍型。
扩 增 反 应 在 Biometra thermal cycler PCR
(Tpersonal 48)扩增仪上进行, 反应体系为25 μL, 内
含: 2.5 μL的10×PCR缓冲液(1.5 mmol/L MgCl2), 0.5
μL的10 mmol/L dNTPs, 引物trnH (GUG)和psbA各
1.25 μL (5 pmol/L), 0.5 μL的Mg2+, Taq DNA聚合酶
0.25 μL (1.25 U), 总DNA模板1 μL (10–20 ng)以及
双蒸水17.75 μL。扩增反应程序为: 94 ℃ 4 min, 接
以38个循环的94 ℃ 50 s, 56 ℃ 50 s, 72 ℃ 75 s,
最后以72 ℃ 7 min结束。扩增产物采用CASpure
PCR Purification Kit试剂盒(上海中科开瑞生物芯片
科技股份有限公司)纯化。纯化后的产物利用相同的
引 物 trnH (GUG) 和 psbA 及 Amersham 公 司 的
DYEnamic Dye Terminator Cycle Sequencing Kit试
剂盒进行测序PCR扩增, 反应体系为10 μL, 包括:
PCR纯化产物为1.0–2.0 μL, 引物各1 μL, 2.5 μL ET,
4.5–5.5 μL双蒸水; 程序为: 95 ℃ 8 s, 95 ℃ 15 s,
50 ℃ 15 s, 60 ℃ 90 s循环31次, 然后60 ℃保温
90 s。产物用Autoseq 96 Plates (Amersham公司)进行
纯化 , 并在MegaBACE500 DNA Analysis System
(Amersham Biosciences Corp.)上进行测序。每条链
均能完整读出约300 bp, 正反两条链重叠达90%以
上。
1.3 数据分析
用Clustal X软件(Thompson et al., 1997)进行序
列对位排列, 并加以手工适当校正。在所有序列校
对正确后, 用DnaSP4.0 (Rozas et al., 2003)程序统计
cpDNA单倍型。以每个居群不同单倍型的个体数目
和总的个体数计算单倍型频率, 然后计算出每个居
群的单倍型多样度(遗传多样度, Hd)(Nei, 1987); 依
据Pons和Petit (1996)所描述的方法, 基于相同的单
倍型频率, cpDNA的居群内平均遗传多样性(HS)和
总的遗传多样性HT, 居群间遗传分化系数GST
(Raymond & Rousset, 1995) 和 NST 值 , 用 程 序
PERMUT2 (http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/
software; 2000次置换检验)和HAPLODIV计算而得。
使用U统计方法对GST和NST进行比较(Pons & Petit,
1996), GST值的计算过程只使用了单倍型频率, 而
NST则把单倍型之间的差异也考虑在内。利用这些计
算值可以检验单倍型变异在整个地理分布区的地理
格局, 如果NST值显著大于GST值(P<0.05), 则表明亲
缘关系相近的单倍型在相同居群中发生, 且有着明
显的亲缘地理学结构出现(Pons & Petit, 1996)。
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图1 条纹狭蕊龙胆居群采样点及叶绿体DNA单倍型分布图 居群编号(1–13)与表1的编号是一致的。
Fig. 1. The sampled locations of populations and distribution of cpDNA haplotypes within and among populations of Metagentiana striata. All of
the population codes from 1 to 13 are accordant with Table 1.


