全 文 ：水稻蛋白质组学研究进展
魏敏1, 2 李阳生2 傅彬英1
( 1中国农业科学院作物科学研究所,北京 100081; 2武汉大学生命科学学院,武汉 430072)
摘 要: 蛋白质组是一个基因组所表达蛋白质的总称, 研究内容包括蛋白质基本氨基酸序列的鉴定到相关
性状、修饰、功能及不同类型蛋白分子相互作用等等。本文简要介绍了蛋白质组学的产生背景, 以及主要研究技术
包括双向电泳( 2DPAGE)质谱、蛋白质芯片、酵母双杂交,并重点介绍了近期水稻蛋白质组学应用研究进展。
关键词: 水稻 蛋白质组学 双向电泳 质谱
Advance in Rice Proteomics
Wei M in Li Yang sheng Fu Binying
( 1 I nsti tu te of Corp Sc ienc e, CA A S , Bei j ing 100081;
2 Col leg e of L i f e S ci ence , Wuhan Univ er si t y , Wuhan 430072)
Abstract: Proteom ics cover s the systematic analysis of pr oteins expressed by a genome, f rom the identification
of their prima ry aminoacid sequence t o the determination o f modif ication and asso ciation w ith o ther pr oteins or mo l
ecules of different types. I n this r eview , w e introduce the backg round o f prot eomics, pr imary techno log y including
2DPAGE, MS, pro tein chips, yeast t wohybrid sy st em, and recently advance in r ice pro teomics application investi
gation.
Key words: Rice P roteomics 2DPAGE MS
1 植物蛋白质组学背景
蛋白质组( Pro teome)是指基因组表达产生的
所有相应的蛋白质,即细胞或组织或机体全部蛋白
质的存在及活动方式 [ 1, 2]。蛋白质组的概念和基因
组的概念有许多差别,基因组基本上是固定不变的,
然而蛋白质组具有时空性和可调节性, 能反映出特
定基因的表达时间、表达量,以及蛋白翻译后的加工
修饰和亚细胞分布等,它随着组织、环境状态的不同
而改变,是一个动态的概念。
蛋白质组学是在基因组学的研究成就和高通量
的蛋白质分析技术取得突破的背景下产生的新兴学
科,基因组研究的发展是蛋白质组学产生的重要前
提。水稻( Oryza sat iv a)是亚洲最重要的粮食作物,
因为它较小的基因组而作为单子叶植物遗传和分子
生物学研究的模式植物 [ 3]。2002年中国科学家和
Syngenta 公司的科学家分别发表籼稻和粳稻基因
组工作框架图[ 4, 5] , 随后日本和中国的科学家分
别发表了粳稻第 1号和第 4号染色体的全序列以及
籼稻粳稻基因的 精细结构图 [ 6, 7] , 这些研究结果
为进一步开展功能基因组学研究打下了坚实的基
础。
在后基因组时代, 研究重心转移到基因功能的
解析,即利用结构基因组所提供的信息和高通量的
实验手段在转录组( T r anscriptome) 和蛋白质组水
平上系统地分析基因的功能。
2 蛋白质组学研究技术
蛋白质组分析技术是蛋白质组功能研究和应用
研究的基本手段, 目前主要是利用双向聚丙烯酰胺
凝胶电泳来分离蛋白质组分,然后采用氨基酸组成
分析、微量蛋白质序列分析、质谱分析等技术对特异
收稿日期: 20050926
