全 文 ：半乳糖苷酶的研究进展
高秀容 马力 叶华
(西华大学生物工程学院, 成都 610039)
摘 要: 对半乳糖苷酶的性质及作用机理作概述, 同时对利用生物技术进行半乳糖苷酶基因克隆和表
达的研究概况进行了简要介绍。
关键词: 基因克隆 基因表达 半乳糖苷酶
Research Advancement of Galactosidase
Gao Xiurong Ma Li Ye Hua
( School of Bioeng ineering , X iH ua Univ e rsi ty , Chengdu 610039)
Abstract: The art icle pr ecisely intr oduced the chemisty kind o fgalactosidase and it s function mechanism. A l
so repo rted the development o f gene cloning and expression o f this enzyme by bio technolog y.
Key words: Gene cloning Gene expression galactosidase
半乳糖苷酶( EC3. 2. 1. 23)学名为 D半乳
糖苷半乳糖水解酶, 常用名为乳糖酶,该酶能将乳糖
水解成为半乳糖与葡萄糖, 也具有半乳糖苷的转移
作用。
半乳糖苷酶的天然来源十分丰富,包括多种
植物、动物和微生物。半乳糖苷酶存在于扁桃、杏
等植物及幼小哺乳动物的小肠中, 细菌、霉菌和酵母
等微生物经发酵亦可产生半乳糖苷酶。其中细菌
中的乳酸菌、环状芽抱杆菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、
产气肠细菌等; 霉菌中的米曲霉、黑曲霉、琉球曲霉、
黄青霉、炭色曲霉等;酵母中的脆壁克鲁维酵母和乳
酸克鲁维酵母、热带假丝酵母等;放线菌中的天蓝色
链霉菌等均产半乳糖昔酶。由于微生物的快速生
长和高效代谢的生物学特性, 使其成为工业化酶制
剂的主要来源。
1 半乳糖苷酶的性质
半乳糖苷酶根据不同来源可分为胞内酶或胞
外酶[ 1] ,如乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根酶等产
半乳糖苷酶均为胞外酶, 脆壁克鲁维酵母和大部分
细菌产胞内酶。霉菌作用最适 pH 偏酸性( pH 2. 5
~ 5. 0) ,酵母和细菌所产 半乳糖苷酶最适 pH 近
中性(分别为 pH 6~ 7和 pH 6. 5~ 7. 5)。因此, 最
适 pH 决定了各自的用途,如霉菌所产 半乳糖苷
酶使用于酸性乳清和干酷的水解(含大量乳糖) , 酵
母和细菌半乳糖苷酶适于牛乳( pH6. 6)和鲜乳清
( pH 6. 1)的水解 [ 2]。
微生物 半乳糖苷酶最适作用温度范围较宽,
酵母半乳糖苷酶作用温度在 35 左右, 而霉菌最
适作用温度一般在 50 以上, 最高可达 60 ,环状
芽抱杆菌则可达 65 ,嗜热水生菌则为 80 ,耐高
温微生物菌株使用时可避免杂菌污染 [ 2]。
从不同物种提取的 半乳糖苷酶其蛋白质序列
有着较高的同源性和相似性。[ 3] Thermus sp. str ain
T 2中的半乳糖苷酶与来源于 Haloferax alicantei
的 半乳糖苷酶有 41%的同源性和 65%的相似性;
与来源于 Bacillus stear othetmophilus 的酶有 32%
的同源性和 58%的相似性;与来源于 Bacillus circu
lans有 30%的同源性和 59%的相似性。保加利亚
乳酸杆菌半乳糖苷酶与原GeneBank中Gala序
列同源性比较结果表明,在测序的 3 485bp中,只有
3个碱基与原序列 3 660bp 不同, 同源性高达
99. 9%
[ 4] 。
