全 文 ：ISSN 0582-9879
生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报
ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYS ICA SINICA 2001 , 33(1):59-64 CN 31-1300/Q
蓖麻蚕 rRNA基因中 SAR对真核基因表达的调控
吴震宇　赵慕钧＊　李载平
(中国科学院上海生物化学研究所;中国科学院上海细胞生物学研究所分子细胞生物学开放研究实验室 , 上海 200031)
摘要　　蓖麻蚕核糖体 RNA 基因非转录间隔区(NTS)有一长约 1 kb 的核骨架结合区(scaffold-associated region ,
SAR)。将这一序列克隆到含荧光素酶(luciferase)报告基因的真核表达载体 pLu 中 , 在阳离子脂质体的介导下对
NIH3T3细胞进行瞬时转染(transient transfection)及稳定转化(stable transformed)株的筛选 , 然后检测 SAR在瞬时
转染及稳定整合条件下对荧光素酶报告基因表达活性的影响。实验结果表明 , 在稳定转化的细胞中 , 该 SAR 对
luciferase 基因的表达有明显的激活作用 , 增强基因表达活性约 15 倍;而在瞬时表达的条件下 , SAR激活基因表达
的作用不明显。说明 SAR增强基因的表达可能需要整合在染色体上才能完成。我们用 Southw estern 印迹法实验进
一步证实了蓖麻蚕 rRNA基因的 SAR能特异性地与 NIH3T3 细胞核骨架蛋白结合 , 因此该 SAR的作用具有非组
织特异性。
关键词　　蓖麻蚕;核糖体 RNA 基因;SAR元件;荧光素酶基因;Southwestern 印迹法
收稿日期:2000-06-23　　接收日期:2000-08-07
国家重点基础研究发展规划(973)资助项目(No.G1999053902)
和国家自然科学基金资助项目(No.39770416)
＊联系人:Tel , 021-64374430-295;Fax , 021-64338357;e-
mail , mjzhao@sunm.shcnc.ac.cn
　　核骨架结合区(scaf fold-associated regions ,
SAR)又称核基质结合区(matrix-at tachment re-
gions , MAR), 是指染色体上能专一性地与核骨架
结合的DNA片段 , 该区域为AT 丰富区 , 通常含拓
扑异构酶 II 保守序列[ 1] 。SAR与核骨架蛋白的相
互作用会影响染色质环的形成 , 并影响 DNA 的复
制及基因的转录调控[ 2] 。我们实验室曾在蓖麻蚕核
糖体 RNA基因的 5′上游非转录间隔区检测到一个
SAR元件 , 该 SAR长约 1 kb , AT 富集>70%[ 3] ,
并具有酵母自主复制序列(ARS)的自主复制功能 ,
能驱动质粒在酵母中的复制[ 4] 。已有文献报道 SAR
不但能启动 DNA 复制 , 并能增强启动子的活性 ,
从而提高基因的表达 。例如人 β-干扰素基因的
MAR能增强 SV40启动子的活力[ 5] , 鸡溶菌酶基
因MAR增强基因表达是非位置依赖性的[ 6] 。最近
又发现 p53 抑癌基因突变产生的蛋白质可以与
MAR结合 , 促进肿瘤更快向恶性发展[ 7 ,8] 。因此 ,
SAR/MAR在真核基因的表达调控中有重要作用 ,
并与细胞的生长 、发育 、分化及癌变有关 。然而 ,
SAR的作用机制还不清楚 , 由于目前被鉴定的
SAR/MAR数目不多 , SA R/MAR序列特征和作用
方式似乎与其他 cis-DNA 元件如启动子 、增强子不
同 , 因此 , 进一步检测 SAR/MAR的功能和功能元
件对探讨SAR/MAR的作用机制是十分必要的 。我
们建立了以荧光素酶基因作为报告基因的转录调控
检测系统 , 发现了蓖麻蚕 SAR在真核基因转录过
程中的增强作用和作用方式 。另外 , 我们用低盐法
去除细胞核中的可溶性组蛋白 , 抽提得到核骨架 ,
通过 Southwestern 印迹法实验证实了该 SAR能特
异性地与 NIH3T3细胞核骨架蛋白结合 , 这为进一
步分析 SAR的分子作用机制和生物学功能打下一
定基础 。
1　材料和方法(Materials and Methods)
1.1　材料
含有蓖麻蚕 rRNA基因 SAR的约 1 kb 片段的
质粒 pHE1B由本室构建 。含荧光素酶报告基因的
质粒 pLu和 pAGLu由美国 Kohw i-Shigematsu T .教
授惠赠。含有 β-gal基因的质粒 pCH110 , 作为内参