应用ARLEQUIN软件包(version 3.01; Excoffier
et al., 2006)中的分子变异分析AMOVA(Analysis of
Molecular Variance)软件(Excoffier et al., 1992)检测
居群间和居群内水平上的遗传变异组成以及单倍型
分布的FST评价(Weir & Cockerham, 1984), 以进一
步揭示群体的分化程度(1000次置换检验)。同时, 利
用 ARLEQUIN 软 件 包 中 的 Mantel 统 计 学 检 验
(Mantel, 1967), 分别比较条纹狭蕊龙胆居群平均遗
传距离矩阵与地理距离矩阵(经纬度)之间的相关性
(r值表示这两个矩阵间的相关性系数 ), 并进行
10000次重复的显著性检验(Smouse et al., 1986)。
物种水平上的居群间的平均基因流(Nm)和核苷
酸多样度(π)(Nei, 1987)分别通过ARLEQUIN软件包
和DnaSP4.0程序进行检测 ; Tajima’s D (Tajima,
1989)以及Fu和Li’s D*(Fu & Li, 1993)两种无限突变
位点模型的中性检验方法检测及歧点分布
(Mismatch distribution)分析(Rogers & Harpending,
1992)也在DnaSP4.0程序中完成。
分别以毛脉狭蕊龙胆 Metagentiana souliei
(Franch.) T. N. Ho, S. W. Liu & S. L. Chen和翼萼狭
蕊龙胆Metagentiana pterocalyx (Franch.) T. N. Ho &
S. W. Liu各1个个体作为外类群来进行单倍型系统
发育分析(Chen et al., 2005)。利用PAUP* 4.0b10
(Swofford, 2003)做最大简约性 (maximum parsi-
mony, MP)分析时, 采用树二组重新连接TBR分支
交换、多重性选择MULPARS、ACCTRAN特征最
优化, 空位(gap)始终作为缺失状态, 使用启发式搜
索(heuristic search)最简约树, 采用1000次重复的随
机加入(random addition of 1000 replicates)寻找最简
约树的岛屿(islands)分布(Maddison, 1991); 同时利
用靴带分析(bootstrap analysis, BS)进行1000次重复
来检验单倍型各分支的支持率值(bootstrap values,
BS)。利用MrBayes 3.1.1(Huelsenbeck & Ronquist,
2001; Ronquist & Huelsenbeck, 2003)进行贝叶斯分
析(Bayesian analysis)时, 选用最适于拟合该数据集
的DNA进化模型为GTR+Γ+PINVAR模型, 以随机
树(random tree)开始分析, 同时建立4条马尔可夫链
(Markov chains), 马尔可夫链蒙特卡洛(MCMC)长
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度取值100万代(generations), 链的温度(temperature)
等参数取默认值 , 分析执行200万代(generations),
每100代选取一棵树保存, 共获得2万棵树, 根据可
能性值(likelihood values)及经验估计, 忽略全部动
态抽样2000次 , 对剩余的18000次静态抽样计算
50%多数一致性树 , 以贝叶斯后验概率(Bayesian
posterior probability, BPP)作为评估参数(Larget &
Simon, 1999)。
cpDNA 单倍型之间的网络关系用 Network
4.1.1.2程序中的median-joining (Bandelt et al., 1999)
进行分析。这样得到的网络关系树是一种无根的系
统进化树, 各单倍型之间由突变连接。然后按照
Templeton等(1987, 1992)组巢原则构建单倍型巢式
支系图:处在网络关系树边缘、只与一个支系或单倍
型连接的支系或单倍型称为末支(tip clade), 而与一
个以上支系或单倍型连接的支系或单倍型称为内
支(interior clade); 通常认为, 在同一支系内, 末支
和内支分别代表了在进化上较晚和较早的支系或
单倍型(Castelloe & Templeton, 1994)。组巢的基本
原则是从单倍型水平开始, 将末支与其相连的内支
组为一个一级支系; 之后再对一级支系对应的末
支、内支组巢成为二级支系, 直到单倍型网络关系
树组为一个大的完整支系为止。基于巢式支系图,
进行巢式支系法分析(nested clade analysis, NCA):
首先利用Geodis 2.5 程序(Posada et al., 2000)计算
不同支系(从一级支系到一个大的支系)内两种类型
的距离, 巢内距离(Dc), 表示某支系或某单倍型所
有个体与该支系该单倍型地理分布中心的平均距
离, 即该支系的地理分布范围; 巢间距离(Dn)表示
某支系或某单倍型所有个体与包含该支系的高一
级水平地理分布中心的平均距离, 即该支系与进化
上相近的支系间的地理分布关系; 另外, 在所有组
巢水平各个支系内还要计算内支两种距离均值与
末支两种距离均值之差(即各个支系内I–T的Dc和
Dn)。同时, 通过10000次的随机选择来检验上述数
值的显著性大小; 最后, 根据上述的两种距离结果,
参照Templeton (2004)给出的对巢式支系图不同水
平支系距离格局的检索表 (http://drawin.uvigo.es/
download/geodisKey_11Nov05.pdf), 来推测单倍型
地理分布格局的历史成因。
2 结果
2.1 条纹狭蕊龙胆的序列变异分析
对条纹狭蕊龙胆13个居群155个个体进行了
cpDNA片段trnH (GUG)-psbA基因间区全序列的测
定, 序列长度在220–270 bp之间, 排序后长274 bp,
共检测到7种不同的单倍型(Hap A-Hap G)。这7种单
倍型序列注册于GenBank数据库中, 注册号分别为
(正在注册)。单倍型序列比对后共发现8处变异位点:
3处碱基替换(substitution)和5处插入或缺失(indels)。
其中3处替换分别为: 在176 bp处有一个碱基转换
(transition; C↔T)、在211 bp和225 bp处各有一个碱
基颠换(transversion; A↔C和T↔G); 5处插入或缺失
分别位于: 75–77 bp之间(3 bp)、78–86 bp之间(9 bp)、
87–118 bp之间(32 bp)、218–223 bp之间(6 bp)和
245–248 bp之间(4 bp)(表2)。通过统计这一片段所有
个体的序列发现, 碱基A与T在整个序列中所占比
例为65.9%, 这与大多数叶绿体DNA基因间区碱基
组成成分相符(Chiang et al., 2001; Lu et al., 2002)。
2.2 条纹狭蕊龙胆的多样性指数、遗传结构与歧点
分布分析
在条纹狭蕊龙胆13个居群155个个体中, 7种
cpDNA单倍型的频率分别是: Hap A=0.329、Hap
B=0.297、Hap C=0.052、Hap D=0.206、Hap E=0.032、
Hap F=0.065和Hap G=0.019, 其中单倍型Hap A的