2 半乳糖苷酶的作用机理
早期的研究表明[ 5, 6] ,半乳糖苷酶上的 CyS的
收稿日期: 20041225
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 3期
巯基和 His上的咪唑基对半乳糖苷酶水解乳糖起
重要作用。根据推测, 巯基使得糖苷键的氧原子质
子化, 而咪唑基作为亲和试剂进攻糖基的 C, 形成一
个含碳- 氢键的共价中间物。在半乳糖基被切割下
米之后,巯基阴离子从水分子抽取一个质子, 从而形
成 OH进攻 C。在反应的各个步骤, 异头碳的构型
没有变化。因而, 由乳糖酶催化水解的产物仍然保
持原来的 构型。近来的研究认为乳糖酶的催化机
制与溶菌酶类似。即有一基团作为碳提供一个质子
给糖苷键的氧原子, 另一带负电的基团可能通过形
成过渡态的共价键来稳定中间过渡物糖苷上带正电
的碳原子。过程为: 酶+ 乳糖酶 乳糖( 1)酶- 乳糖
半乳糖苷- 酶+ 葡萄糖( 2)半乳糖苷- 酶+ 受体
半乳糖苷- 受体+ 酶( 3)反应第 3步酶将 半乳
糖苷酶转移给含羟基的亲核受体。当受体是水则生
成半乳糖,受体是糖则生成二糖、三糖和其他相应的
半乳糖苷低聚糖。这些产物反过来又可以作为底物
被酶缓慢水解。因此, 乳糖的水解反应可视为是半
乳糖苷转移反应的特殊情况, 即以水作为半乳糖苷
的受体。在大多数情况下, 由于反应体系中水的高
浓度使水解反应占主导地位, 低聚半乳糖的生成量
很少。
3 半乳糖苷酶的基因克隆与表达
3. 1 半乳糖苷酶基因的克隆与在微生物中的表
达
3. 1. 1 在大肠杆菌中的克隆和表达 因大肠杆菌
的遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操
作等的特点, 半乳糖苷酶基因大都在大肠杆菌中
克隆和表达得到的酶都比在原来的菌株中的酶的活
力高。刘爱兵[ 5] 等以乳酸克鲁维斯酵母( Kluyvero
myces lact is)菌株 k528的基因组 DNA 为模板, 用
Tap Plus 酶 PCR 扩增乳糖酶基因, 获得重组质粒
T1549,经 SnaB I、Not I 双切, 半乳糖苷酶基因插
入到表达载体 pET30a(经 EcoR 、No t I 双酶切)
上构建重组表达质粒 pETlac4, 将 pET lac4 电击转
化到大肠杆菌 BL21中表达, 经酶活测定, 比酶源菌
产生的酶活提高 1. 5倍。王元火[ 7] 等将环状芽抱杆
菌中的 半乳糖苷酶基因经 PCR 扩增、EcoR I 和
Pst I双酶切后克隆在 pUCl9上,再经 E coR I和 P st
I双酶切后与表达质粒 pKK2233(经 EcoR I 和 Pst
I双酶切)连接, 转化到大肠杆菌 JM l09。表达的
半乳糖苷酶 Km比原始酶小 285倍、Vmax比原始酶大
5. 4 倍, 原始酶在环状芽抱杆菌的表达量为 20.
98U / ml,而在大肠杆菌中的表达量提高到33. 102U/
ml。
葛佳佳[ 8] , 陈卫[ 9] 等从嗜热脂肪芽抱杆菌中用
PCR技术克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因
bgaB,平端连入 PblueScript 中,经 No t I和 Sal酶
切后构建具 T7 强启动子的 PET2( b)bga B 质
粒[ 8] ,并在大肠杆菌 BL21 ( DE3 )中进行表达, 经
IPTG 诱导后, 重组菌周质中乳糖酶酶活达到0. 12
U/ m l,胞内酶活为 1. 35U/ m l, 比酶活为 6. 66U / mg
蛋白,比酶源菌产生的酶活提高 90倍。
E. Poluri等[ 10] 将从 T hy ssanoessa macrura 鳞
虾营养食谱中得到南极细菌P seudoal ter omonas sp.
