全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2006年第3期
生物发光现象普遍存于自然界中,多数发光生
物分布于海洋中,在陆地上也有少许存在。而在陆
地生物中,昆虫是主要的发光种类。
生物发光现象是发光体内产生生物化学反应
释放光子所形成的,它将化学能转化为光能。生物
发光反应是一种酶(荧光素酶)催化底物(荧光素)
的酶催化反应,一般需要氧气的参与。在发光反应
过程中会形成一种非常不稳定的中间物,中间物分
解后产生高能的激发态产物,当激发态返回到稳定
态时,释放能量,发出光子。
荧光素作为生物发光反应体系中的关键因子,
在生物发光现象中起着非常重要的作用,荧光素作
为释放光子的直接载体和能量的传递物质在荧光
素酶发光体系中发挥着作用。随着荧光素酶的应用
领域越来越广泛,荧光素的应用价值也备受关注。
1 荧光素的种类
目前,发光生物体内常见的荧光素主要有几大
类,分别为虫荧光素、细菌荧光素、腰鞭毛虫荧光
素、腔肠动物荧光素、Cypridina荧光素,每种荧光素
分别存在于不同种类生物体内。
目前对萤火虫(Coleoptera:Lampyridae)生物发
光体系的研究最多,也最为成熟。萤火虫的发光种
类主要有 Photinuspyralis、Luciolaminengrelica、Py-
rophorusplagiophthalamus等几种。
发光细菌主要是海生的 Vibriofischeri、Vibrio
harveyi和陆地生的 Photorhabdusluminescens,但是
在许多海洋鱼类的发光器官和某些陆地线虫中也
寄生着些许发光细菌。
腰鞭毛虫属于腰鞭毛目原生动物属,是一种海
生单细胞生物,因为在它体内含有有价值的生物活
荧光素及其合成的研究进展
黄乐天 1 蒋琳兰 2
(1华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510640;2广州军区广州总医院,广州 510010)
摘 要: 在生物发光体内,荧光素作为直接释放光子的物质和能量的传递物质在荧光素酶发光体系中发挥着不可
或缺的作用。现在已知的荧光素种类繁多,不同来源的荧光素在结构、性质与合成上大不相同,荧光素在生物体内的生成
问题是目前研究的焦点。为了更清楚的认识荧光素在体内的生物合成与起源问题,本文对几种主要荧光素的结构性质和
有关其生物合成研究的最新报道进行综述。
关键词: 荧光素 荧光素酶 生物合成
TheSynthesisandEvolutionofLuciferin
HuangLetian1JiangLinlan2
(1Colegeofbiologicalscienceandengineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510640;
2GeneralhospitalofGuangzhoumilitarydistrict,Guangzhou510010)
Abstract: Luciferin,asthelight-cariersubstanceortheenergy-transfersubstance,playsanindispensabilityroleon
theluminescentsystem ofluciferaseinthebiologyiluminant.Now theknownspeciesofluciferinwasvariety,which
hadlargediferencesonstructure、propertyandsynthesis.Atpresenttheresearchisfocusonthebiosynthesisofluciferin.
Inordertounderstandthebiosynthesisandoriginoftheluciferin,thepaperwilsummarizebothhistoricalandrecent
dataonthestructure、propertyandthebiosynthesisofthemainluciferin.
