全 文 ：
综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2006年增刊
柑桔抗寒研究的现状与展望
龙桂友1, 2
刘杰 2
饶力群 2
邓子牛 1
熊兴耀 1
焦徕1
( 1 湖南农业大学园艺园林学院,长沙
410128; 2 湖南农业大学生物科技学院,长沙
410128)


摘
要:
柑桔是一种经济价值极高但又常受冻害影响的亚热带果树, 本文总结了柑桔抗寒研究取得的成
果, 介绍了对于柑桔抗寒研究还是空白但是在其他植物抗寒研究上取得的新进展,并由此提出了柑桔抗寒可在冷
诱导蛋白、冷诱导基因和抗寒基因工程等方面进行探讨以及作者粗浅的研究设想。
关键词:
柑桔
抗寒性
低温锻炼
抗寒基因工程
A Review on the Researches of Cold Resistance in C itrus
Long Guiyou
1, 2
L iu Jie2
Rao L iqun2
D eng Ziniu1
X iong X ingyao1
Jiao La i1
( 1Co llege of H orticulture and Landscape, H unan Agr icultural University, Changsha 410128;
2Colleg e of B io science and B iotechnology, Hunan Agr icultural University, Changsha 410128)


Abstrac:t
C itrus is a sort o f very va luably subtropica l fruits wh ich frequen tly su ffers from the influence o f co ld c li

m ates. In presen t pape r is an attem pt to summ arize ach ieves in research of c itrus
co ld res istance and to introduce some
latest results wh ich in c itrus still rem a in in vain of other plants
co ld tolerance. Then it is suggested tha t som e w ork be
m ade concerning co ld- induced prote ins, co ld
induced genes, and gene eng ineering o f cold res istance in c itrus plants.
Key words:
C itrus
Co ld resistance
Co ld acclim ation
Gene eng ineer ing o f co ld resistance


作者简介:龙桂友 ( 1963
) ,男,副教授,硕士,在读博士,主要从事柑桔分子生物学研究, T e:l 13907480596; E
m ai:l longgy63@ 163. com


通讯作者:饶力群 ( 1962
) , E
m ai:l raol iqun@ 163. com
1
柑桔抗寒研究现状
1. 1
低温锻炼及抗寒性的遗传
低温锻炼可诱导柑桔抗寒性的增强 [ 1~ 7]。柑桔
原生质体在低温锻炼 12d其抗冻力升至最大,在一
定程度上可以代表该品种的抗冻性 [ 6] , 体细胞杂种
抗寒性介于两亲本之间, 其抗寒性的遗传与杂交育
种后代的抗寒性遗传基本一致 [ 8, 9] , 因而人们可以
在实验室条件下筛选抗寒的细胞变异系 [ 4, 10]。林定
波等 [ 4]采用
射线诱变和高浓度羟脯氨酸离体选
择的方法,获得抗羟脯氨酸锦橙悬浮细胞系,并再生
植株, 经低温锻炼后抗性细胞系的抗寒性比原供体
细胞提高 1. 4
。李卫等 [ 10 ]用 X
射线辐射
Page