22b的胞内耐寒 半乳糖苷酶基因在埃希氏菌属内
进行了克隆和表达,在 40 和 pH6. 0~ 8. 0有最大
活力, 30 保温 6h 和 15 保温 28h 将水解牛奶中
90%的乳糖。John Kidw ell[ 11]等研究了在有 tac 和
tr p 存在下 半乳糖苷酶在埃希氏菌属的表达情况。
因 GlnAP2在 glnL/ pta存在下,在埃希氏菌属大肠
杆菌中能非常有效的促进细胞的突变, T . S.
Chang[ 12] ,等将 GlnAP2调节促进 T 7 RNA 聚合酶
基因与 T7控制促进 半乳糖苷酶基因在人造细菌
染色体中整合, 并在大肠杆菌中进行了高效的表达。
3. 1. 2 在巴斯特毕赤酵母中的克隆和表达 刘爱
兵[ 5]等将乳酸克鲁维斯酵母 半乳糖苷酶基因 K lac
在巴斯特毕赤酵母中进行了表达: 乳酸克鲁维斯酵
母 DNA 为模板, 利用 PCR 技术获得重组质粒
T1549,经 SnaB I、N ot I 双切, 将 K lac 基因插入到
载体 pPIC9上构建重组表达质粒 PIC9154983,电击
转化巴斯特毕赤酵母受体菌 GS115, Klac基因整合
到 GS115基因组中, 胞内均检测到有活力的 半乳
糖苷酶。我国科学工作者将外源新 半乳糖苷酶基
因在毕赤酵母中得到高效表达[ 13] , 其表达产物分泌
于胞外,产量达到每升 6克( 6g/ L ) ; 半乳糖苷酶基
因于宿主酵母菌中的表达产物乳糖酶的活性为每升
3 600单位,比目前国际上报道的工程米曲霉最高
表达产量高出 6倍。
3. 1. 3 在其他菌属中的克隆和表达 半乳糖苷
192005年第 3期 高秀容等: 半乳糖苷酶的研究进展
酶也有在其他菌中表达的。张灏[ 14] 等将嗜热脂肪芽
胞杆菌的耐热 半乳糖苷酶基因 bgaB克隆到枯草
芽胞杆菌穿梭质粒 pMA5中, 然后将外源基因及其
表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合载体
psAsl44中,转化 Baci llus subti li s 受体菌 BDl70,在
5 g / ml的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子。经
摇瓶发酵后, 得到耐热乳糖酶的比酶活为 0. 32U/
mg, 是出发菌株比酶活的 2 倍。T. Kana[ 15]等用从
热带假丝酵母中得到的异柠檬酸裂合酶基因促进子
将从大肠杆菌中分离得到的 半乳糖苷酶基因
( lacZ)在酿酒酵母细胞中进行了表达。
3. 2 半乳糖苷酶基因在植物中的克隆和表达
目前报道的有在海藻[ 16, 17] 中。方法是基因枪
法: 将滤有雄配子体的筛绢置于培养皿中央的有效
轰击区内,轰击压力选择 1100psi,距离为 6cm, 采用
PDS1000/ He基因枪将半乳糖苷酶基因( lacZ )导
入裙带菜雄配子体中, 一部分诱导形成营养增殖的
丝状体,另一部分和雌配子体受精生成抱子体。5个
月后组织化学染色结果表明 5%的抱子体个体和
30%的丝状体细胞表现了 lacz 的稳定表达, 利用
PCR和 PCRScluth检测得到预期的阳性信号。
3. 3 半乳糖苷酶基因在动物中的克隆和表达
E. Poluri等 [ 18]运用 CH OK 1细胞线克隆高活
力半乳糖苷酶: 在中国小鼠卵巢细胞上, FLP 重组
能有效的进行细胞定点切除。质粒 DNA ( pN eo
Gal) 被转换到 DH 5细胞( competent 细胞)里。用
钙磷酸盐转染方法把质粒 DNA 转染到 CH O细胞。
这些细胞在CO2孵卵箱( 5% CO 2 )内,在37 下孵卵
48小时。然后,在媒介中加入新霉素抗生素以促进