照 , 购自 Amersham Pharmacia 公司。细胞培养基
DMEM 和转染用脂质体 LipofectAM INE 试剂购自
Gibco-BRL 公司。G418 、LIS 购自 Sigma 公司。Lu-
ciferase assay system 试剂盒购自 Promega公司。
1.2　方法
1.2.1　质粒 pLuSAR和pAGLu的构建及鉴定　　
用 BamHI 将 pHE1B 质粒中的 SAR 切下 , 通过
BamHI位点克隆到 pLu质粒中 , 得到含 SAR片段
的重组质粒 pLuSAR;pAGLu 为 pLu 质粒在
BamHI和 Sal I 位点之间插入 175 bp 的(TCTT-
TAAT TTCTAATATATT TAGAA)7 片段 , 作为阳
性对照。
1.2.2　稳定转化实验　　分别取质粒 1.5 μg/孔 ,
LipofectAM INE 试剂各6 μl/孔 , 按 LipofectAM IN E
操作手册转化生长旺盛的 N IH3T3细胞 , 转化在六
孔板中进行 , 转化细胞数约为 3×105/孔 , 在转化
48 h 后按 1∶10 接种同时用含 0.7 g/L G418 的
DMEM 培养基(含 10%小牛血清)进行持续筛选 ,
约10 ～ 15天后有转化之阳性克隆形成 , 收集各孔
之阳 性 克 隆 , 获 得 pLu-3T3 、 pAGLu-3T3 及
pLuSAR-3T3 稳定转化细胞株 。为鉴定质粒 DNA
的整合 , 我们用常规方法提取各种细胞的基因组
DNA , 用 PCR检测标记基因 neoR的存在。neoR 基
因引物为 , 5′引物:5′-CAAGATGGATTGCACGC-
AGG-3′, 3′引 物:5′-CCCGCTCAGAAGAACT-
CGTC-3′(由上海生工生物工程技术公司合成)。
PCR条件为:94 ℃45 s , 55 ℃45 s , 72 ℃90 s , 30
个循环 , 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。荧光素酶基因
活性检测:取各种细胞 5×105 , 接种于 60 mm 平
皿 , 37 ℃5%CO2培养 24 h , 吸去培养基 , 细胞用
PBS淋洗 3遍 , 加细胞裂解液 0.4 ml(由 luciferase
assay system , LAS , 试剂盒提供), 室温放置 5 min
后用细胞刮匙收集细胞裂解液 , Votex 上混匀 1
min , 短时高速离心后取适量裂解液上清 , 按 LAS
操作说明 , 在 EG&G Berthold公司的 LB9507荧光
计数仪上测定细胞裂解液的相对荧光强度以检测荧
光素酶基因的活性。
1.2.3　瞬时表达实验　　分别取受检质粒 1.5μg/
孔 , LipofectAM INE 试 剂 各 6 μl/孔 , 0.5 μg
pCH110质粒/孔作为内参进行共转染 , 转染在六孔
板中进行 , 转染细胞数约为 5×105/孔 , 转染 24 h
后收集细胞裂解液进行荧光素酶活力的测定 , 测定
方法按 LAS 试剂盒进行;同时测定每孔细胞裂解
液的 β-gal活力 , 用于标化测定的荧光素酶活性。
1.2.4　SAR与细胞核骨架的特异结合(Southw est-
ern印迹法)　　收集生长旺盛的 NIH3T3 细胞 ,
PBS洗 3遍 , 用改进的 Mirkovitch 方法[ 9]进行细胞
核骨架的抽提。细胞核的分离缓冲液为:3.75
mmol/L Tris-HCl pH 7.4 , 0.05 mmol/L 精胺 ,
0.125 mmol/L 亚精胺 , 0.5 mmol/L EDTA pH
7.4 , 20 mmol/L KCl , 0.1 mmol/L PMSF;抽提核
骨架蛋白的二碘水杨酸锂(lithium3′, 5′-diiodosali-
cylate , LIS)低盐缓冲液为:5 mmol/L Tris-HCl pH
6.8 , 0.25 mmol/ L 亚精胺 , 2 mmol/ L EDTA pH
7.4 , 2 mmol/ L KCl , 0.1%毛地黄皂苷(digitonin),
25 mmol/L LIS。制备的细胞核骨架及其他细胞组
分走 10%SDS-PAGE 电泳 , 按常规方法[ 10]将其转
印到硝酸纤维素膜上 , 丽春红染色检验转印效果。
膜用封闭液(10 mmol/ L Tris-HCl pH 6.8 , 50
mmol/L NaCl , 2 mmol/L EDTA , 1 mmol/L DT T ,
2 mmol/L PMSF , 15%甘油 , 0.5%BSA)封闭1 h ,
