全 文 ：植 物 分 类 学 报 44 (5): 488–493(2006) doi:10.1360/aps050044
Acta Phytotaxonomica Sinica http://www.plantsystematics.com
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2005-03-14收稿, 2005-09-15收修改稿。
基金项目: 国家自然科学基金(30470120); 国家“863”计划项目(2004AA241120); Pickle Seed Research Fund of Pickle
Packer International, Inc. (Supported by the National Natural Science Foundation of China, Grant No. 30470120; the National
High Technology Research and Development Program, Grant No. 2004AA241120; and Pickle Seed Research Fund of Pickle
Packer International, Inc.
* 通讯作者(Author for correspondence. E-mail: jfchen@njau.edu.cn)。
栽培黄瓜与野黄瓜正反杂交的几种同工酶分析
1, 2罗向东 1, 2戴亮芳 1刘 强 1娄群峰 1钱春桃 1陈劲枫*
1(作物遗传与种质创新国家重点实验室, 南京农业大学园艺学院 南京 210095)
2(江西师范大学生命科学学院 南昌 330027)
Isozyme analysis of reciprocal interspecific hybrid F1
between Cucumis sativus and its wild
relative C. hystrix
1, 2LUO Xiang-Dong 1, 2DAI Liang-Fang 1LIU Qiang 1LOU Qun-Feng
1QIAN Chun-Tao 1CHEN Jin-Feng*
1 (State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, College of Horticulture,
Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
2 (College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330027, China)
Abstract Electrophoresis of aspartate aminotransferase (AAT), malate dehydrogenase
(MDH) and esterase (EST) were performed to characterize and compare the reciprocal
interspecific hybrid plants between cultivated cucumber (Cucumis sativus cv. Changchunmici,
2n=14, CC) and its wild relative C. hystrix (2n=24, HH), and their parents. The results
indicate that the zymograms in the reciprocal F1 were typically expressed by complementary
bands from both parents. In addition, four heterodimeric bands (Aat-1-94, Aat-2-104,
Mdh-3-102 and Est-5-102) were observed. All the three isozymes investigated could identify
the interspecific hybrid plants. The results also reveal the differences of the reciprocal F1s at
the number and intensity of the bands in the zymograms of AAT and MDH, which further
confirmed the reciprocal differences in the interspecific hybridization between C. hystrix and
C. sativus.
Key words isozyme, cucumber, interspecific hybrid.
摘要 运用天冬氨酸转氨酶(AAT)、苹果酸脱氢酶(MDH)以及酯酶(EST)3种同工酶对栽培黄瓜“长春密
刺”Cucumis sativus cv. Changchunmici (2n=14)与野黄瓜C. hystrix (2n=24)的正反交种间杂种F1 (正交: 野
黄瓜×栽培黄瓜“长春密刺”, 反交: 栽培黄瓜“长春密刺”×野黄瓜)及其双亲进行鉴定和比较研究。
结果表明: 正反交种间杂种F1主要表现为双亲酶带的互补, 同时还形成4个杂合带(Aat-1-94、Aat-2-104、
Mdh-3-102和Est-5-102)。上述3种酶均能准确地鉴定种间杂种的真实性。研究还发现正反交杂种F1的AAT
和MDH的酶谱分别在酶带数目和强弱上表现出一定的差异, 进一步证实了野黄瓜与栽培黄瓜杂交存在
正反交差异。
关键词 同工酶; 黄瓜; 种间杂种

5期 罗向东等: 栽培黄瓜与野黄瓜正反杂交的几种同工酶分析 489
我们通过栽培黄瓜Cucumis sativus L.(2n=14)与同属野生种野黄瓜C. hystrix Chakr.
