全 文 ：收稿日期:2006-04-03
基金项目:国家自然科学基金资助(项目批准号:30470927)
＊通讯作者.E-mail:yangyi528@vip.sina.com
文章编号:　0490-6756(2006)06-1394-05
Fibrillin操纵子在甘蓝型油菜和
拟南芥中的瞬时表达
滕　蕾 ,黄　瑾 ,赵竹露 ,李旭锋 ,杨　毅＊
(四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都 610064)
摘要:将 Fibrillin操纵子驱动的荧光素酶报告基因表达载体导入拟南芥原生质体中 ,研究基因
表达调控 ,证明脱落酸(ABA)诱导报告基因的表达.同时将相同的质粒转化到甘蓝型油菜蜀杂
9号原生质体中 ,获得与拟南芥中类似的表达结果.实验结果说明 Fibrillin操纵子在拟南芥和
油菜原生质体中均对ABA的诱导敏感.
关键词:Fibrillin启动子;荧光素酶;PEG介导的转化;瞬时表达;脱落酸
中图分类号:Q78　　　文献标识码:A
在高等植物中广泛存在一类由核基因编码 , 与质体有关的脂连接蛋白质 , 分子量约为 32kD.
Deruere[ 1]等首先在胡椒果实的有色体中鉴定出该类蛋白 ,发现它与有色体中类胡萝卜素的均分以及原纤
维素 fibril的结构组装有关 ,因此命名为 Fibrillin.在其他高等植物的有色体和叶绿体中发现了该类蛋白的
同源物[ 2-6] ,如黄瓜花冠中的CHRC(chromoplast-specific carorenoid-associated protein),马铃薯叶子中的叶
绿体蛋白 CDSP34(chloroplat drought stress protein , 34kD),甘蓝型油菜中的 PAP(plastid associated-pro-
tein),温州蜜柑的 CitPAP ,菜豆中的 PG.此外 ,在拟南芥和玉米中也发现了 Fibrillin 基因(GeneBank
AL021712 , AF075598 , AC005314 , AA979828).
研究证明在损伤 、干旱 、寒冷及强光条件下 , Fibrillin在 RNA 水平和蛋白质水平大量累积[ 7-10] .说明
它可能在植物对外界环境的适应中起着重要的作用.现已在拟南芥中发现 Fibrillin是 ABI2(ABA insensi-
tive)相互作用蛋白质 ,其合成也依赖于ABI1 ,而 ABI1和ABI2是脱落酸(ABA)信号传导过程中的关键因
子 ,推测 Fibrillin作为负调控因子 ,参与到 ABA 信号传导途径[ 11] .同时它还参与到保护光合器官和光系
统的作用中[ 10 , 11] .油菜中的 Fibrillin同源物与油质体相关[ 4 ,12] .因此在本实验中 ,以拟南芥和油菜为植物
材料 ,观察了拟南芥中的 Fibrillin操纵子在拟南芥和油菜原生质体中的表达调控 ,以及加入 ABA 后报告
基因表达量的变化.该研究将有助于了解Fibrillin与ABA信号传导之间的关系.由于 Fibrillin与油质体相
关 ,能增强植物对外界环境的适应能力 ,保护光合系统 Ⅱ ,因此 ,推测该基因在油菜中的过量表达可能有利
于提高油菜抗逆能力和产油量.
1　材料和方法
1.1　材料 、试剂和仪器
1.1.1　植物材料　野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)RLD由德国慕尼黑工业大学植物研究所 Erw in
Grill教授惠赠 ,甘蓝型油菜(Brassica napus)品种蜀杂 9号为本实验室保存.
1.1.2　菌种及质粒　大肠杆菌菌株 DH5α为本实验室保存 ,pBI221 质粒为德国慕尼黑工业大学植物研
2006年 12月
第 43卷第 6期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edi tion)
Dec.2006
Vol.43　No.6
究所 Erwin Grill教授惠赠.
1.2　方法
1.2.1　载体构建　用 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切 pBI221的 35S启动子 ,连接具有相同粘性酶切位点的
Fribrillin启动子 PRF(1.7kb ,使用上游引物 5 -T TAAAGCTTATGAAACATCG TCAGATC-3 ,下游引物
5 -AATGGA TCCTGTGTTTGTTCTTCAGAGAAACC-3 做菌落 PCR检测重组子).用 BamH Ⅰ和 Ecl
136Ⅱ双酶切 β-葡萄糖苷酶(GUS)基因 ,连接具有相同粘性酶切位点的荧光素酶(LUC)报告基因.通过菌
落 PCR检测 ,双酶切重组质粒 ,结果显示所需片段已连接到载体上.