基金项目:国家重点基础研究发展规划项目( 973) 水稻抗旱基因发掘与遗传网络解析及重要抗旱基因克隆 ( 2003CB114308)资助
作者简介:魏敏( 1979 ) ,硕士研究生,主要从事水稻功能基因组学研究
通讯作者:傅彬英,研究员。电话: 01062136042;传真: 01068918559; Email : fub y@ caas. n et . cn
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
蛋白质进行精细的鉴定, 从而获得有关蛋白质性质、
表达变化及翻译后加工等方面的信息。
2. 1 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白质双向电泳是将蛋白质等电点和分子量两
种不同特性结合起来对蛋白质进行分离的技术, 具
有较高的分辨率和灵敏度。双向电泳方法的应用始
于 20世纪 70年代, 由 O Farrell于 1975 年建立并
成功地分离 1 000多个 E . col i蛋白(肽)。80年代早
期固相 pH 梯度( Immobilized pH gradient, IPG)的
出现,解决了 pH 梯度不稳的问题,达到高度的重复
性。目前常用的大规格胶( 20cm 20cm )是可再生
的, 分离后的斑点检测借助于考马斯亮蓝染色和银
染,可对蛋白质进行定量分析; 应用荧光染料, 可分
离上千种蛋白质, 同时应用两种不同的荧光染料标
记两个样品(差异凝胶电泳) ,在同一凝胶上电泳后
对图像进行分析,避免了几个凝胶的比对, 这些都大
大提高了双向电泳的精确性。其次, 高加样量使得
双向电泳成为一项制备型技术。
2. 2 质谱技术
质谱是蛋白质组学研究中的核心技术, 其原理
是将样品分子离子化,根据离子间质荷比( m / z)的差
异来分离并确定质量, 高灵敏度高特异性地快速鉴
定生物分子。具体步骤包括将双向电泳 ( 2D
PAGE)分离到的目标蛋白质用特定的蛋白质酶(例
如胰蛋白酶)消化成肽段,再用质谱仪进行分析。
质谱鉴定有两条主要的途径。一是肽链质量
图谱途径。测量质谱的方法是基质辅助激光解吸
附/电离法( Matrixassisted laser desorpt ion/ ioniza
t ion, MALDI) ,通过测定一个蛋白质酶解混合物中
肽段的电离飞行时间来确定分子量等数据,所以也
称为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法
( MA LDIT OF) , 最后通过相应的数据库搜索鉴定
蛋白质。随着数据库中的全长基因序列越来越多,
MALDI 鉴定的成功率也越来越高。二是串联质谱
途径, 将胰蛋白酶消化后的单个肽链直接从液相经
电喷离子化而被分离, 分解为氨基酸或含有 C 末
端的片断,片断被喷射到串联质谱仪进行质量测
定,以得到序列信息。它的主要优点是:对鉴定蛋白
质来说,由几个肽链片段化得到的序列信息比一系
列的肽链质量更具有特异性。片断的数据不仅可以
在蛋白质序列数据库中搜寻,还可以在核酸数据库,
例如 EST 数据库, 甚至原始的基因组数据库中搜
寻。
近来发展起了一种新型的质谱仪,它将 MALDI
离子源与高效的串联质谱仪系统结合起来(可将单
个肽链片断化) ,把高产量的肽链图谱法与高特异性
的肽链序列法结合起来, 并将两步的质谱分析合并
为一步。质谱技术还可用于蛋白质磷酸化、硫酸化、
糖苷化以及其它一些修饰的研究。
2. 3 蛋白质芯片( Protein chips)技术
蛋白质芯片技术是一种高通量、微型化和自动
化的蛋白质分析技术。在蛋白质芯片技术途径中,
首先将一系列的诱饵( Bait ) 蛋白质(如抗体)按照
一定的排列格式固定在经特殊处理的材料表面上。
然后以目标样品为探针来探查该表面, 那些与相应
的抗体相结合的蛋白质就会被吸附在表面上。而后