(2n=24)的种间杂交及随后的回交, 获得了一系列特异种质资源, 如双二倍体新种(C.×
hytivus Chen & Kirkbride, 2n=38)(Chen & Kirkbride, 2000)、异源三倍体黄瓜(2n=26)(Chen
et al., 2003)和单体异附加系(2n=15)(Chen et al., 2004)等, 为黄瓜遗传育种与基因组研究
奠定了重要基础。为了进一步利用野黄瓜的有用性状进行黄瓜品种改良, 需要扩大基因
型培育新的种间杂交组合, 而对这些新的种间杂种进行快速准确的鉴定是进一步研究和
利用的前提。
同工酶是一种特异蛋白质, 其差异主要由基因的差异决定(Tanksley & Orton, 1983)。
它不仅是一种鉴定外源遗传物质的有效手段, 而且还能够揭示亲本的遗传物质在杂种中
的遗传特性(Brown, 1988)。同时, 同工酶技术具有快速、便捷、不易受环境条件影响等
优势, 因此在作物远缘杂交相关研究中得到了广泛应用(Brown, 1988)。此前我们也曾报
道了用淀粉胶苹果酸脱氢酶(MDH)鉴定黄瓜属Cucumis L.种间杂种(Chen et al., 1997b),
但利用其他的同工酶鉴定黄瓜属种间杂种的可行性和效率还不清楚, 而且不同的同工酶
在黄瓜属正反交种间杂种中表达是否一致尚未见报道。为此, 本文利用新获得的黄瓜属
种间正反交杂种F1及其双亲在内的几种同工酶酶谱进行比较分析, 从而获得双亲的遗传
物质在正反交种间杂种中酶谱表达特征的信息, 为精确鉴定种间杂种F1提供更有力的证
据, 为跟踪鉴定外源有用基因在回交后代中的遗传奠定基础。
1 材料和方法
1.1 植物材料
本研究所用的材料分别为黄瓜属野黄瓜(2n=24, HH)、栽培黄瓜“长春密刺”(C. sativus
cv. Changchunmici, 2n=14, CC)及以此为亲本配制的正反交种间杂种F1。野黄瓜是从中国
云南西双版纳收集而来(Chen et al., 1997b), 为多代自交保存的近缘野生种。“长春密刺”
购于新疆农业科学院园艺研究所, 是本实验室自交保存的常规品种。正交种间杂种F1(C.
hystrix×C. sativus, 2n=19, 用HC表示)和反交种间杂种F1(C. sativus×C. hystrix, 2n=19,
用CH表示)是2004年春季进行种间杂交, 经胚胎拯救获得的植株在无菌条件下保存。2004
年8月中旬对无菌苗进行生根驯化, 同时将其他参试种子在室内催芽播种, 所有材料于8
月下旬定植于南京农业大学蔬菜实验地。
1.2 同工酶分析方法
各试材分别选取10株供混合取样, 选用刚展开的健康嫩叶作为天冬氨酸转氨酶
(AAT)和苹果酸脱氢酶(MDH)的提取材料, 选用未开放的花蕾(直径3–5 mm)作为酯酶
(EST)的提取材料。提取时, 称取叶和花蕾各0.5 g, 分别加入1 mL酶抽提液研磨。抽提液
为0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5), 内含0.2%的巯基乙醇和10%的蔗糖。研磨匀浆后
在5000 r/min下离心10 min, 取上清液保存于–20 ℃冰箱中待用。
用上清酶液做垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离胶浓度为8%, 浓缩胶浓度为3%,
电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液(pH 8.7)。每样品槽加样20 µL, 用溴酚蓝作前沿指示剂。
在4 ℃冰箱中电泳, 稳压, 浓缩胶130 V, 约30 min, 分离胶260 V, 约3 h。电泳完毕, 3种
同工酶的染色和酶带迁移率计算按何忠效和张树政(1999)介绍的方法进行。
植 物 分 类 学 报 44卷 490
参照黄瓜属中的AAT(Sujatha et al., 1991)、MDH(Knerr et al., 1995)和EST(Guirgis et
al., 1996)同工酶已有的报道结果进行酶谱分析和命名, 酶谱命名方法如下: 同工酶位点
酶的英文缩写组成, 第一个字母大写, 其余字母小写。多位点的命名在酶的英文缩写后用
一个与连字号连接的数字表示位点的序号, 序号从最阴极端编到最阳极端。某一位点的