表2 条纹狭蕊龙胆叶绿体DNA trnH (GUG)-psbA片段7种单倍型
间的序列变异位点
Table 2 Variable sites of the aligned sequences of the cpDNA
fragments trnH (GUG)-psbA in seven haplotypes of Metagentiana
striata
trnH (GUG)-psbA
变异位点
Variable sites

7
5

7
8

8
7
1
7
6
2
1
1
2
1
8
2
2
5
2
4
5
HapA ▲1 ▲2 ▲3 C A – T –
HapB ▲1 ▲2 ▲3 C A ▲4 T –
HapC – – – T A – T –
HapD ▲1 – ▲3 T A – T ▲5
HapE ▲1 – ▲3 T A – G ▲5
HapF ▲1 – ▲3 T C – T ▲5
单
倍
型

H
ap
lo
ty
pe

HapG ▲1 – ▲3 T A – T –
标记(▲1、▲2、▲3、▲4、▲5和–)分别表示不同的碱基插入/缺失。
▲1: TTT; ▲2, TTCTTCTTT; ▲3, ATAACACAATTTATTA-
CAATATTGATAACTCA; ▲4, CATATT; ▲5, TATT。
The marks ▲1, ▲2, ▲3, ▲4, ▲5 and – respectively indicate different
inserts/deletions. ▲1, TTT; ▲2, TTCTTCTTT; ▲3, ATAACACAA-
TTTATTACAATATTGATAACTCA;▲4, CATATT; ▲5, TATT.