把未与抗体结合的蛋白质洗掉, 把结合的蛋白质洗
脱下来,经凝胶电泳之后通过质谱法进行鉴定。这
种技术实际上是一种大规模的酶联免疫分析。可以
迅速地将目标蛋白质从混合物中分离出来,并进行
分析。蛋白质芯片上的诱饵蛋白可根据研究目的
的不同,选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物活性的
蛋白质。
蛋白质芯片要比 DNA 芯片复杂得多。芯片制
作过程中保持蛋白质的生物活性, 成为限制蛋白质
芯片发展的瓶颈技术。近年来, 在蛋白质芯片制作
方面获得突破性进展。对蛋白质芯片的检测可以通
过对不同状态细胞的蛋白质进行荧光标记,从测定
荧光的强度上可以得知结合在抗体上的蛋白质的富
集程度。或直接利用 MALDI/ M S 技术检测结合到
芯片上的物质来检测。
2. 4 酵母双杂交系统( Yeast tw ohybrid system)
酵母双杂交系统正成为研究蛋白质间相互关系
的有力工具。其理论基础是转录因子的结构模型,
即当转录因子的 DNA结合结构域与激活结构域紧
密结合后,将导致一系列基因转录的增加。酵母双
杂交系统利用转录因子 GAL4 的 DNA结合结构域
( GA L4BD)与激活结构域( GAL4AD)的特异载体,
将许多开放阅读框架( ORFs)分别连在这两种载体
上,构成文库, 然后转入酵母细胞, 并与酵母细胞克
2 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2005年第 6期
隆杂交。当其中两个 ORF 编码的蛋白质在酵母细
胞中表达,并发生相互作用时, 就会将 GAL4BD 和
GAL4AD结合在一起,从而导致报告基因转录的增
加。通过培养基营养缺陷筛选法, 可将没发生相互
作用的酵母克隆筛选掉, 而将发生相互作用的酵母
克隆保留下来。然后对发生相互作用的蛋白质进行
分析,通过测序就可以鉴定 ORF。因此, 酵母双杂
交系统对大规模筛选分析蛋白质间的相互作用来说
是一项简便易行的方法。
3 水稻蛋白质组学研究应用进展
3. 1 水稻组织的蛋白组分析
3. 1. 1 水稻不同组织差异蛋白组学 在植物发育
过程中,不同组织和器官功能上的分化,也表现在其
蛋白质的差异上, 蛋白质组学研究将有助于对发育
机制的研究。由 Komatsu 等( 1993) [ 8] 构建的水稻
蛋白组文库 是关于水稻组织蛋白组分析的先锋报
导。水稻种子胚、胚乳以及叶片蛋白, 经 2DPAGE
分离,考马斯亮蓝染色, 在胚、胚乳和叶片中检测到
超过 600、100和 150 个主要蛋白。经银染, 叶鞘中
检测到 700个蛋白。胚、胚乳、叶中挑选 85个蛋白
点经气相蛋白质测序仪分析。85个点中, 通过 N-
端序列分析鉴定了 27个蛋白,剩下的 70%蛋白被认
为在 N- 端有堆积集团, 中间序列测序鉴定了 23个
蛋白。最后作者构建了水稻胚、胚乳、叶片的蛋白数
据库,并提供了每个蛋白的分子量和等电点。
Tsug ita( 1994) [ 9] 分析了来自水稻 9种不同组织
(叶, 茎,根,叶, 愈伤组织,芽, 种皮等)和叶绿体的蛋
白。上述 9 种组织的蛋白中, 经 2DPAGE 检出
4 616个蛋白点, 并对 118 个蛋白进行了分析。因为
当时缺少水稻基因组和蛋白数据库信息, 在叶、愈伤
组织、种子、茎、根中分别只鉴定出 16, 6, 3, 1, 1 个
蛋白。
Zhong 等( 1997) [ 10] 分析了水稻根部总蛋白,考
马斯亮蓝染色后检测到 292个蛋白点。N端和中间
氨基酸测序分析了 76 个蛋白。经同源搜索鉴定了
42个蛋白。同年 Hirano 通过 2DPAGE 技术研究
了水稻种子胚、胚乳和叶、根的蛋白。总共分析了
278个蛋白, 4个组织中的 121个蛋白的N端和中间
氨基酸序列已测出。然而,只有 51 个蛋白的序列和
数据库中的蛋白相同。
Im in等( 2001) [ 11] 对水稻花粉囊进行了蛋白组