1.2.2　原生质体制备　取生长了 5 ～ 7d的油菜幼苗下胚轴 ,从中间纵切 ,再横切成 1厘米左右的片段 ,放
入酶解液(1%Cellulase R-10 ,0.25%Macerozyme R-10 , 4×10-1mol/L 甘露醇 , 8×10-3mol/LCaCl2 ,1%
BSA ,5×10-3mol/L MES-KOH ,pH 5.6)中 ,23℃,50r/min ,酶解 12 ～ 16h.然后用 150目的尼龙网过滤酶
解液.加入清洗溶液 1(167×10-3mol/ L甘露醇 ,133×10-3mol/L CaCl2), 500r/min离心 ,弃上清 ,保留下
层的原生质体溶液 ,再依次加入清洗溶液 2(333×10-3mol/L 甘露醇 ,67×10-3mol/L CaCl2)和 Magma 溶
液(400×10-3mol/L 甘露醇 ,15×10-3mol/L M gCl2 , 5×10-3mol/ L MES-KOH , pH 5.6),按照清洗溶液
1的做法各洗涤一次 ,最后重悬于 Magma 溶液.通过荧光素双醋酸酯(FDA)染色(1×10-3g/mL ,丙酮中
溶解),荧光显微镜观察并计数测定原生质体的密度.
取生长 4周的拟南芥嫩叶用利刀划破 ,放入酶液(同上),酶解 5 ～ 6h ,其余操作同油菜.
1.2.3　聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化　将质粒 DNA 溶入 5×10-1mol/ L的甘露醇中 ,再加入 5×
105/mL油菜原生质体 ,最后加入等体积的 PEG溶液(3×10-1mol/LCaCl2 ,40%PEG-4000 , 5×10-3mol/L
MES-KOH ,pH5.8),室温放置 30min.然后加入清洗溶液 WI (5×10-1mol/ L 甘露醇 , 20×10-3mol/L
KCl ,1%BSA ,4×10-3mol/L MES-KOH , pH 5.8)洗涤 , 500r/min离心 2min ,弃上清 ,保留原生质体部分 ,
再加入WI洗涤一次 ,最后加入一定WI ,23℃,50r/min过夜培养 24h.需要使用 ABA 诱导的原生质体 ,再
加入 3×10-5mol/L 的 ABA培养.
拟南芥原生质体的转化过程同上 ,但在加入 PEG后室温放置只需 10min.
1.2.4　蛋白提取　将经 PEG转化并培养一段时间的原生质体溶液离心(500r/min , 2min),吸去上清 ,加
入100μL 的细胞裂解液 CCLR(25 ×10-3mol/ L Tris 磷酸缓冲液 pH 7.8 , 2 ×10-3 mol/L EDTA ,
2×10-3mol/L 1 ,2-diaminocyclonhexan-N ,N , N ,N -tet raessig acid , 10%甘油 , 1%Triton X-100),液氮中
放置约 1min ,再高速离心即可裂解细胞.上清液为蛋白提取溶液.
1.2.5　报告基因检测　将蛋白提取溶液分为两份 ,一份进行GUS 报告基因的检测 ,另一份进行 LUC 报
告基因检测.GUS报告基因的检测按照 Futterer 方法进行[ 13] .LUC报告基因则按照 Luehrsen方法进行检
测[ 14] .
2　结果
2.1　重组质粒的检测
菌落PCR方法检测 pBI221-AtPRF 重组子 ,在 1700bp处可见清晰条带(图1).LUC报告基因的检测也得
到相同结果.双酶切检测的结果进一步证实了 Fibrillin启动子和 LUC基因已正确连入 pBI221质粒(图 2).
2.2　原生质体观测
在荧光显微镜下观测已制备好的原生质体 ,滤光片为 BG38(蓝色滤光片).采用 FDA 染色后 ,制备良
好 ,具有活性的原生质体呈浑圆形 ,发绿色荧光.图片中所示为有活力的原生质体(图 3).