抗生素抗体的克隆并再转入到 FLP 重组载体上
( POG44)。经 XGal染色后重组克隆基因现出非常
清晰的蓝色条带。同时, M an Bock Gu[ 19] 等将来源
于大肠杆菌的 半乳糖苷酶( lacZ)基因在 CHO 细
胞代谢循环过程中的表达情况进行了研究。
4 讨论
4. 1 半乳糖苷酶基因由于具有来源方便、稳定、
产物易于检测、不影响其他表达蛋白等优点被广泛
应用于基因研究的各个方面。半乳糖苷酶作为胞
内酶或胞外酶存在于不同种类的微生物体内外, 目
前商业用酶源一般认为酵母(如乳酸克鲁维酵母、脆
壁克鲁维酵母)最为安全,另一种为黑曲霉。但半
乳糖苷酶在原始菌株中的分泌含量太低, 难于提取,
因此将原始菌株中的 半乳糖苷酶基因提取出来,
用 PCR技术克隆, 在其它的菌株中进行高效表达,
已成为现在获得大量 半乳糖苷酶的有效途径。
4. 2 因大肠杆菌属遗传背景已研究的比较透彻,现
已作为表达半乳糖苷酶的主要菌属。部分 半乳
糖苷酶(例如嗜热芽孢杆菌半乳糖苷酶)在大肠杆
菌中已得到高效表达。然而, 有些来源的 半乳糖
苷酶(例如乳酸克鲁维酵母半乳糖苷酶)基因在大
肠杆菌中的表达量底,成本高。而且,大肠杆菌表达
系统表达的酶一般都是胞内酶, 不易获得分泌型的
表达酶。
随着工业的发展和市场的需求,稳定的、可分泌
外源 半乳糖苷酶基因的表达系统,日渐成为需要。
巴斯特毕赤酵母表达系统[ 20, 21] 具有:具有强有力的
乙醇氧化酶基因启动子, 可严格控制外源蛋白的表
达;营养要求低、生长快、培养基廉价,便于工业化生
产等优点,更重要的是其表达量高,许多蛋白可达 g /
L 以上水平以及在 P. pastor is 表达系统中既可获得
胞内表达酶,更可以获得分泌型的表达酶。因此,巴
斯特毕赤酵母表达系统很可能成为分泌表达 半乳
糖苷酶基因的又一重要的表达系统。但目前外源
半乳糖苷酶基因用此系统表达的研究报道还比较
少。
4. 3 酶基因可以通过克隆引入不同的基因片段的
手段来修饰酶的一些特性。但国内目前还没有有关
外源 半乳糖苷酶克隆修饰后表达的研究报道。外
源半乳糖苷酶可通过引入不同的基因片段对其特
性进行改进,如提高此酶在表达系统中的表达量,提
高其耐热性、耐酸性等性质。这样可以大大提高外
源半乳糖苷酶在工业中的生产量, 根据其修饰后
的性质扩充其应用范围。
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20 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 3期
不应求状态。现在除美国和英国外, 利用流式细胞
仪进行分离精子研究的国家还有瑞士、日本、澳大利
亚、德国和阿根廷等国。
中国分离精子研究起步较晚,但发展非常迅速。
广西大学动物繁殖研究在 2002年购入一台流式细
胞仪,率先在国内开展了分离精子性别控制的研究,
现已初步建立了分离黄牛、水牛和山羊 XY 精子的
方法和步骤。此外, 目前还有东北、内蒙等地也购入
了流式细胞仪, 开展分离精子的研究。国内商业化
的公司也正在跃跃欲试, 瞄准了这一块市场大蛋糕。
2004年 8 月底, 中美合资的 XY种畜公司在北京成
立, 准备批量购入流式细胞仪进行大规模分离生产
良种公牛 XY精子。这标志着我国分离精子的推广
应用正式展开。可以预见, 分离精子性别控制技术
的推广应用, 将大大提高我国相对落后的乳用牛和
肉用牛产业的生产效率, 缩短本地畜种品种改良的
繁育周期, 对我国整个畜牧业的产业结构调整和长
远发展将起到巨大的推动作用。
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