加入32P 标记的蓖麻蚕 rRNA 基因 SAR片段探针杂
交 , 室温反应 3 h , 洗膜 、干燥 、放射自显影 。探针标
记 , 通过切口平移方法用[α-32P] dATP进行标记。
2　结果(Results)
2.1　SAR表达载体 pLuSAR质粒的构建及酶切鉴
定
从质粒 pHE1B中分离蓖麻蚕 rRNA 基因非间
隔区的 HpaI I ～ EcoRI 酶切片段(965 bp)通过
BamHI酶切位点克隆到表达载体 pLu中 , 插入位
置邻近 SV40 启动子的 5′末端 , 构建成 pLuSAR。
蓖麻蚕 rRNA 基因 SAR的结构示意及 pLuSAR质
粒的构建如图 1。pLu载体大小约为 8.1 kb , 含有
荧光素酶报告基因(Luc), 其 5′上游有约 400 bp的
SV40启动子区 , 在实验中作为对照;pAG Lu载体
是 pLu在 SV40启动子上游插入了 175 bp的人工
合成的 SAR序列 , 在实验中作为阳性对照 。各质粒
的酶切鉴定结果如图 2 所示 , pLuSAR 经 BamHI
酶切 , 插入片段约 965 bp(图 2 , line 3), pAGLu阳
性对照质粒 , 插入片段为 175 bp(图 2 , line 2), 插
入片段大小正确。另外 , 我们还对插入片段的方向
作了鉴定 , 确定所有片段均为正向插入 。
2.2　SAR稳定转化细胞株的鉴定
有文献报道 SAR/MAR增强基因的表达需要
将其整合到染色体上 , 为此 , 我们分别将 pLu 、
pAGLu 、pLuSAR 质粒转化 NIH3T3 细胞 , 在 0.7
g/L G418 培养条件下 , 筛选具 G418 抗性的细胞
株 。所获稳定转化细胞株分别用 neo 基因引物 ,
PCR扩增转化细胞基因组上整合的 neo 基因进行
验证 。PCR实验结果证明质粒 DNA 已整合到细胞
基因组 DNA上(图 3)。
2.3　SAR增强基因的表达
本文利用荧光素酶基因作为报告基因 , 构建
pLuSAR重组表达载体 , 转化 NIH3T3细胞后 , 经
60 　　　ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SIN ICA Vol.33 , No.1
Fig.1　The construction of expression vector of pLuSAR
(A)The physical map of rRNA gene.NTS , non-t ranscribed spac-
er;ETS , external t ranscribed spacer.S , SacII;E , EcoRI;B ,
Bgl II;H , Hpa II.(B)The const ruction of pLuSAR exp ression
vector.
Fig.2 　 The restriction enzyme digestion showed that the
pLuSAR construct contained correct size of SAR
M , DL2000 molecular w eight marker;1 , pLu w as digested with
BamHI;2 , pAGLu w as digested wi th BamHI and Sal I;3 , pLuSAR
w as digested w ith BamH I.
Fig.3　Detemination of stable transformed cells by PCR am-
plifying the neoR gene on genomic DNA
M , DL2000 molecular weigh t marker;1 , negative cont rol;2—4 , PCR
products of pLu-3T3 , pAG Lu-3T3 , pLuSAR-3T3.
Fig.4　Transcription-enhancing activity of
SAR in stable transformed cells was deter-
mined by luciferase activity assay
The value of relative fluorescence strength i s de-
pending on the pLu(SV40)act ivi ty w hich counts
is referred as strength of one.The data were de-
rived f rom the average of three independent experi-
ments w ith SD.