1395第 6期 滕蕾等:Fibrillin操纵子在甘蓝型油菜和拟南芥中的瞬时表达
图 1　PRF-LUC的 PCR扩增图
Fig.1　Gel electropho resis of PRF product
图 2　PRF-LUC 的双酶切图
Fig.2 　Double restriction enzyme analysis
of PRF
图 3　拟南芥和油菜的原生质体图
Fig.3　Protoplast in fluorescent microscope
左图为拟南芥 ,右图为油菜
2.3　报告基因检测
由Fribrillin操纵子启动的 LUC报告基因的表达将通过组成型的 35S 启动子启动的 GUS 基因的表
达加以标准化分析.我们分析了表达载体质粒转化到拟南芥和油菜原生质体中 ,报告基因 LUC 在存在
ABA和没有 ABA处理的情况下 ,表达发生了较明显的变化 ,结果如下:将 20μg 的 PRF-LUC 和 50μg 的
35S-GUS转入原生质体中进行培养 ,24h后取部分加入 30μmol/L ABA ,再培养 16 ～ 24h ,提取蛋白进行分
析 ,发现在拟南芥原生质体中加入 ABA 的报告基因表达量比未加入 ABA的表达量增高了近 2倍(图 4-
A).油菜原生质体的总体表达水平远远低于拟南芥 ,但加入 ABA 的部分仍比未加入的部分报告基因表达
量上调了 2倍左右(图 4-B).
3　讨论
外源核酸直接导入植物原生质体进行瞬时表达是分析植物基因表达及其调控的一种简便快速的方
法[ 15] .在本实验中 ,我们将带有拟南芥 Fibrillin操纵子的质粒 pBI221分别导入油菜和拟南芥原生质体中
并实现了 ABA 调控下的瞬时表达.实验中我们发现了值得思考的两个问题:
3.1　PEG 介导的原生质体转化效率
PEG溶液的 pH 会影响原生质体瞬时表达效率.程振东等[ 16]认为 pH 值为 8时 PEG 溶液对油菜的转
化效果较好 ,但在本研究中 ,就荧光素酶表达体系而言 ,偏酸性的 PEG溶液效果较佳.同时加入 PEG 后放
置时间在 30min以上的油菜原生质体转化效率较高.此外 ,针对是否添加携带 DNA(carrier DNA)的实验
1396 四川大学学报(自然科学版) 第 43卷
证实 ,两者无显著差异.由于实验中制备的原生质体质量较差 ,导致 PEG 介导的原生质体瞬时表达系统重
复性和效率不高 ,在以后的实验中我们将继续优化该系统.但总的说来 ,原生质体瞬时表达可以快速简单
的测定外源基因是否转移到细胞中 ,因此仍具有较大的应用价值.
图 4　原生质体中的瞬时表达
Fig.4　T ransient expression of luciferase in pro toplast
A 为拟南芥原生质体中荧光素酶的表达量 , B为甘蓝型油菜原生质体中荧光素酶的表达量.加 30μmol/ L ABA后 ,
荧光素酶的表达量均有近两倍的增长(实验结果是经 3次以上重复后的统计结果)
3.2　ABA提高 Fibrillin操纵子表达效率的原因
在拟南芥中 ,加入ABA的原生质体的荧光素酶的表达量比对照提高了近两倍 ,油菜中 ,加入 ABA 24h
左右也可检测到荧光素酶的表达量提高了近两倍 ,说明 ABA能诱导 Fibrillin基因的表达.通过对拟南芥
Fibrillin启动子序列的分析 , 我们发现存在一个 ABA 反应元件(ABRE), 序列为 CACGTGTC , 位于
-142 ～ -134bp处.此外 ,ACGTGGC和 ACGTGTC 也被证实为含有 ACGT 的 ABRE.因此 ,Fibrillin启动子
上的ABRE与含有 ACG T 的 ABRE序列相吻合.这类 ABRE 元件的存在可能能解释 Fibrillin 启动子受
ABA诱导而上调[ 17] .但从表达量来看 ,拟南芥中的表达量远远高于油菜 ,说明拟南芥来源的操纵子在油
菜细胞中的启动表达效率不高.
为了更好的验证 Fibrillin在ABA信号传导中的作用 ,我们正在把 Fibrillin cDNA导入油菜中 ,希望获
得稳定表达的转基因植株 ,从而进一步验证 Fibrillin在 ABA 信号传导过程中所起的作用.
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Transient Expression of Fibrillin Promoter in Protoplasts
of Arabidopsis thaliana and Brassica napus
TENG Lei , HUANGJ in , ZHAO Zhu-lu , LI X u-feng , Y ANG Yi
(Key Laboratory of Bio-resource and Eco-environment , Ministry of Education ,
College of Life Science , Sichuan University , Chengdu 610064 , China)
Abstract:Arabidopsis fibrillin promoter w as constructed in pBI221 , and the plasmid w as transferred into pro-
toplasts of Arabidopsisor Brassicavia PEG-mediated method , show ing a transient expression.After adding
30μmol/L ABA , it w as found that the expression w as upregulated , indicating f ibrillin is sensit ive to ABA in
both Arabidopsis thaliana and Brassica napus.
Key words:fibrillin promo ter;luciferase;PEG-mediated transformation;transient expression;ABA
1398 四川大学学报(自然科学版) 第 43卷