陈生云等: 高山植物条纹狭蕊龙胆的分子亲缘地理学研究


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频率最高, 有51个个体拥有此单倍型。条纹狭蕊龙
胆每个居群的遗传多样度(Hd)、单倍型数量、单倍
型组成及频率见表1, 单倍型的地理分布见图1。就
各居群单倍型的地理分布而言, 单倍型Hap A是分
布最广的, 其中在青藏高原东北部边缘的4个居群
1、4、5和6和位于青藏高原东南部横断山区的居群
13只拥有一种单倍型Hap A, 而横断山区的另一个
居群12拥有3个单倍型Hap A、Hap B和特有单倍型
Hap G, 频率依次为0.550、0.300和0.150 (Hd =0.585);
分布在高原东部的居群2和3中都仅有单倍型Hap B,
居群7中拥有单倍型Hap B和Hap C, 其频率分别是
0.933和0.067 (Hd=0.125), 单倍型Hap B占绝对优势;
青藏高原东南部的居群8、9和10都拥有单倍型Hap
D, 其中居群8拥有高频率(0.750)的单倍型Hap D和
低频率(0.250)的特有单倍型Hap E (Hd=0.375), 居群
9拥有单倍型Hap B、Hap C和Hap D, 频率依次为
0.053、0.368和0.579 (Hd=0.527), 居群10仅有单倍型
Hap D; 而分布在高原邻近地区的居群11固定了特
有单倍型Hap F。由此可见, 在所研究的13个居群中,
高原东南部横断山区的居群拥有两种及以上的单倍
型, 其中居群12在所有居群中的遗传多样度(Hd )最
高, 而居群9的遗传多样度(Hd )次之。
通过PERMUT2和HAPLODIV程序计算得出 ,
条纹狭蕊龙胆居群内平均遗传多样性HS (se)值、总
的遗传多样性HT (se)值、居群间遗传分化GST (se)和
NST (se)值分别为: 0.140 (0.064)、0.715 (0.073)、0.805
(0.081)和0.859 (0.068)。使用U统计方法(2000次置换
检验)对条纹狭蕊龙胆整个分布区单倍型变异的地
理结构进行检验后发现NST显著大于GST (P<0.05)。
这些结果表明了在条纹狭蕊龙胆整个地理分布区
内, 居群间遗传分化水平很高(GST=0.805), 亲缘关
系相近的单倍型在相同居群中发生, 并且有着明显
的亲缘地理学结构出现。分子变异分析(AMOVA)
的结果也表明, 居群间的遗传变异为73.05%, 而居
群内的遗传变异为26.95%, FST=0.731 (P<0.001), 揭
示了条纹狭蕊龙胆的遗传变异主要存在于居群间,
而且具有较高的居群分化水平。Mantel统计学检验
表明, 尽管相关系数较低(r=0.22), 但条纹狭蕊龙胆
居群遗传距离与地理距离之间存在正相关关系
(P<0.05)。另外, 通过DnaSP4.0程序和ARLEQUIN
软件包分别计算得出的核苷酸多样性(π)值和居群
间的平均基因流(Nm )值分别为0.003和0.184。
两种中性检验值均为负值(Tajima’s D=–0.654,
Fu and Li’s D*=–0.519), 但不显著(P>0.10); 同时,
条纹狭蕊龙胆居群所有个体cpDNA片段trnH-psbA
基因间区序列数据的歧点分布(mismatch distribu-
tion)分析结果如图3所示, 观测值与期望值之间比
较, 得到了一个不很明显的单峰分布曲线图, 表明
条纹狭蕊龙胆可能经历过居群近期范围扩张的过
程。
2.3 条纹狭蕊龙胆的单倍型间系统发育和巢式支
系法(NCA)分析
条纹狭蕊龙胆的7种cpDNA单倍型, 以毛脉狭
蕊龙胆和翼萼狭蕊龙胆为外类群进行系统发育分析
时, 序列长度范围在219–279 bp之间, 排序后长296
bp。最大简约性(MP)分析得到9个变异位点, 8个信
息位点, 只产生1棵简约性树(length=17, CI=0.996,
RI=0.991; 图2); 贝叶斯分析(Bayesian analysis)产
生的50%多数一致性树与最大简约性树有着相同的
拓扑结构(未标出)。两种方法分析得到的系统树中
BPP和BS高于50%的值进行了标明。从图2中可以看
出, 7种单倍型主要分成两大分支: 单倍型Hap A、
Hap B、Hap C和Hap G聚为一支(支持率低于50%),
其中单倍型Hap A和Hap B组成的亚分支得到了较
高的支持率(BPP=99%, BS=86%); 而单倍型Hap E、
Hap F和Hap D聚为另一支, 支持率较低(BPP=66%,
BS=58%)。单倍型Hap D和Hap G在进化上相对原
始。
根据组巢原则得到的条纹狭蕊龙胆7种cpDNA
单倍型巢式支系图如图4所示, 其分布格局与最大
简约性树(图2)基本一致。7种单倍型组成了3个一级
支系: 单倍型Hap A与Hap B组成支系1-1, 由一个
突变数连接; 单倍型Hap C与Hap G组成支系1-2,
由两个突变数连接; 而单倍型Hap D、Hap E和Hap F
之间分别由一个突变数连接, 组成支系1-3。这3个
一级支系构成了一个大的完整支系(Total clade), 由
两个和一个突变数分别连接。由此可见, 单倍型Hap
D和Hap G可能是最原始的单倍型, 这与单倍型间
系统发育分析的结果一致。NCA得到的所有组巢水
平各个支系内的内支、末支和内外支的两种距离(巢
内距离Dc和巢间距离Dn), 以及显著性大小值(P)的
结果见表3。检索表分析推测得到的各个支系单倍型
地理分布格局的一系列历史成因见表4: 就整个支
系和一级支系1-1而言, 由范围扩张(range expansion)
植物分类学报 Journal of Systematics and Evolution 2008 46卷4期