Keywords:Luciferin Luciferase Biosynthesis
收稿日期:2006-01-12
作者简介:黄乐天(1982-),男,在读研究生,研究方向:植物分子生物学,E-mail:hlt200360517@tom.com
2006年第3期 黄乐天等:荧光素及其合成的研究进展
性物质且与许多海洋现象有关,诸如红色潮汐、生
物发光、共生和鱼中毒等,所以在过去 30年其备受
关注。
腔肠动物荧光素广泛分布于海洋发光生物中,
如桡脚类的动物、鱿鱼、栉水母、放射虫、鱼、糖虾、
毛颚类动物等。腔肠动物荧光素已从海洋植物 Re-
nila和虾 Oplophorus中被分离出来。
Cypridina荧光素是从日本海岸发光介形亚纲动
物甲壳类 Cypridinahilgendorfi中分离出来的,在某
些发光鱼,如 Apogon,、Parapriacanthus和 Porichthys
中也发现它的存在。
2 荧光素的结构、性质与合成
虫荧光素、细菌荧光素、腰鞭毛虫荧光素、腔肠
动物荧光素、Cypridian荧光素等几种常见生物荧光
素在结构、性质与合成上各有很大的不同。因此,很
难从它们之间找出规律性和相关性来。
2.1 虫荧光素的性质、结构与合成
虫荧光素的结构由两部分组成,一部分是苯并
噻唑,另一部分是噻唑啉,化学名为 2-(6′-羟基-2′-
苯并噻唑)-2-二氢噻唑-4-羧酸。虫荧光素的化学结
构如图 1。
图 1虫荧光素的化学结构
虫荧光素在氧气、ATP、Mg2+存在的条件下,被
虫荧光素酶催化,经一系列的变化由还原型转化为
氧化型,并形成高能态中间物质,当中间激发态物
质返回到基态时释放出能量,产生荧光。
虫荧光素的化学合成是基于在有机体内的物
质,如甲虫类昆虫中的分泌物苯醌,和半胱氨酸反
应,产生虫荧光素中的 6-羟苯并噻唑成分,当再添
加半胱氨酸时便生成虫荧光素。化学方法合成的虫
荧光素具有与天然荧光素几乎一样的生物活性,
SY.Lee等[1]合成的 7’-[123I]碘-D-荧光素可用于荧光
素酶基因的体内表达研究。但是化学合成只说明在
生物体外的荧光素可能存在着的一种合成途径,并
不能说明在生物体内也存在着相同的合成途径。
对 Lampyridae甲虫荧光素的生物合成问题已经
有了深入的研究。根据虫荧光素的结构和化学合成
推测噻唑啉的前体可能是半胱氨酸,用同位素示踪
法证实了这一猜测[2]。可是苯并噻唑的结构起源就
不是很清楚,半胱氨酸也有可能是它的组成部分。
Okada等 [2]通过注射 14C-氧化型的荧光素和
14C-2-蓝-6-羟基苯并噻唑到萤火虫细胞内,几小时
后检测到了 14C-还原型荧光素。结果发现还原型荧
光素的苯并噻唑结构来源于氧化型荧光素,并且证
实添加半胱氨酸可以促进荧光素的生成,故他们提
出假设:发光产物氧化型荧光素,可以被再度循环
到底物荧光素。
K.Gomi等[3]从 Photinuspyralis中发现了一种
纯化蛋白,它能够强化从氧化型荧光素到还原型荧
光素的再生能力,它在氧化型荧光素到还原型荧光
素间的循环中起着非常重要的作用,为 Okada等人
的假设提供了直接有利的证据。他们将该蛋白称之
为荧光素转化酶(LRE),当添加该酶到有机体内时,
发光反应会变得更强、更持久。K.Gomi[4]等接着又
从萤火虫 Luciolacruciata和 Luciolalateralis中通过
反转录法克隆出了该两种萤火虫编码 LRE的两个
cDNAs。
在生物发光反应中,萤火虫的 D型-荧光素是
发光反应的专一底物,而它的对映体 L型-荧光素
是荧光素酶的抑制剂,阻碍 D型-荧光素参与发光
反应。M.Nakamura等[5]报道在荧光素酶发光体系中
添加乙酰辅酶 A时,L型-荧光素能够转化为 D型-
荧光素。通过这种方法,萤火虫发光体系可利用 L
型-荧光素作为发光的底物。
2.2 细菌荧光素的结构、性质与合成
细菌荧光素就是核黄素单核苷酸(FMNH2),它
是黄素的衍生物。细菌荧光素的化学结构如图 2。
图 2细菌荧光素的化学结构
细菌荧光素参与的发光反应过程:还原型黄素
(FMNH2)结合荧光素酶,再与氧气作用生成一个中
间态过氧化物,该中间态过氧化物与长链脂肪醛进
行作用,形成激发态的中间物质,激发态返回到基
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