桔柚原生质体,经 - 11
低温选择后, 将存活的原生
质体培养成再生植株。再生植株中检测出 2株的叶
片原生质体的低温半致死温度分别比对照低
1
96
和 1. 68
。
1. 2
柑桔抗寒性的测定方法
测定柑桔植株的抗寒性的技术在室外有田间自
然测定法 [ 11 ] ,室内有冻后恢复观测、组织变褐测定、
测定电解质外渗的电导法 [ 5, 12]、茚三桐法、TTC还原
法 [ 4]、活体染色法、放热分析法和差热分析法等 [ 9]。
近年来罗正荣等 [ 13, 14]在柑桔上应用 Log istic方程拟
合经一系列低温处理后电解质百分率透出的变化,
用该方程的拐点温度作为被测材料低温半致死温
度,使电导法测定结果可衡量柑桔抗冻性强弱的量
化指标,该方法已成为目前柑桔抗寒性研究中测定
植株抗冻能力最常用的一种方法 [ 1 ~ 3, 6~ 8, 10, 13~ 22]。
1. 3
柑桔叶片结构与抗寒性
有研究表明,柑桔叶片结构与其抗寒性存在一
定的联系。钟广炎和陈力耕 [ 23]发现柑桔叶片空隙
率 (叶片内部空隙体积 /叶片体积
100% )与柑桔
种类品种间的临界致死温度之间呈现极显著的正相
2006年增刊 龙桂友等:柑桔抗寒研究的现状与展望
关,空隙率越大, 叶片组织结构越疏松,抗寒性越低,
反之结构越紧密,抗寒性就越强。辜青青等 [ 24]的研
究表明,根据叶片表皮细胞大小、束缚水 /自由水比
值和叶片在不同低温处理下受冻症状判断 4个柑桔
品种遂川金柑、赣椪 1号、宫川和奉新椪柑的抗寒性
强弱顺序一致, 即表皮细胞越小、束缚水 /自由水比
值越大则试材抗寒性强。植物的形态结构是长期对
生态环境适应进化的结果,其变化受环境影响小,加
之叶片空隙率和表皮细胞大小的测定方法简单,可
以作为鉴定柑桔抗寒性有用的指标。
1. 4
化学物质与柑桔抗寒性
植物激素在植物适应逆境中起着积极的调节作
用,尤其是 ABA、GA s在低温逆境中起着重要的调
节作用。刘祖祺等 [ 7]观察到柑桔在人工抗寒锻炼
中,抗寒性开始增强时游离态 ABA和结合态 ABA
分别趋向最高或最低含量,在人工脱锻炼中分别迅
速降低与增加,然后变化平缓。在自然越冬过程中,
随着秋梢生长的停止,柑桔的抗寒性开始增强,而后
是抗寒性最大值保持期 ( 12月中旬至翌年 2月中
旬 ) ,随着春天的临近, 抗寒性迅速消失。在此过程
中,叶片内结合态 ABA含量的变化迅速下降、保持
低水平、急剧上升,几乎与抗寒性的变化同步。ABA
的这种变化趋势与柑桔抗寒性的提高和丧失具有明
显的依存关系。
外源 ABA 处理能诱导柑桔苗 抗寒力发
育 [ 1, 5, 25 ] ,且使进程加快 [ 1, 5] , 而 GA 3处理使柑桔抗
寒力降低 [ 25]。外源 ABA和 PP333处理使叶片内源
ABA 含量 增加, GAS 含 量降低, ABA /GAS 增
大 [ 1, 3, 18 ] ,可能是提高柑桔抗寒力的内在机理。李卫
等 [ 16]认为 PP333提高 Murcott桔橙原生质体抗冻性
可能是 PP333提高柑桔植株抗寒性的关键。此外,
低温锻炼及外源 ABA处理使内源精胺和亚精胺含
量显著增加, 腐胺含量则剧降 [ 3] , 低温锻炼促进脯
氨酸和可溶性糖的积累及细胞水势的下降, 从而增
强了渗透调节的能力 [ 4]。
1. 5
膜组成成份与柑桔抗寒性
质膜是低温伤害的主要部位, 膜的组成成份与
其抗寒性有密切关系。甘霖等 [ 17]证实抗寒性强的
宜昌橙和宁波金柑叶片的棕榈酸和亚油酸含量低,
亚麻酸含量、亚麻酸 /棕榈酸、亚麻酸 /亚油酸比值
高,脂肪酸不饱和度也高, 而抗寒性弱的粗柠檬、伏
令夏橙和哈姆林甜橙则正好相反。脂肪酸不饱和度
与质膜的流动性及其相变有关。有人发现柑桔膜不
饱和脂肪酸的积累与气温呈负相关关系, 冬季叶片
不饱和脂肪酸含量比夏季高出 60%以上,春季解除
抗寒锻炼时不饱和脂肪酸含量下降,而饱和脂肪酸
含量上升 [ 26 ]。孙中海等 [ 19, 26]认为柑桔成熟种子的
膜脂肪酸不饱和度与该品种抗寒性成正相关, 在冬
季相同的低温下叶片膜脂肪酸不饱和度与该品种抗
寒性成正相关,当气温低于某一临界点时抗寒性强
的品种脂肪酸不饱和度增大的速率和幅度较大, 抗
寒性弱的品种要小一些。他们还发现叶片磷脂酰胆
碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油的含量与抗寒性成显
著正相关,溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酸
的含量与抗寒性呈显著负相关 [ 19, 20]。
膜蛋白是膜的重要组成成份,在跨膜运输中担
负着十分重要的作用, 有研究显示柑桔在抗寒锻炼
中合成了新的特异膜蛋白, 预示着膜蛋白比膜脂肪
酸在柑桔的抗寒中有更重要的作用。刘祖祺 [ 1]和
林定波 [ 5 ]对兴津温州蜜柑进行低温锻炼和外源
ABA处理, 在第 7~ 21d两处理均检测到 104、37、30
和 17kD, 第 21d还检测到了 27kD ( ABA处理 )和
82kD(低温锻炼 ) 6种新合成的膜特异蛋白质, 它们
都在 17~ 28
脱锻炼后 3d消失, 它们的产生和消
失与柑桔叶抗寒性的消长相一致,被认为是柑桔抗
寒特异性蛋白。
1. 6
膜脂过氧化与柑桔抗寒性
植物低温膜伤害的自由基假说受到普遍接受,
在柑桔抗寒性发育中清除自由基同工酶活性的提高
及新同工酶产生对清除体内过多的自由基从而间接
地保护膜稳定性具有一定的意义。低温胁迫导致膜
脂过氧化的最终产物丙二醛的积累 [ 2, 12] , 低温锻
炼、ABA 及 亚精胺处理 可降低 丙二醛的 积
累 [ 3, 5, 21] , 柑桔抗 寒性与丙二 醛含量呈负 相
关 [ 12, 21] , 而与自由基清除剂超氧化物歧化酶、过
氧化氢酶、过氧化物酶等酶活性的提高以及抗氧化
剂 V c的含量密切相关 [ 3~ 5, 12, 21, 24]。林定波等 [ 5 ]还
观察到, 低温锻炼和外源 ABA处理兴津温州蜜柑
21d时均产生了数条新的超氧化物歧化酶和过氧化
物酶同工酶。
59
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2006年增刊
1. 7
钙在柑桔抗寒中的作用
柑桔抗寒性的表达实际上是对环境低温信号的
接受、传递和对信号作出一系列反应的过程,已有实
验证明钙可以作为将环境刺激转变为化学反应的第
二信使,适当增加 Ca2 +浓度可以提高 CaM含量,增
强柑桔原生质体抗寒性 [ 27]。李卫等 [ 16, 22]初步证实
PP333和 ABA提高柑桔原生质体抗寒性受钙信使
系统调节,因 PP333和 ABA提高柑桔原生质体抗寒
力的作用被钙离子专一性螯合剂 EGTA (乙二醇双
乙胺醚
N, N