580

图2 条纹狭蕊龙胆叶绿体DNA 7种单倍型(A–G)的1棵最大简约(MP)树(length=17; CI=0.996; RI=0.991) 此树与贝叶斯50%多数一致性树有
着相同的拓扑结构。分支上的数字分别表示贝叶斯后验概率(BPP)和简约性分析1000次重复得到的靴带分析支持率(BS)。
Fig. 2. The most parsimonious (MP) tree based on cpDNA seven haplotypes (A–G) of Metagentiana striata (length=17, CI=0.996, RI=0.991).
This tree has the same topology as Bayesian 50% majority rule consensus tree. Numbers above the branches respectively indicate Bayesian posterior
probability (BPP) and MP bootstrap values (BS) based on 1000 replicates.



图3 条纹狭蕊龙胆所有个体叶绿体DNA片段trnH-psbA基因间区序列数据的歧点分布 Exp, 期望值; Obs: 观测值。
Fig. 3. Mismatch distribution for sequences data of the cpDNA fragment trnH-psbA intergenic spacer from all individuals of Metagentiana striata.
The thin line represents the expectation; the dotted line represents the observed value.




图4 条纹狭蕊龙胆叶绿体DNA单倍型(A–G)构建的巢式支系图 “1-# ”表示一级支系(“# ”表示一级支系水平上的支系数量); 在每个连接上
面或右边的数字表示突变步数。
Fig. 4. The nested cladogram of cpDNA haplotypes (A–G) of Metagentiana striata. One-step clades are indicated by “1-# ”, where # is the
cladistic numbers at one-step clade level; The numbers above or at the right of each connections represent mutational steps.
Haplotype A
Haplotype B
Haplotype C
Haplotype G
Haplotype D
Haplotype E
Haplotype F
Metagentiana souliei
99/86
Metagentiana pterocalyx
66/58
100/99
陈生云等: 高山植物条纹狭蕊龙胆的分子亲缘地理学研究


581
表3 基于巢式支系图(图4), 应用程序Geodis 2.5对条纹狭蕊龙胆叶绿体DNA 7种单倍型(A-G)数据进行巢式支系分析(NCA)得到的两种距离*
Table 3 Two distances obtained with the nested cladistic analysis (NCA) of cpDNA seven haplotypic (A-G) data of Metagentiana striata based on
the nested cladogram given in Fig. 4 and Geodis 2.5 program*
零步分支 Zero-Step clades 一步分支 1-Step clades
Hap Pos Dc P Dn P Clade Pos Dc P Dn P
A T 253.082 0.389 294.448 L 0.000
B I 117.697 S 0.000 197.547 S 0.000
I-T
–135.386
S 0.000 –96.901 S 0.000
1-1 T 258.412 0.446 272.876 L 0.017
C T 54.224 0.276 63.902 L 0.005
G I 0.000 0.222 40.777 S 0.005
I-T
–54.224 0.222 –23.125
S 0.005
1-2 I 57.973S 0.000 240.077 0.254
D I 128.674 S 0.000 161.445 S 0.000 1-3 T 187.830S 0.000 226.612 S 0.007
E T 0.000 S 0.010 154.663 0.064
F T 0.000 S 0.000 257.570 L 0.000
I-T 128.674 L 0.003 –61.823 S 0.000
I-T –177.402 S 0.000 –17.699 0.277
*1-# (支系)在图4中已指定; Hap, 单倍型; I, 内支; I-T, 内支两种距离与末支两种距离均值之差; Pos, 位置; T, 末支。对数据进行10000次随机
选择以检测巢内距离(Dc)或巢间距离(Dn)是明显大或明显小, 明显性水平是P<0.05 (P是一个随机产生的概率值, 它表示与观察值相等或更
大(更小))。
*1-# (Clades) designated in Fig. 4; Hap, haplotypes; I, interior clade; I-T, the average difference between interior vs. tip clades for both distance
measures; Pos, position; T, tip clade. Tests determine whether the within-clade distances (Dc) or nested clade distances (Dn) are significantly large (L)
or significantly small (S) based on 10000 randomizations of the data, with their level of significance P<0.05 where P is the probability of a randomly
generated value being equal to or larger (smaller) than the observed value.