态时释放能量,发出蓝绿光,并同时生成氧化型的
黄素酸(FMN)产物[6]。FMNH2的侧链磷酸根离子对
生物发光活性的影响很大。FMNH2的磷酸基团是与
细菌荧光素酶 a单元结构中的保守残基 Arg-107连
接的,基于与磷酸基团的相互作用,Arg-107能够降
低荧光素酶在高磷酸浓度下的蛋白水解[7]。
在发光细菌中,FMNH2由氧化还原酶 FMN:
NAD(P)H催化生成,该酶以消耗 NAD(P)H进行
FMN的催化还原[8]。在氧化还原酶与荧光素酶的联
合反应中,反应发光量与一定浓度条件下的 NAD(P)
H浓度成比率关系。
2.3 腰鞭毛虫荧光素的结构、性质与合成
腰鞭毛虫发光来自体内一个称作闪光镜的新
型亚细胞器,直径约 0.4微米,其内含有荧光素酶和
腰鞭毛虫荧光素(其与另外一种蛋白相联),可以通
过它们自身产生的荧光而被检测出来。腰鞭毛虫的
生物发光是典型的荧光素-荧光素酶生物发光反应,
荧光素不仅能与不同种属的腰鞭毛虫作用,而且也
能与磷虾体内的发光蛋白进行作用。
腰鞭毛虫荧光素的分子结构,以 Pyrocystis
lunula种类为例,是线性四吡咯结构,它与叶绿素 a
的结构非常相似,与磷虾荧光素也只是一个残基的
区别,化学结构式如图 3。有趣的是,腰鞭毛虫荧光
素与叶绿素 a在四吡咯 D环 C-17和 C-18的空间
构造上是完全一样的。研究指出,一个光氧化反应
能将某种叶绿素 a衍生物中的 C-1和 C-20连接起
来,这一实验结果显示腰鞭毛虫荧光素有可能是腰
鞭毛虫体内叶绿素的降解产物[9]。
腰鞭毛虫荧光素 叶绿素 a
图 3 腰鞭毛虫荧光素与叶绿素 a的化学结构
C.Wu等[10]在研究腰鞭毛虫荧光素的生物合成
时,用含有 15N的甘氨酸和 15N的谷氨酸的培养基
来培养腰鞭毛虫 Pyrocystislunula,通过质谱法检测
到腰鞭毛虫荧光素的四吡咯环结构中含有 15N的
甘氨酸和 15N的谷氨酸,而且,同时在叶绿素 a结
构中也同样检测出了 15N的甘氨酸和 15N的谷氨
酸,这一结果说明在腰鞭毛虫 P.lunula中荧光素与
叶绿素 a可能都是以甘氨酸或谷氨酸为最初的组
成成分。通过比较腰鞭毛虫荧光素和叶绿素 a的化
学结构,推测叶绿素 a可能为腰鞭毛虫荧光素的前
体物质。
2.4 腔肠动物荧光素的结构、性质与合成
腔肠动物荧光素是一个分子量较小的有机化
合物(MW=423),结构主体为咪唑吡嗪结构。它不溶
于水,但使用环式糊精可改善它的溶解性。腔肠动
物荧光素的化学结构如图 4。
图4 腔肠动物的化学结构
腔肠动物荧光素为多种荧光素酶催化反应的
底 物 , 这 些 荧 光 素 酶 包 括 Renila荧 光 素 酶 、
Oplophorus荧光素酶、Periphyla荧光素酶和 Gaussia
荧光素酶等;而且,腔肠动物荧光素也是水母发光
蛋白质的组成部分,被看作是水母中的荧光素[11]。含
有腔肠动物荧光素的生物发光多数为典型的荧光
素-荧光素酶发光反应体系。
腔肠动物荧光素可用化学方法合成,目前化学
合成方法有两种途径:一是 Kishi的典型合成途径
[12],另一种是使用有机金属化学的新型合成途径[13]。
腔肠动物荧光素的典型合成途径是从 Cypridina荧
光素的合成中发展得来的,首先是生成氨基吡嗪,
然后添加 a-酮酸与氨基吡嗪反应生成咪唑环。典型
合成方法在使用时存在着许多的问题,如产率低,
小于 1%,没有操作灵活性等[14]。新型的合成途径可
克服上述问题,它能够更容易的合成腔肠动物荧光
素及它的相似物,产率可达到 25%[13]。
对腔肠动物荧光素的仿生物合成方法早在 30
年以前就已经提出来了,但是到目前为止仍然处于
摸索状态中,对荧光素相似物的仿生物合成其结果
仍然不是很理想[15]。
2.5 Cypridina荧光素的结构、性质与合成
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2006年第3期 黄乐天等:荧光素及其合成的研究进展
在海洋发光生物体内,Cypridina荧光素与腔肠
动物荧光素具有相同的咪唑吡嗪结构。Cypridina荧
光素的化学结构如图 5。
图5 Cypridian荧光素的化学结构
Cypridina荧光素是发光介形亚纲动物 Cypridina
hilgendorfi的生物发光反应的底物。Cypridina荧光
素的分离、结构确定和化学合成的工作都已经完