分析。花粉囊对于植物产能很重要, 它对各种环境
胁迫相当敏感。2DPA GE 结合银染检测到 4 000多
蛋白点, 分布于 PI4~ 11、分子量 6 ~ 122kD 范围。
其中 273个蛋白经 N端测序和质谱鉴定, 通过数据
库匹配和 PMF 分析鉴定了 62个不同蛋白。鉴定的
蛋白大部分是管家蛋白、热休克蛋白以及很多未知
功能蛋白。据此构建了水稻花粉囊蛋白组图谱, 提
供了花粉粒发育过程中的蛋白变化证据, 并对其它
植物的花粉囊研究提供了参考。
Shen等( 2002) [ 12] 通过 Edman 测序和 MALDI
TOF, 对水稻幼苗的叶鞘进行了有效的蛋白组分析。
经图像分析检测到 352个蛋白点,挑选的 84 个主要
蛋白中的 44个测定了氨基酸序列还推定了 31个蛋
白的功能。通过 MALDITOFMS 分析, 鉴定了 59
个匹配于数据库的蛋白。结果显示, 2DPAGE、Ed
man 测序、MA LDITOFMS 和 MS/ M S 的结合应
用对于水稻叶鞘蛋白的有效分析起了重要作用。同
时, Woo等( 2002) [ 13] 通过一种有效的多肽图谱技术
鉴定水稻胚蛋白组。经 2D胶分离, 考马斯亮蓝染色
检测到 700个蛋白点。从中挑选 100个胚蛋白进行
分析, 测出 31个蛋白的氨基酸序列, 并对剩下的 69
个蛋白进行了中间序列测序,但仅有 28个与数据库
已知功能的蛋白序列相似。他们通过 MALDI
TOFMS的多肽质量指纹图谱分析了另外 150 个蛋
白,仅鉴定出 46个已知功能蛋白。剩下的蛋白由于
缺少水稻基因组的完整核酸序列和蛋白数据库的信
息而难以鉴定。
3. 1. 2 水稻非生物胁迫下蛋白质组学 一些非生
物因子胁迫,如干旱、盐渍、寒害、臭氧、缺氧、机械损
伤等,对水稻的生长发育和生存产生严重影响。这
些胁迫能引起大量蛋白质在种类和表达量上的变
化。蛋白质组学分析有助于详细了解非生物胁迫的
伤害机制以及水稻的适应机制。
Ramani和 Apte( 1997) [ 14] 用放射性同位素自显
影双向电泳法研究水稻幼苗盐胁迫下多基因的瞬时
表达表明,至少有 35 个蛋白质被盐胁迫诱导和 17
个蛋白质被抑制,包括 20个在这之前未曾报道的低
丰度蛋白。这些发现对寻找渗透压应答新基因, 尤
其是那些在水稻盐耐性获得中起瞬时调节作用的基
32005年第 6期 魏敏等:水稻蛋白质组学研究进展
因十分重要。
Salekdeh( 2002) [ 15]等研究两个水稻品种( Ory za
sat iva L . cv CT 9993和 cv IR62266)干旱胁迫下以
及恢复灌溉后的蛋白质组。分析叶提取物电泳胶上
的 1 000多个蛋白点, 发现有 42个蛋白点的丰度在
干旱胁迫状态下变化明显,其中 27个点在两个品种
中显示了不同的反应方式。恢复正常灌溉 10d 后,
所有蛋白的丰度完全或是在很大程度上恢复成与对
照一样。
Agraw al等( 2002) [ 16]用 2DPAGE、氨基酸测序
和免疫杂交法, 首次检测了臭氧对水稻幼苗蛋白的
影响。臭氧对水稻的影响表现在叶片强烈的可见坏
死伤害和随之而来的抗坏血酸过氧化物酶蛋白的增
加,反映在 2D电泳胶上蛋白质点分布的变化。检测
的 56 个蛋白中, 6个蛋白是 N端阻断, 14个蛋白的
序列无法测定, 36个蛋白的 N端序列和一个蛋白的
内部序列被测定。研究发现臭氧造成叶片光合蛋白
的剧烈减少 (包括核酮糖1, 5二磷酸羧化酶/加氧
酶)和各种防御、胁迫相关蛋白的诱导表达。
Shen( 2003) [ 17] 等应用蛋白质组学方法研究水
稻叶鞘伤害反应相关蛋白,首次揭示了水稻叶鞘伤
害信号应答过程中蛋白质的变化。比较伤害前后蛋
白质表达谱,发现伤害后至少有 10个蛋白被诱导或
上调, 19个蛋白被抑制或表达量下降。通过 N端或
内部氨基酸测序,分析了其中的 14个蛋白,鉴定了 9