表4 基于对条纹狭蕊龙胆叶绿体DNA单倍型数据的巢式支系分析结果(表3), 应用Templeton (2004)的检索表分析得到的一系列推论(P, 表
示显著性检验值)。
Table 4 Chain of inference from the nested clade analysis of the cpDNA haplotypes data of Metagentiana striata (Table 3) using Templeton’s
(2004) inference key (P, the values of significant tests)
分支Clade 概率P 检索Clade key 推论Inferences
1-1 0.000 1-2-11-Yes 范围扩张Range Expansion
1-2 0.005 1-19-No 异域片段化Allopatric Fragmentation
1-3 0.000 1-2-3-5-15-No 过去片段化Past Fragmentation
Total clade 0.000 1-2-11-Yes 范围扩张Range Expansion


形成; 而在一级支系1-2和1-3, 分别由异域片段化
(allopatric fragmentation)和过去片段化 (past frag-
mentation)所致。
3 讨论
与其他一些北极高山植物的cpDNA片段核苷
酸多样性相比, 条纹狭蕊龙胆cpDNA非编码片段
trnH (GUG)-psbA基因间区的核苷酸多样性水平相
对 更 低 (π=0.003), 如 运 用 cpDNA 非 编 码 片 段
trnL-trnF检测Draba aizoides L.时发现, π为0.035
(Widmer & Baltisberger, 1999); 使用cpDNA非编码
片段 trnL-F 和 trnS-trnG检测笃斯越桔 Vaccinium
uliginosum L., 结果发现该植物的π为0.063 (Alsos et
al., 2005)。叶绿体基因组进化的主要来源之一是小
片段的碱基插入/缺失以及点突变, 而前者出现的
频率通常比后者要高(Clegg et al., 1994)。条纹狭蕊
龙胆的cpDNA片段检测结果发现, 在单倍型序列的
8个变异位点中, 小片段的插入/缺失占了5个, 而点
突变仅占了3个(表2)。由此表明了条纹狭蕊龙胆单
倍型序列间的分化水平较低, 种内遗传分化经历的
时间较短。通过分子钟估测狭蕊龙胆属从龙胆属分
化的时间大约是第三纪中新世时期11.4–21.4 Ma
(Million years ago, 百万年以前), 而条纹狭蕊龙胆
从狭蕊龙胆属分化的时间大概在3.3–6.2 Ma (Chen
et al., 2005), 表明了条纹狭蕊龙胆起源较晚, 因此
也就间接证明了该植物种内遗传分化经历的时间
也较短。陶君容(1992)认为我国的草本植物繁盛时
期大约是从第三纪中新世开始, 这与狭蕊龙胆属的
分化时间相吻合。而到了中新世晚期, 由于我国西
南部一系列山系继续抬升, 如喜马拉雅山、横断山
等, 阻挡了来自印度洋的季风, 使得气候变凉、更
植物分类学报 Journal of Systematics and Evolution 2008 46卷4期