四乙酸 )和钙调素拮抗剂 TFP(三氟拉
嗪 )所抑制。
2
柑桔抗寒研究值得开展的新领域
2. 1
冷诱导蛋白
很多植物经过驯化其抗寒力明显增强, 其原因
是体内产生了冷激蛋白。目前已在菠菜、苜蓿、冬小
麦、冬黑麦、雀麦草、冬油菜和马铃薯等多种植物的
抗寒力诱导中观察到抗寒性特异蛋白质的新合成,
但这些特异性蛋白质在不同植物间差异很大,甚至
同一植物在不同实验中也表现很大区别 [ 28]。马海
慧等 [ 29]认为低温锻炼、热激处理、光照、干旱胁迫、
盐胁迫、机械损伤及外源 ABA等可诱导冷调节基因
表达合成冷调节蛋白。
2. 2
抗冻蛋白
抗冻蛋白 ( AFP) 最早发现于极地鱼类中, 它
们区别于其它冷诱导蛋白的三个基本特征是:
能
够非依数性降低溶液冰点 (热滞效应 );
修饰冰
晶形态;
抑制重结晶 [ 30, 31]。自 1992年加拿大
Griff ith等 [ 32]第一次从冬黑麦中获得植物 AFP以
来, 已先后从冬大麦、小麦、燕麦 [ 33]、沙冬
青 [ 34]、胡萝卜 [ 35]、唐古特红景天 [ 36]和珠芽蓼 [ 37]
等植物中获得 AFPs。这些 AFPs在体外水溶液中均
表现出典型的热滞效应和重结晶抑制活性, 不过植
物 AFPs的活性没有鱼类和昆虫 AFPs的高。抗冻
蛋白低温下对植物的保护作用是直接的, 它们特别
针对零下低温对植物起保护作用, 主要通过重结晶
抑制作用来避免冰晶体对细胞组织的伤害, 在生物
体内的抗冻作用不仅是降低冰点, 更重要的作用是
调节原生质溶液的状态, 使过冷点降低 [ 32 ]。另外,
在裸子植物、蕨类、苔藓、真菌及细菌中也发现了
AFPs的存在 [ 38, 39]。
2. 3
冷诱导基因
1970年, W e iser首先提出植物抗寒性诱导过程
中基因表达改变的观点, 指出多年生木本植物的低
温适应性可能需要两个条件, 即特异基因的转录激
活及在最大抗寒过程中新蛋白质的低温诱导合成,
从而揭示出植物抗寒锻炼实质上是感受低温信号、
调节基因的表达和代谢的环境适应过程 [ 40]。陈香
波等 [ 41 ]列表总结了已从拟南芥、黑麦、欧洲油菜、大
麦、菠菜、小麦、苜蓿、马铃薯等鉴定分离出与植物抗
寒性有关的低温诱导基因不少于 60个, 并指出这些
基因的功能与抗冰冻脱水、膜脂相变、低温下酶活性
以及
抗冻活性
有关。
2. 4
抗寒基因工程
2
4
1
与膜稳定性相关基因的转入
导入脂肪酸
去饱和代谢关键酶基因,通过降低脂肪酸的饱和度,
提高植物的抗寒性。K odam a将拟南芥叶绿体中