个蛋白的功能, 其它蛋白由于 N端阻断, 无法得到
氨基酸序列信息。此外, 还通过 MALDIT OFMS
测定了 11种蛋白质,并与水稻数据库相吻合。在基
因功能被确认的蛋白质中,表达量下降的蛋白有 2
个钙网蛋白、组蛋白 H1、血红蛋白及一种假定的过
氧化物酶; 表达量增加的蛋白包括胰蛋白酶抑制因
子( BBT I)、两种蛋白激酶受体类似物、钙调素相关
蛋白、核酮糖1, 5二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基、2
个甘露糖结合外源凝集素。其中, 4种蛋白质已被证
实为与伤害反应直接作用的蛋白质。
3. 1. 3 水稻激素诱导蛋白质组学 植物体中,激素
起着重要的调控作用, 水稻的蛋白质组学研究可以
为研究激素的信号传导和作用机制打下基础。
Moons ( 1997)
[ 18] 等鉴定了水稻根中 3 个受
ABA 诱导的蛋白质, 其氨基酸序列测定确定其中 2
个属于胚胎后期丰富蛋白( LEA )的 2 组和 3 组, 第
三个未知。用 ABA 处理水稻根并提取 mRNA, 构
建 cDNA 文库,然后用由氨基酸序列推导出的寡核
苷酸做探针进行筛选,分离到了相关的 cDNA, 但在
cDNA 数据库中找不到与之相同的序列。通过在基
因组 DNA 文库中筛选及免疫杂交分析,表明这是一
个新的基因家族, 编码高度亲水具有双重结构域的
蛋白质,没有已知的蛋白质与之相同。利用 N端序
列制备的血清在叶子 cDNA 表达文库中筛选, 分离
到了新的具有典型硫氧还蛋白特征的 cDNA 序列,
并被硫氧还蛋白活性的生化实验所证实。
Rakw al和 Komatsu( 2000) [ 19] 用外源茉莉酸处
理水稻的幼苗组织, 通过 2DPAGE分析发现在水稻
的茎和叶中诱导了新蛋白质。对蛋白质点进行 N
端和内部测序及免疫杂交分析,发现茎中有 28kD蛋
白质( PR1)表达。免疫杂交分析表明茉莉酸处理后
这些蛋白质的表达具有组织特异性和发育阶段特异
性, 说明外源茉莉酸处理可以引起与植物自我防御
机制有关的基因在茎、叶组织中的特异性表达。
Shen 和 Komatsu ( 2003 ) [ 20] 将水稻叶鞘用
5umol/ L 赤霉素处理不同时间后的蛋白经 2D
PAGE分离和计算机图像分析, 检测到 33个蛋白发
生变化,其中 21个蛋白点表达增强, 12 个蛋白表达
减弱,说明赤霉素处理水稻叶鞘起码有 30多个基因
的产物与之相关。对其中的钙网蛋白( Calret iculin)
进行了深入分析, 发现它有 2个不同等电点( PI)蛋
白点,随赤霉素处理时间增加, P I4. 0 的蛋白点逐渐
消失而 PI4. 1蛋白点浓度则逐渐增加。由此说明钙
网蛋白是在赤霉素信号传递调节叶鞘伸长中的一个
重要组分。
3. 1. 4 水稻的突变体蛋白质组学研究 应用蛋白
质组学方法对基因突变引起的蛋白质表达变化进行
研究可以揭示植物生理生态过程, 得到植物遗传学
的重要数据,对表型突变的内在生化过程进行研究。
Komatsu( 1999a)
[ 21] 等比较了水稻绿苗和白化
苗的蛋白质 2DPAGE 图谱, 发现了在绿苗中参与
光合作用的蛋白质, 而白化苗中仅有此蛋白质前体。
而抗坏血酸过氧化物酶只在白化苗中存在,说明抗
氧化酶在白化苗中起细胞保护功能。
同年, Komatsu( 1999b) [ 22]对水稻悬浮培养细胞
4 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2005年第 6期
进行了蛋白组分析, 分析了细胞中 103个主要的蛋
白点,并测定了 20个蛋白的氨基酸序列, 分别用 N
端和中间氨基酸测序分析了 32 个蛋白。搜索已鉴
定蛋白的功能类别, 发现它们涉及水稻细胞悬浮培
养的生长发育。
3. 1. 5 水稻2DPAGE 与其它新技术联用的蛋白质
组学 Kim 等( 2001) [ 23] 在水稻叶片蛋白分析中使