582
加干燥, 一些木本植物向南迁移或绝灭, 草本植物
更加繁盛(Quade et al., 1989; 陶君容, 1992), 一些
在中国高山广泛分布的典型属如龙胆属、狭蕊龙胆
属和报春花属Primula L.等发生强烈地辐射分化
(Axelrod et al., 1996), 产生了更多的新种。同时横断
山地区也被许多学者认为是北温带一些大属(包括
龙胆属)的分布和多样化中心(吴征镒, 1979; Wu,
1980, 1987; 王文采, 1992; 李锡文, 李捷, 1993)。由
此推测条纹狭蕊龙胆可能是在第三纪晚期起源于
中国西南的横断山地区后向北扩散至青藏高原东
北部及邻近高山地区(陈生云, 2005)。
植物cpDNA遗传的形式和机制多种多样, 多数
植物具有单亲遗传特征, 从严格的母系遗传到父系
遗传都有, 母系遗传是主要的形式, 比较强的父系
遗传只存在于几种裸子植物中。如Meng等(2007)对
青海云杉Picea crassifolia Kom.研究发现cpDNA在
这一植物中是父系遗传(通过花粉传播)的; 而对许
多被子植物的检测后发现, cpDNA是通过母系遗传
(通过种子传播)的, 从而使得居群间基因流都很低,
遗传分化通常都较高(Fujii et al., 2002; Bittkau &
Comes, 2005; Ikeda et al., 2006; Koch et al., 2006)。
通过对一年生草本植物条纹狭蕊龙胆整个地理分
布区的13个居群155个个体进行cpDNA非编码片段
trnH (GUG)-psbA基因间区进行检测同样发现, 居
群间遗传分化程度很高(GST=0.805, NST=0.859); 而
且AMOVA分析结果也表明条纹狭蕊龙胆中73.05%
的遗传变异存在于居群间(FST=0.731), Mantel统计
学检验的地理距离与遗传距离之间的正相关关系
也支持了这一结论(P<0.05); 同时, 研究发现条纹
狭蕊龙胆物种水平上居群间的平均基因流很低
(Nm=0.184)。由此可知, cpDNA在该植物中是以母系
遗传为主的, 而造成当前这种居群间很低的基因流
和很高的遗传分化现象的主要原因可能是由于种
子传播的距离相对有限, 以及居群间的地理隔离
(如高原东南部的岷山使得居群8和9与居群12发生
隔离)和生境片段化(如高原邻近地区的居群11)阻
碍了居群间的基因交流(Slatkin, 1985; Koch et al.,
2006; Ehrich et al., 2007)。
从图1可以看出, 在条纹狭蕊龙胆整个地理分
布区所分析的13个居群中, 单倍型的地理分布格局
表现出在青藏高原东南部的横断山区分布最为集
中, 如居群7、8、9和12中拥有6种单倍型, 而在青
藏高原东北部及邻近地区的居群中拥有的单倍型
却非常单一。另外, 从条纹狭蕊龙胆不同居群的遗
传多样度分析表明, 青藏高原东南部居群的遗传多
样度较高, 如居群12的遗传多样度最高(Hd=0.585)、
居群9次之(Hd=0.527), 而且有较多数量的特有单倍
型, 如居群12拥有特有单倍型Hap G。由此表明该地
区的居群有着较高的遗传变异和单倍型特有性。许
多研究表明一个物种的遗传多样度在冰期避难所
与冰后期扩散的居群间存在差异, 避难所的居群应
具有更高的遗传多样度, 而扩散地区的居群遗传多
样度相对较低, 这是因为当物种在间冰期或冰后期
从避难所向外扩散时, 可能伴随着奠基者效应, 居
群会受到一系列瓶颈作用影响, 使得迁移后的居群
遗传多样度降低(Ibrahim et al., 1996; Avise, 2000;
Hewitt, 1996, 2000)。同时, Petit et al. (2003)认为在
避难所地区的居群, 不仅有高的遗传变异, 而且有
着单倍型的特有性。通过对条纹狭蕊龙胆cpDNA单
倍型的系统发育和巢式支系图分析(图2、4), 结果表
明固定于高原东南部横断山区居群中的单倍型Hap
D和Hap G可能是进化上最为原始的单倍型; 而单
倍型Hap A、Hap C、Hap E和Hap F位于支系图的最
顶端, 并且变异步骤数多数很低, 表明这些单倍型
应该是新近分化出来的。由此我们推测高原东南部
横断山地区一带是条纹狭蕊龙胆在第四纪冰期时
可能的避难所, 而高原面上的居群可能是该植物在
间冰期或冰后期从这些避难所发生扩张所形成的。
这一推论与吴征镒(1979, 1987)提出的青藏高原东
南部横断山地区是第四纪冰期青藏高原植物的避
难所, 以及高原上的植物是在间冰期或冰后期从这
些避难所扩散而来的观点一致。
NCA的结果很好地支持了上述观点。首先, 通
过对亲缘关系相近的条纹狭蕊龙胆cpDNA单倍型
Hap A和Hap B组巢成的支系1-1推测发现, 当前单
倍型地理分布格局的历史成因是由于范围扩张形
成(表4)。同时, 我们已证明亲缘关系相近的单倍型
在相同居群中发生 (NST>GST, P<0.05), 而单倍型
Hap A和Hap B只在作为第四纪冰期可能避难所的
青藏高原东南部横断山区居群12中同时出现, 由此
可以更进一步推测条纹狭蕊龙胆青藏高原东北部
的居群(1、4、5和6)、高原东部的居群(2、3和7)和
高原最南部的居群(13)是在间冰期或冰后期由居群
8、9、10和12所在的避难所发生范围扩张形成的, 而
陈生云等: 高山植物条纹狭蕊龙胆的分子亲缘地理学研究