测定荧光素酶(luciferase)的活性 , 来检测 SAR对基
因表达的调控作用 。测定结果如图 4所示 , 在稳定
转化株中 pAGLu-3T3 细胞裂解液的相对荧光强度
比 pLu-3T3细胞大近六倍 , 与文献报道相似[ 5] , 而
pLuSAR-3T3其相对荧光强度则增强了近十五倍 ,
增幅明显;而在瞬时转染中 , pAGLu及 pLuSAR的
导入似乎对荧光素酶的作用不明显 , 从测定值上
看 , 甚至有所下降(图5)。例如 pLu测定值为 1 , 而
pAGLu仅为 0.3 ～ 0.4 , pLuSAR为 0.6 ～ 0.9。测
定结果表明蓖麻蚕 rRNA基因的 SAR能增强基因
的表达 , 并具有很强的活力 , 但需要整合到基因组
上才能行使功能。
2.4　SAR与 NIH3T3细胞核骨架的特异结合
我们实验室建立了用二碘水杨酸锂盐分离提取
细胞核骨架的方法[ 3] ,能有效地去除细胞核中大部
61Jan., 2001 吴震宇等:蓖麻蚕 rRNA 基因中 SAR对真核基因表达的调控
Fig.5 　The relative fluorescence activity showed that there
were no enhancing activity of SAR detectable in transient
transfected cells
The results were normalized by β-gal activity and the data w ere derived
f rom the average of th ree independent experiments wi th SD.
Fig.6 　 The Southwestern blotting result showed that SAR
could bind specifically to nuclear scaffold of 3T3 cells
Left , Southw estern experiment;Righ t , 10% SDS-PAGE.M , The
p rotein marker;S , P , the supernatant of protein fraction(S)and pellet
of nuclear matrix(P)after treated w ith LIS;T , total nuclear protein.
分游离的组蛋白和非组蛋白 , 再利用 DNase I 消
化 , 即可离心沉淀获得核骨架蛋白 。将分离制备的
细胞总蛋白(T), 核骨架蛋白(P), 可溶性蛋白即上
清部分(S)分别走 10%SDS-PAGE 电泳后 ,转移至
硝酸纤维素膜上 , 与 SAR探针杂交 , 即 Southw est-
ern印迹法实验 , 用于检测 SAR与核骨架蛋白的结
合。图 6 显示了蓖麻蚕 rRNA 基因的 SAR 能与
N IH3T3细胞的核骨架蛋白特异结合 , SAR与核骨
架组分(P)有特异的杂交带出现 , 而在游离的上清
部分(S)没有杂交带出现。
3　讨论(Discussion)
SAR/MAR可能具有多种生物学功能 , 如通过
与细胞核骨架蛋白相互作用来限定染色体 DNA 的
环状结构域 , 使之成为相对独立的结构和功能单
位 , 并能控制环区内基因的活性[ 1] 。SAR/MAR可
以作为 DNA 复制的起点[ 4] 、作为基因的增强子元
件等[ 5] , 其中对基因转录的调控作用比较引人关
注 。在我们的研究中发现 , 蓖麻蚕核糖体 RNA 基
因的 SAR对下游报告基因有明显的增强转录的功
能 , 该 SAR增强下游 Luc基因的表达达 15倍之多
(图 4), 是一个很强的调控元件。作为阳性对照的
pAGLu增强转录约 5 ～ 6倍(图 4), 与 Bode等报告
的 pAGLu增强转录 6 倍的实验结果相符[ 5] , 证明
了本文测定结果的可比性 。本文报道的蓖麻蚕
rRNA基因 SAR , 在鼠的成纤维细胞 NIH3T3中仍
具有增强基因表达的活性 , 是一个具有非组织特异
性的增强元件 , 因此 , 具有一定的应用前景 。
SAR/MAR的作用方式可能是多种多样的。大
部分报道认为SAR/MAR能增强基因表达 , 例如鸡
溶菌酶基因的 SAR构建到报告基因的侧翼后 , 使
基因表达的效率提高了近十倍 , 并发现其作用方式
是位置和拷贝不依赖的[ 6] 。免疫球蛋白 μ基因的
MAR增强基因表达是由增强子(enhancer)介导
的[ 11] 。人的 β干扰素基因 SAR能增强各种启动子
的活性[ 12] 。Kohwi-Shigematsu 等的研究发现一种
蛋白质因子 SATB1通过与MAR的相互作用 , 可以
抑制 MAR偶联的报告基因的表达[ 13] 。我们将蓖麻
蚕 rRNA基因的 SAR构建在 SV40启动子的上游 ,
使 Luc 报告基因的活力提高了近 15 倍 , 说明该
SAR能增强异源启动子的活力 。我们用蓖麻蚕
rRNA基因的 SAR作为探针与鼠的 NIH3T3 细胞
核骨架蛋白进行蛋白质-DNA 的结合试验(South-
western印迹法), 发现该 SAR与核骨架组分中的
一些蛋白质能特异结合 , 而这种结合在上清(含细
胞大部分可溶性蛋白质)中并没有观察到。可见 ,
蓖麻蚕的 SAR和小鼠 NIH3T3细胞的核骨架之间
可以相互作用 , 我们以前的实验也曾证明蓖麻蚕的
SAR能与酵母细胞核骨架蛋白特异结合[ 4] 。所以蓖
麻蚕 SAR与细胞核骨架的亲和力具有非种属特异
性 。
已有文献报道 SAR/MAR对转录的增强作用
需要整合在染色体上才能有效地表现出来 , 例如人
的 β-干扰素基因的 SAR能增强各种启动子的活力
约 20 ～ 30倍 , 但这种增强作用仅仅发生在基因稳
定表达细胞株中 , 在瞬时表达条件下无作用 , 甚至