用一种分级方法大大推动了此领域的研究。水稻叶
片高丰度的 RuBisCO限制了对其它低丰度蛋白的
研究。他们通过简单的抽提和 PEG 分级技术解决
了分析水稻叶片蛋白的缺点。这样就能够分析单步
2DE分离的 2. 7倍的蛋白,至少可以分析叶片的 2
600个良好分离的蛋白。PEG分级技术推动了复杂
组织蛋白组的分析。
Koller等( 2002) [ 24] 进行了系统的水稻组织蛋白
组学研究工作。水稻叶、根、种子的蛋白组经 2D
PAGE和 MudPIT (多向蛋白鉴定技术) , 检测到总
共 2 528个特异的蛋白( 6296个多肽)。其中 2 251
个蛋白是多肽与蛋白一对一对应的; 其它 277个蛋
白其多肽匹配多于一个蛋白而不能鉴定。已鉴定的
蛋白根据它们功能分为 16 组。最大组 ( 32. 8%)的
蛋白包括未鉴定功能的蛋白以及与数据库的蛋白低
或无同源性的蛋白; 其次是代谢相关蛋白 20. 8%,细
胞救助、防御、细胞死亡和老化 ( 6% ) , 蛋白合成
( 5% ) ,能量( 5% ) ,细胞组织( 5% ) , 反转座子和质粒
蛋白( 5% ) ,发育( 1% ) , 细胞内转运( 5% )等等。结
果显示大多数已鉴定的蛋白有组织特异性表达模
式;而 189个蛋白( 7. 5%)在 3个组织中均有表达。
同时代谢途径也显示组织特异表达。这些结果表明
多向蛋白组技术和定量方法的结合使得 mRNA 和
蛋白质表达数据整合, 并有助于理解植物的复杂代
谢网络。
Tanaka 等 ( 2004a) [ 25]通过 2DPA GE、Edman
测序、MS以及数据库搜索,构建了水稻叶鞘、根、悬
浮培养细胞的系统蛋白组。他们还研究了这些组织
中的赤霉素( GA )调控蛋白。鉴定的蛋白包括叶鞘
中 2D胶考马斯亮蓝染色检测的 431 个点中的 79
个,根 508个点中的 73 个, 悬浮培养细胞 962个点
中的 140个。通过蛋白数据构建并功能分类, 从数
据库中也鉴定了 GA 调控蛋白, 并发现在叶鞘、根、
悬浮培养细胞中分别有 8、20、15 个蛋白由 GA 调
节。以此构建的水稻组织蛋白组, 并能对 GA 引起
变化的蛋白快速评估。Komatsu 等( 2004) [ 26]建立
了水稻蛋白组数据库网站( http: / / g ene64. dna. af
f rc. go . jp/ RPD/ main. htm l) ,提供水稻 15个不同组
织器官的蛋白组学分析的大量信息。
3. 2 水稻器官蛋白组分析
水稻亚细胞组分分析提供了功能基因组学的有
用信息,包括基因组序列开放阅读框、亚细胞组分功
能蛋白的鉴定, 以及这些组分生物发生相关的新组
分的鉴定。目前, 各种水稻细胞器的蛋白组研究有
所进展。研究比较多的细胞器是叶绿体。据估计高
等植物大约共有约 21 000到 25 000个蛋白质,叶绿
体的蛋白质占其中 10% ~ 25%, 充分证明了叶绿体
在植物细胞中的重要性。另外, 关于线粒体与细胞
壁的研究以及水稻核蛋白的蛋白组学也有相关报
道[ 27]。
Tsug ita 等( 1994) [ 28] 首先对水稻叶绿体进行了
蛋白组分析。经 2D 胶分离检测出 276 蛋白点, 对
16个蛋白进行了 N端序列分析, 并对 13个蛋白测
序分析。这是首次对水稻叶绿体蛋白组分析的报
道,提供了水稻叶绿体蛋白的概况。
Mikami等( 2001) [ 29] 分离了水稻高尔基体。高
尔基体是水稻重要的多功能器官, 是重要生化过程
进行的场所, 特别是复杂细胞表层多聚糖的生物合
成以及糖蛋白加工修饰的场所。水稻中至少报道了
4种高尔基体组分。并通过植物凝集素和一些特异
抗体分析, 鉴定了水稻高尔基体组织特异性蛋白。
Mikami等( 2002) [ 30]用 2DE 技术来分离水稻细胞器
官的膜蛋白。Cy to so lic (胞质)和膜结合蛋白经 2D