583
不是孑遗类群。这些扩张后的居群缺乏原始单倍型
(Hap D和Hap G)的原因可能是由于在扩张过程中
伴随有严重的瓶颈效应或奠基者效应, 同时原始的
单倍型很有可能被新近分化出来的单倍型(Hap A
或Hap B)所替代(Hewitt, 1996)。这一结论与青藏高
原两种木本植物祁连圆柏和青海云杉的研究结果
是一致的(Zhang et al., 2005; Meng et al., 2007); 而
单倍型Hap C和Hap G组巢而成的支系1-2和单倍型
Hap D、Hap E和Hap F组成的支系1-3经NCA分析后,
推测其历史成因分别是由于异域和过去片段化而
造成的。这是因为包括居群12(固定原始单倍型Hap
G)的高原东南部横断山区避难所与居群8和9所在
的横断山东北部边缘地区, 在第四纪冰期时可能各
自成为避难所, 间冰期或冰期后由于受地理隔离
(岷山山系)的影响, 使得横断山东北部边缘地区的
居群发生异域片段化。至于过去片段化的历史成因,
我们认为横断山东北部边缘地区的居群8和9(固定
单倍型Hap D和Hap E)、高原东部边缘居群10(固定
单倍型Hap D)与高原邻近高山(宁夏六盘山)地区居
群11(固定特有单倍型Hap F)之间, 可能由于晚第三
纪时期高原迅速隆升事件造成的青藏高原和邻近
黄土高原大的山脉形成(陶君容, 1992), 使得条纹狭
蕊龙胆在这一带扩散形成的居群发生生境片段化,
以母系遗传(种子传播)为主的基因交流匮乏, 从而
形成当前格局, 而居群11却已被新分化出来的特有
单倍型Hap F所代替。就整个地理分布区的单倍型
(整个支系)分布格局而言, 范围扩张是主要的历史
成因, 而我们进行的两种中性检验值(Tajima’s D
=–0.654, Fu and Li’s D* =–0.519)和歧点分布分析结
果(图3)也表明了条纹狭蕊龙胆可能经历居群近期
扩张的过程, 因此也对上述的推论给予了支持。总
之, 上述的结论也在青藏高原的两种木本植物中存
在, 对青藏高原祁连圆柏和青海云杉的分子亲缘地
理学研究表明青藏高原东南部边缘地区是冰期时
的避难所, 这两种植物的居群是在冰后期从高原边
缘的避难所重新扩散到青藏高原, 而不是它们曾广
布于当地后来由于生境片段化而隔离存在的孑遗
类群(杨瑞等, 2005; Zhang et al., 2005; 张茜等,
2005; Meng et al., 2007)。那么, 是否青藏高原的植
物类群都经历了上述的进化模式, 还需检测更多的
植物类群来得以证实。
致谢 国家自然科学基金 (30170066, 30370284,
30670130)资助。
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