成。根据 Cypridina荧光素的化学结构推测它的生物
合成是由三种氨基酸:L-精氨酸、L-异亮氨酸和 L-
色氨酸或它们的等价物合成的。S.kato等[16]通过用
同位素标记的上述三种氨基酸来培养 Cypridina,利
用 LC/ESI-TOF-MS分析方法检测到了 Cypridina荧
光素中含有带同位素标记的氨基酸,此结果说明上
述三种氨基酸可能是 Cypridina荧光素的结构单元。
C.Wu等[17]报道了(S)-Cypridina荧光素及其类
似物的合成与发光活性情况。通过将(S)-1,1-二乙氧
基-3-甲基戊醛与乙硫荧光素浓缩反应合成(S)-
Cypridina荧光素,在 Cypridina荧光素酶存在的条件
下,合成的(S)-Cypridina荧光素产生的发光强度是
外消旋型荧光素的 1.7倍,并且,(S)-Cypridina荧光
素的类似物在 Cypridina荧光素酶条件下也表现出
适当的发光活性。
3 荧光素生物合成的应用前景展望
荧光素酶发光体系作为一种分析检测方法应用
在多个领域中,如基础生命科学研究、快速检测、环
境监测、临床医学等。通常,在进行活体成像时,先将
荧光素酶基因克隆到宿主细胞中使其得到表达,检
测时再向细胞内注入荧光素,发生荧光素-荧光素酶
反应,产生荧光,进行成像。可是,此操作方法有点繁
杂,需要外界注入荧光素,而且这样发出的荧光也达
不到完全意义上的适时效果。因此,假如能对荧光素
的性质和生物合成途径有了更进一步的认识,知道
了荧光素合成过程中所需要的各种生物酶,并且将
这些酶的基因克隆出来,让宿主细胞自身合成荧光
素,重组细胞也将成为真正意义上的生物发光体,
就不需要从外界注入荧光素。到那时生物发光作为
一种检测手段,它的应用价值将会非常巨大[18]。
虽然目前对荧光素酶的性质与合成有了比较
深入、全面的认识,但是,对荧光素合成的认识还是
显得相对滞后。当前只是了解细菌荧光素的生物合
成机制,对萤火虫荧光素的生物合成情况了解得非
常少,需要进一步的探索与研究。
参 考 文 献
1 LeeXY,etal.Bioorganic&MedicinalChemistryLet,2004,14:
1161～1163.
2 OkadaK,IioH,KubotaL,GotoT.TetrahedronLet,1974,15:
2771～2774.
3 GomiK,KajiyamaN.JBiolChem,2001,276:36508～36513.
4 GomiK,etal.Gene,2002,294:157～166.
5 NakamuraM,etal.Tetrohedronlet,2006,47.
6 HastingsJW.Gene,1996,173:5～11.
7 MooreC,LeiB,TuSC.ArchivesofBiochemistryandBiophysics,
1999,370:45～50.
8 ZennoS,SaigoK,KanohH,InouyeS.JBacteriol,1994,176(12):
3536～3543.
9 TopalovG,KishiY.Angew,Chem,IntEd,2001,40:3892～3894.
10 WuC,HidetoshiA,YoshihiroO.Tetrahedronleters,2003,44:1263～
1266.
11 HeadJF,InouyeS,TeranishiK,ShimomuraO.Nature,2000,405:
372～376.
12 KishiY,etal.TetrahedronLet,1966,7(29):3437～3444.
13 KeenanM,JonesK,HibbertF.JChemSoc,ChemCommun,1997,3:
323～324.
14 Gonzalez-TruebaG,ParadisiC,ZoratiM.AnalBiochem,1996,240
(2):308～310.
15 DevilersI,etal.TetrahedronLeters,2002,43:3161～3164.
16 KatoS,etal.Tetrahedron,2004,60:11427～11434.
17 WuC,etal.TetrohedronLet,2006,47:753～756.
18 DayJC,etal.Luminescence,2004,19:8～20.
41