3脂肪酸脱氢酶基因 fad7导入烟草中, 所获得转基
因烟草抗寒性增强 [ 42]。 SOD是清除氧自由基防止
膜脂过氧化最关键的酶, M cKersie 等 [ 43] 通过
pEXSOD载体将拟南芥 F e
SOD基因转入紫花苜蓿
中,经过两年的大田试验发现转基因植株越冬存活
率大大提高。 Sam is等 [ 44]将 Mn
SOD基因导人到紫
花苜蓿,提高了转基因植物的膜稳定性。
2
4
2
与渗透胁迫相关基因的转入
转入与脯氨
酸、糖、甜菜碱等小分子渗透调节物质代谢有关的
酶,提高其体内含量, 以增强植物的抗渗透胁迫能
力。Nan jo[ 45]将脯氨酸脱氢酶 (脯氨酸降解关键酶 )
反义基因 A tproDH 的 cDNA转入到拟南芥中, 很好
地抑制了此酶的产量,从而提高了胞内脯氨酸水平,
增强植物抗渗透性。
2
4
3
抗冻蛋白基因的转入
K imberly[ 46]将第一
批来自比目鱼抗冻蛋白 (AFP )基因转入到烟草和番
茄中,在低温下检测到较强的抗冻蛋白活性。黄永
芬用花粉管通道和子房注射法将整合在 T i质粒上
的美洲拟蝶抗冻蛋白基因导入番茄中,提高了番茄
的抗冻性 [ 47 ]。但是鱼类和昆虫的 AFP基因同植物
在分类学上的关系太远,而且基因结构的差异较大,
所以大多数的转基因实验并不理想, AFP基因往往
不能被正确的修饰,甚至在有的实验中,转基因植物
中已经表达了较高浓度的有活性的 AFP, 但转基因
60
2006年增刊 龙桂友等:柑桔抗寒研究的现状与展望
植物仍无抗冻活性 [ 48]。如果人们能够从强抗寒植
物中克隆出具有较高活性的植物 AFP基因, 用它进
行植物的转基因可能结果会更好。 1998年, W orrall
等 [ 35]将胡萝卜 AFP cDNA连接在表达载体的双
CaMV 35S启动子之后导入烟草, 使其组成性表达。
9个独立的转基因株系在温室条件下表现正常。蛋
白质免疫杂交表明, 有 8个株系的叶提取物表达了
36KD的多肽, 且能抑制冰晶生长。 1999年, M eyer
等 [ 49]采用 CaMV 35S启动子, 用农杆菌介导胡萝卜
AFP基因重组子转化拟南芥。在相同条件下, 38个
转基因株系与野生株无表型差异。Northern印迹显
示 AFP基因转录水平高。转基因植物提取液有明
显的抗冻活性,能够修饰冰晶形态;抗冻活性与 AFP
基因转录水平呈正相关。
2
4
4
调控基因的转入
每个调控基因可以调节
一套相应基因的表达,各基因产物之间相互促进、协
同作用,从而有可能使植物的抗寒能力得到质的提
高。1997年, S tochinger等 [ 50]从拟南芥中首次克隆
出 CBF 1抗寒调节基因,以花椰菜花叶病毒 ( CaMV )
35S为启动子,转入到拟南芥中获得 CBF1高表达的
植株, 同时发现转基因植株不经低温驯化就具有强
抗寒性。随后又有人在拟南芥中克隆出了 CBF2和
CBF3,并通过类似的方法将其转入到拟南芥中, 也
获得不经低温驯化就具有强抗寒性转基因植株。最
近 He ish等 [ 51 ]将拟南芥 CBF 1基因转移到不能冷驯
化的西红柿中,发现转基因的西红柿的低温存活率
大大提高。
3
柑桔抗寒研究展望
借鉴其他植物在抗寒研究方面取得的最新进
展,用于柑桔的抗寒研究, 尤其是在冷诱导蛋白、抗
冻蛋白、冷诱导基因和抗寒基因工程等方面几乎还
是空白的时候, 这确实值得广泛深入的探讨。从抗
寒基因和蛋白质的差异表达入手, 分离鉴定抗寒基
因,分析抗寒基因与其表达产物蛋白质之间的关系,
将编码抗寒信息的基因与执行抗寒功能的蛋白质结
合研究,以加深对柑桔抗寒基因功能的了解,为下一
步建立柑桔抗寒基因文库,克隆柑桔抗寒基因并将
其导入栽培良种以提高抗寒性奠定基础。目前我们
课题组已通过蛋白组研究手段发现了一些与低温胁
迫有关的涉及运输、信号转导、光合作用、蛋白质翻
译、能量代谢、抗性等过程的蛋白质,试图利用这些
低温胁迫表达的蛋白质去寻找柑桔抗寒相关的基
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