会使表达活性调低[ 12] 。SAR在植物细胞中对基因
表达的增强作用也有类似情况。SAR需整合到基因
组上 , 才能增强基因的表达并可达 12 倍之多[ 14] 。
在我们的实验中 , SAR增强基因的表达活性约 15
倍 , 但必须在稳定表达情况下 , 即SAR整合到染色
62 　　　ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SIN ICA Vol.33 , No.1
体上。因为在瞬时表达的条件下 , SAR 无增强作
用 , 甚至使表达水平降低 , 这与文献报道的情况一
致[ 13 , 14] 。SAR是染色质水平的调控元件 , SAR整
合在染色体上 , 能包装成真正意义上的染色质结
构 , 并随细胞分裂而传递到子代细胞中去 。SAR能
调节染色质开放(chromatin opening), 使转录激活
因子易于结合到模板的启动子区域 , 从而增强转
录。因此 , SAR在稳定转化条件下 , 对基因表达的
增强作用 , 可能是 SAR的一种重要作用机制。
随着分子生物学技术的发展 , 转基因技术得到
了广泛的应用 , 但有时外源基因导入后基因表达活
性很低 , 甚至没有活性 , 表现为基因“沉默” 。有人
尝试将 SAR构建到处于沉默状态的基因侧翼 , 发
现SAR能提高该基因的表达量达十倍以上 , 且同
源SAR比异源 SAR具有更强的活力[ 15] 。在转基因
实验中应用 SAR元件 , 可能是消除基因沉默现象
的一个有效手段 。
越来越多的实验证明 , SAR/MAR在 DNA 复
制和基因表达调控中起重要作用。但 SAR/MAR的
作用机制仍不十分清楚 , 有待于进一步的研究和探
索。
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63Jan., 2001 吴震宇等:蓖麻蚕 rRNA 基因中 SAR对真核基因表达的调控
Regulation of Gene Expression by SAR of Silkworm
Attacus ricini rRNA Gene
WU Zhen-Yu , ZHAO Mu-Jun＊, LI Zai-Ping(Shanghai Inst itute of Biochemistr y , the Chinese Academy of Sciences;the Open Lab of Molecu lar Cell Biology ,
the Chinese Academy of S ciences , Shanghai 200031 , China)
Abstract　　The 1 kb scaf fold-at tachment region(SAR)at 5′non-transcription region of rRNA gene of silk-
worm Attacus ricini was cloned into eukaryotic expression vecto r pLu , which contained luciferase report gene
and neoR select ing marker.After transfection of const ructs into NIH3T3 cell line by using cation liposome , the
luciferase activi ty w as monitored to check the SAR s function.The results demonst rated that the SAR could en-
hance gene expression up to 15-fold in stable t ransfo rmed cells , but no obvious gene expression was observed in
transient transfection.It s ef fect on gene expression appeared to require chromosomal integ ration.Southwestern
blo tting experiments show ed that SAR specifically bound to nuclear matrix proteins of NIH3T3 cells.The bind-
ing w ith nuclear matrix may be necessary fo r SAR function of transcriptional enhancement.
Key words　　silkw orm Attacus ricini ;rRNA gene;SA R;luciferase gene;Southwestern blot ting
Received:June 23 , 2000　　Accepted:August 7 , 2000
This w ork w ere supported by the special Funds for Major State Basic Research of China(No.G1999053902)and a grant f rom the Nat ional Natu-
ral Foundat ion of China(No.39770416)＊C orresponding author:Tel, 86-21-64374430-295;Fax , 86-21-64338357;e-mail , mjzhao@sunm.shcnc.ac.cn
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(侯向宇)
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