PAGE和 NEPHGEPAGE(非平衡 PH 梯度)电泳
两种技术分离比较, 结果显示 NEPHGEPAGE 对
于水稻膜结合蛋白的蛋白组分析相当有效, 而 2D
PAGE对于水稻胞质成分的分辩率更高。
Heazlew ood( 2003)
[ 31] 等用 2DPA GE、Bluen
at ive PAGE 和反相高效液相质谱( LC/ MS)的方法
对纯化的水稻线粒体蛋白进行分离, 再用胰蛋白酶
消化,然后进行串联质谱分析( M S/ M S)。通过查找
水稻基因组的开放阅读框架译码和表达序列标签
( EST, Expr essing sequence tag s)译码,与质谱分析
52005年第 6期 魏敏等:水稻蛋白质组学研究进展
所得数据进行比对, 鉴定了其中 149个蛋白点( 91个
非冗余基因的产物) , 包括亲水/疏水蛋白、强酸/碱
性蛋白和大分子蛋白(分子量为 6. 7~ 2. 52kD)的序
列。确定了 85个蛋白的功能,包括线粒体的许多主
要的功能蛋白。
3. 3 水稻核蛋白组分析
Monow ar 等 ( 2004) [ 27] 通过 2DPAGE 分离核
蛋白,采用 ImageMaster 2D E lite 软件分析考马斯
亮蓝染色的 pH4~ 10的胶条, 有 549 个蛋白点, 挑
选 257个丰度较高蛋白点, 再 Edman 测序和 MS分
析。分离的蛋白电转移至 PVDF 膜上, 选择 100个
清晰可见的蛋白点进行 Edman 测序, 鉴定出 17个
N端氨基酸序列,剩下 83个蛋白 N端集团堆积,再
经多肽图谱分析鉴定了 22个蛋白的中间氨基酸序
列。在这鉴定的 39个蛋白里, 9个蛋白序列不能匹
配数据库的已知蛋白/基因。然后 178 个蛋白经
MALDITOFMASS系统分析, 鉴定了其中 160个
蛋白,其余的 18个与已有数据库的水稻蛋白/基因
没有同源性。详细的水稻核蛋白的数据提供在 ht
tp: / / gene64. dna. aff rc. g o. jp/ RPD/ main. html. 鉴
定的蛋白经功能分类, 190个蛋白中 29%属信号传
导和基因调控蛋白; 26%为未知功能,可能是水稻核
特异性蛋白; 10%为代谢相关蛋白,包括 RNA 和碳
代谢;其余还有管家功能蛋白包括细胞结构( 6%) ,
翻译( 11% ) , DNA 复制/修复/修饰( 2%) ;蛋白降解
( 6% )和蛋白折叠( 3% )。以及其它分类功能如防
御、产能、细胞死亡等等。
4 前景和展望
近年来,水稻蛋白质组学在蛋白鉴定和功能分
析方面有了巨大进展, 本文分类概述水稻蛋白组所
取得的主要成就。
蛋白质组学是一门新兴的学科, 目前仍然存在
着一些技术上的挑战:如蛋白质的动态分辨率问题、
蛋白质组的纯化技术、蛋白质组定量技术以及疏水
性膜蛋白的分离、显形及鉴定的问题等等。
蛋白质组学的规模和研究关注的焦点在不断改
变, 它从最初只是鉴定一个生物样品尽可能多的单
个蛋白已发展到用高通量、相关定量技术来分析蛋
白质组动力学, 同时需要发展生物计算机技术来整
合蛋白质组的巨大数据并用以描述复杂生物系统。
随着蛋白质组研究的深入,在阐明诸如生长、发育、
进化及代谢调控等生命活动的规律等方面会有重大
突破。可以预期, 所有的植物科学领域将得益于高
通量技术和生物信息学的发展, 朝着一个现代的植
物系统生物学发展。
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国外动态
美绘制出原鸡基因组图
AgBio tech Repo rter 2004年 21卷 4期 7页报道:美国圣路易斯市华盛顿大学医学院的科学家 Richard
Wilson及其同事, 已于最近绘制并发表了家鸡的祖先原鸡( Gallus g allus)的基因组图。这是迄今为止, 首次
发表的鸟类基因组图。 汪开治
112005年第 6期 吴利民等:植物锚蛋白研究进展