全 文 ：第25卷 第1期
2013年1月
Vol. 25, No. 1
Jan., 2013
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2013)01-0113-06
收稿日期：2012-07-30；修回日期：2012-09-10
*通信作者：E-mail: jingshenrong@163.com
固氮分子机理及固氮基因转移研究进展
马贵兴，井申荣*
(昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650504)
摘　要： 生物固氮在自然界生态系统氮循环中发挥重要作用，也在农林业生产中具有重大的潜在应用价值。
固氮是一个多基因调节，多种相关分子参与的过程。为了阐明固氮中各基因的作用以及相关分子过程，科
学家进行了长期深入的研究，以期最终能够使现有不能固氮的作物获得固氮能力。对近几年固氮中相关分
子研究进行总结，希望获得对固氮分子机理的及固氮基因转移研究进展的总体认识。
关键词：固氮；分子机理；固氮转移
中图分类号：Q939.9；Q78；S154.3　　文献标志码：A
Research advances in molecular mechanism of
nitrogen fixation and gene transformation
MA Gui-Xing, JING Shen-Rong*
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650504, China)
Abstract: Biological nitrogen fixation not only plays an important role in the nitrogen cycle, but also has
significant potential value in agroforestry production. Nitrogen fixation is a process of multiple-gene regulation
and involves a variety of related molecules. In order to clarify the role of each gene and related molecular
processes in nitrogen fixation, make non-nitrogen fixing crops getting the ability of nitrogen fixation, scientists had
many long-term studies. This review is intended to summarize the molecular mechanism of nitrogen fixation, to
help obtaining the overall understanding in the molecular mechanism of nitrogen fixation and nitrogen fixation
gene transformation.
Key words: nitrogen fixation; molecular mechanism; nitrogen fixation transformation
自然界存在着一类微生物，能够将氮气转化为
生物可利用的氨，称之为固氮微生物。在人类农业
生产活动中，为了增加粮食产量，大量施用氮肥。
这些氮肥往往是在高温、高压下，通过催化剂的作
用，由 H2与 N2反应合成。该反应需要消耗大量的
能量，也会对环境造成污染。此外，长期使用无机
氮肥也对农田土质造成了一定的负面影响，大量使
用化学肥料也会对水源等造成污染。
为了解决这些问题，许多研究者将目光转向了
自然界存在的固氮机制——生物固氮。但是生物
固氮只存在于微生物和可与固氮微生物共生的豆科
植物等中，而作为人类粮食主要来源的禾本科作物
如水稻、小麦、玉米等却普遍没有固氮能力。科学
家为了将固氮微生物的固氮能力转移到禾本科作
物，或改善现有可固氮豆科作物等的固氮能力，对
固氮微生物的固氮机制及其与豆科植物的相互作用
等方面进行了大量的研究。
1　固氮酶及固氮反应
1.1　固氮酶
固氮过程中最重要的是固氮酶 [1]。经典的固氮
酶是钼铁固氮酶，研究者还发现有不依赖钼的钒铁
固氮酶和铁铁固氮酶及在热自养链霉菌 (Streptomyces
thermoautotrophicus)中的一种对氧不敏感的固氮酶
系统 [2]。在钒铁固氮酶系统和铁铁固氮酶系统中是
由钒原子或铁原子将钼原子取代，一般认为是由于
生命科学 第25卷114
环境中钼含量较低时的一种替代性固氮酶系统。大
部分固氮微生物采用的是第一套也就是钼铁固氮酶
系统，其固氮能力也较其他系统为高，对于该固氮
酶系统的研究也较为深入。
固氮酶是由固氮基因 nif编码的，根据来源不
同，通常 nif位于细菌染色体或质粒上，不同物种
的固氮酶基因有着较高的同源性 [3]，并在自然界中
有着广泛的分布 [4]。在钼铁固氮酶系统中，该基因
为 nifK、nifD、nifH(或合称 nifHDK)等，编码的钼
铁固氮酶由两个组分组成，即钼铁蛋白 (MoFe蛋白 )
和铁蛋白 (Fe蛋白，或称铁氧还蛋白 )[5]。其中
MoFe蛋白是 α2β2四聚体，相对分子质量一般为
2.20×105~2.45×105 ，Fe蛋白是 γ2二聚体，相对分子
质量约为 6.5×104。两种组分中单独的任何一个并
没有固氮酶活性，只有结合在一起才能发挥固氮酶