等位基因(酶带)按酶带迁移率从阴极到阳极编序, 序号用上标的数字表示。将来自栽培黄
瓜的等位基因所编码带(即标准带)的相对迁移率(Relative mobility, Rf)定为100, 其他的等
位基因编码的同聚体产物的迁移率参照迁移率为100的带来定值。例如, Aat-22比标准带
(Aat-21)向阳极多迁移了8 mm, 那么这个基因编码带的迁移率为108, 即Aat-22-108。
2 结果和分析
2.1 种间杂种同工酶鉴定
从图1和图2的3种同工酶酶谱可看出, AAT、MDH和EST 3种同工酶均能有效地鉴定
野黄瓜与栽培黄瓜“长春密刺”间的种间杂种。野黄瓜与栽培黄瓜“长春密刺”在AAT
酶谱的3个位点以及EST中的5个位点具有多态性; 在MDH中, 它们之间也具一定多态性
(Mdh-4), 同时酶带强弱差异明显(Mdh-3)。正反交种间杂种HC和CH的3种同工酶谱同双
亲相比, 主要表现为互补双亲的酶带, 同时还形成了4条杂合带(Aat-1-94、Aat-2-104、
Mdh-3-102和Est-5-102)。
2.2 同工酶酶谱分析
2.2.1 AAT 在得到的AAT酶谱(图1)上, 远缘杂交亲本野黄瓜和栽培黄瓜“长春密刺”
分别表现出6条和5条酶带。与父母本相比, 正反交杂种HC和CH分别表现出11条和8条酶



图1 栽培黄瓜、野黄瓜及其正反交种间杂种的天冬氨酸转氨酶同工酶酶谱及解释图 1, 栽培黄瓜“长春密刺”×
野黄瓜; 2, 野黄瓜×栽培黄瓜“长春密刺”; 3, 野黄瓜; 4, 栽培黄瓜“长春密刺”。箭头所指为杂合带。
Fig. 1. The zymograms of aspartate aminotransferase isozyme of Cucumis sativus and C. hystrix and their interspecific
hybrids. 1, C. sativus cv. Changchunmici×C. hystrix; 2, C. hystrix×C. sativus cv. Changchunmici; 3, C. hystrix; 4, C.
sativus cv. Changchunmici. The arrowheads indicate heterodimeric bands of hybrids.
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图2 栽培黄瓜、野黄瓜及其正反交种间杂种的苹果酸脱氢酶(A)和酯酶(B)同工酶酶谱及解释图 1, 栽培黄瓜“长
春密刺”×野黄瓜; 2, 野黄瓜×栽培黄瓜“长春密刺”; 3, 野黄瓜; 4, 栽培黄瓜“长春密刺”, 箭头所指为杂合带。
Fig. 2. The zymograms of malate dehydrogenase (A) and esterase (B) isozymes of Cucumis sativus and C. hystrix, and
their interspecific hybrids. 1, C. sativus cv. Changchunmici×C. hystrix; 2, C. hystrix×C. sativus cv. Changchunmici; 3,
C. hystrix; 4, C. sativus cv. Changchunmici. The arrowheads indicate heterodimeric bands of hybrids.


带。根据种间杂种HC和CH中表现出的酶谱特征以及此前有关黄瓜属作物AAT同工酶
的研究结果, 揭示了参试材料的AAT同工酶由4个变异位点(Aat-1、Aat-2、Aat-3和Aat-4)
组成, 与Sujatha等(1991)的结果相似。
电泳分析表明, 杂交亲本在所有的4个AAT位点中的3个位点表现多态性。它们的正
反交杂种HC和CH的酶带与双亲的酶带存在明显差异, 正反交杂种的AAT酶谱不仅与双
亲具有共同的酶带, 同时还表现了2条双亲所没有的杂合酶带(Aat-1-94和Aat-2-104), 杂
合带都介于父母本同一位点的酶带之间, 其中Aat-2-104为典型的三带型二聚体酶带。
从图1还可看出, 正反交杂种HC和CH的AAT酶谱表达具有明显的差异, 如当野黄瓜
作父本时, 其酶带Aat-1-91和Aat-4-100不能在杂种CH中得到表达, 反之则能在杂种HC中
得到表达, 表明杂种F1的AAT酶谱表达特性与其母本更相似。另外, 在杂种HC中还表现
出其他参试材料都没有的酶带Aat-4-103, 这可能是由于父母本同工酶亚室重组产生的
(Fu et al., 2004)。
2.2.2 MDH 从图2A可看出, 参试材料的MDH同工酶酶谱具有4个清晰可辨的变异位
点(Mdh-1、Mdh-2、Mdh-3和Mdh-4), 与Knerr等(1995)的结果一致。而在我们以前报道的
淀粉胶MDH同工酶中, 主要在Mdh-2和Mdh-3上显色, 其余两个位点的酶带非常弱(Chen
et al., 1997b)。在所有4个变异位点中, 父母本野黄瓜和栽培黄瓜“长春密刺”分别表现
出9条和7条酶带, 父母本的酶谱除在Mdh-4上表现酶带数目和酶带强弱的差异外, 它们
在其他位点上也表现酶带强弱的差异, 如野黄瓜的Mdh-31酶带明显强于栽培黄瓜“长春
密刺”的酶带。
植 物 分 类 学 报 44卷 492
正反交杂种HC和CH都具有10条酶带。在Mdh-1、Mdh-2和Mdh-4上是双亲酶带的共
显性表达。而在Mdh-3上, 正反交杂种不仅具有双亲所有的酶带, 还比其双亲多1条杂合
带(Mdh-3-102), 也表现出典型的三带型二聚体酶带。正反交杂种HC和CH之间酶带的数
目和位置无差别, 只是HC中的Mdh-4酶带明显强于杂种CH。
2.2.3 EST 酯酶同工酶存在着明显的组织特异性, 在幼叶中几乎检测不到酶带, 而改
用花蕾作材料时酶谱较丰富(图2: B)。6个位点(Est-1–Est-6)的酶带均能表现出来, 与
Guirgis等(1996)报道的结果相似。父母本野黄瓜和栽培黄瓜“长春密刺”分别表现出6
条和8条酶带, 它们除在Est-2和Est-6上表现单态外, 在其余5个位点均表现多态性, 其中
野黄瓜在Est-3和Est-4上没表现出酶带。从图2B还可发现, 正反交杂种HC和CH都分别表
现出10条酶带, 且它们酶谱完全相同。正反交杂种HC和CH也不仅仅是双亲所有酶带的
共显性表达, 而且在Est-5上表现出了1条介于父母本之间的杂合酶带(Est-5-102)。
3 讨论
本文对栽培黄瓜与野黄瓜的正反交种间杂种进行了AAT、MDH和EST分析, 发现
AAT和EST在野黄瓜和栽培黄瓜中均具有较高的多态性(分别有3个和5个位点存在多态
性), 表明两个亲本的种间亲缘关系较远 , 与我们先前报道的结果一致(Chen et al.,
1997a)。此外, 3种同工酶都在杂种中形成稳定的杂合带, 表明所用的3种同工酶均能够被
用来准确鉴定黄瓜属种间杂种。
正反交种间杂种HC和CH的染色体组由来自两个不同物种的基因组组成, 与其双亲
相比, 它们的3种同工酶酶谱主要表现互补双亲的酶带, 同时还出现双亲所没有的酶带
(Aat-4-103)和杂合带(Aat-1-94、Aat-2-104、Mdh-3-102和Est-5-102)。由于同工酶是基因的
直接产物, 种间杂种与双亲间的同工酶酶谱的差异就较为直接地反映了它们遗传基础的
差异, 因此, 通过种间杂种F1加倍后的双二倍体与栽培黄瓜的渐渗杂交, 我们获得了开
发新的育种材料或者新的栽培品种的机会。在这样的情况下, 本文所获得的种间杂种的
同工酶信息对进一步利用种间杂种进行黄瓜品种改良有指导作用, 有助于研究有用基因
从野生种野黄瓜向栽培黄瓜转移。
正反交杂种HC和CH之间的AAT和MDH同工酶酶谱均具有明显的差异, 主要表现在
酶带数目和酶带强弱上的差异, 如在AAT同工酶中, Aat-11酶带的表达与杂交的方向有
关, 即此酶带只在野生种野黄瓜作母本的杂种HC中表达, 而在CH中不表达, 表明AAT
酶谱具有一定的趋亲遗传特性。在MDH同工酶酶谱中, 杂种HC和CH的酶带Mdh-4的强
弱也都接近各自的母本, 也表现出一定的趋亲遗传特性, 表明黄瓜属作物种间正反交杂
种在同工酶的表达上存在一定的差异, 这与我们此前从形态学、细胞学(罗向东等, 2004)
以及DNA水平(Chen et al., 2004)上报道的正反交差异相似, 但这种差异的遗传机理还有
待进一步研究。


5期 罗向东等: 栽培黄瓜与野黄瓜正反杂交的几种同工酶分析 493
参 考 文 献
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