的作用。一般认为固氮酶催化的反应可以书写为如
下的形式：N2+8H
++8e-+16ATP→2NH3+H2+16ADP+16Pi。
钼铁固氮酶模式见图 1[6]。
图1　钼铁固氮酶模式图[6]
1.2　固氮反应的电子传递
为了实现最终的固氮转移和人工模拟生物固
氮，固氮酶结构及固氮反应的电子传递长期以来是
固氮研究的重要方面。
生物固氮是一个耗能过程，必须有ATP的参与。
在固氮酶的钼铁蛋白组分中有两个含有金属原子的
活性中心，即M-簇 (FeMo-辅基 )和 P-簇。其中 FeMo-
辅基被认为是与 N2络合的活性中心，而 P-簇则在
催化固氮反应中参与电子传递过程 [7-8]。根据文
献 [9-10]提出的固氮酶催化模型和随后得到的X射线衍
射电子密度图，M-簇是由MoS3Fe3和 FeS3Fe3这两个
具有缺口的类立方烷型簇合物通过三个非蛋白配体
桥联而成 [11]。FeMo-辅基的化学结构见图 2[12]。
在催化过程中，氮气分子与M-簇结合，电子
由 Fe蛋白传递给MoFe蛋白的 P-簇，然后通过 P-
簇再将电子传递给M-簇，进而完成 N2的还原。在
该反应过程中，MgATP结合到 Fe蛋白和MoFe蛋
白上，通过水解释放能量，驱动该催化反应的进行，
此外，MgATP与 Fe蛋白的结合也可以改变其构象
及电势，促进 Fe蛋白与MoFe蛋白的结合 [13]，也
有利于反应的进行。
2　固氮基因调节
常见的钼铁固氮酶是一种氧敏感酶，即在氧气存
在的情况下会导致其酶活性的丧失。除此之外，还有
许多物质都会造成固氮酶的活性下降，如 H2、CO、
马贵兴，等：固氮分子机理及固氮基因转移研究进展第1期 115
CS2等也能通过竞争性或非竞争性的方式抑制固氮
酶活性 [14]。当土壤中大量存在氨或其他氮源的情况下，
也会通过一系列基因调节，降低固氮酶的活性，从而
减少生物固氮的产量，这个现象称为氨阻遏。这些都
和固氮酶的生化特性及固氮基因的调节有关。
典型的固氮酶及其相关基因是以基因岛 (或基
因簇 )的形式存在。在基因岛上除了固氮酶基因外，
还有调控基因以及在共生固氮菌种调节共生的基因
等。因此，固氮功能调节是一个较为复杂的过程。
在肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumoniae)中，固
氮调节基因可分为正调节基因和负调节基因，其中
nifA、ntrC[15]一般为正调节基因，nifL[16]为负调节
基因。许多物质都会因与固氮酶结合影响其生物学
活性，如前文所说的 H2、CO、CS2等，但在自然
情况下影响固氮酶活性的主要是氧气和氮源。此外
也有研究显示，活性氧自由基也会抑制固氮酶的活
性 [17]。在棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii)中，
当氨、硝酸盐或者氨基酸等氮源大量存在时，nifL
表达 NIFL蛋白，从而调节 NIFA蛋白活性，导致
固氮酶合成减少，下调固氮活动 [16]。这可能就是固
氮作用存在氨阻遏的原因。在细胞内氧浓度升高时，
除可直接与固氮酶结合导致酶活性下降外，也会激
活类似的调节机制从而抑制固氮活动。该过程可以
减少因氧气损伤导致的物质及能量浪费。
氮源充足情况下，氨阻遏虽然对于减小固氮菌
能量代谢压力具有十分重要的生理意义，但是在实
际生产活动中却可能是不利的。人们希望在农田中
添加不具有氨阻遏的共生、联合或者自生固氮菌 [18]
以持续增加其氮素积累，丰富土壤中的氮素含量。
而关于固氮基因调节的研究为制备不具有氨阻遏作
用的菌种提供了一定思路。
3　共生固氮中的结瘤作用
3.1　根瘤菌与豆科植物的共生结瘤
在大部分共生固氮中，根瘤菌只有与相应的豆
科植物共生后才能具有固氮作用。而在单独存在情
况下则往往不具有固氮能力。在共生固氮结瘤过程
中，需要结瘤基因 (nod)的调控。在根瘤菌与豆科
植物形成共生作用的过程中，结瘤相关基因的启动
和调节具有决定性作用 [18]。结瘤过程一般认为可以
分为结瘤早期、根瘤发育期和固氮期三个过程，其
中固氮早期植物与根瘤相互作用及相关基因的表达
调控是该方面研究的一个重要方向。
根瘤菌侵染植物主要有依赖于根毛和非依赖于
根毛的过程 [19]，而其中依赖于根毛的过程研究得较
为清楚。在根毛依赖性的侵染中，根瘤菌侵染根毛
是根瘤发育中一个十分关键的过程 (图 3)。现已证明
在固氮早期植物会分泌类黄酮化合物，它在根瘤的
形成过程中起着重要的作用 [20]。根瘤菌在类黄酮化
合物刺激下与植物根毛结合并在植物凝集素 (lectin)
作用下侵入植物根部。类黄酮化合物能够结合到根
瘤菌内膜中，激活细菌的 NodD蛋白发挥作用。这
个过程可能也一定程度上决定了根瘤菌的宿主范
围，这是因为不同的植物会分泌数种不同的类黄酮
化合物，而不同的根瘤菌对不同的类黄酮化合物敏
感性各不相同。宿主范围较宽的菌株，往往能够识
别和应答的类黄酮化合物较多。根瘤菌存在一些表
面多糖，其中与根瘤形成过程相关的主要有酸性胞
外多糖 (EPS)、脂多糖 (LPS)、中性葡聚糖等。不同
根瘤菌的表面多糖具有不同的结构，在根瘤形成过
程中表面多糖可能起着特异性信号分子的作用，这
可能也会影响其宿主特异性。此外，植物生长调节
剂也会对根瘤的发育产生一定的影响 [21]。由于固氮
是一个高耗能的过程，过多的根瘤会造成植物能量
的浪费，反而会影响植物的生长，因此，结瘤数目
也往往受到基因的调控 [22]。而在豆科植物的固氮应
用中，改良根瘤菌特性也是一个具有重要应用前景
的方面，并在抗逆性研究中取得了一定的成果 [23]。
3.2　Frankia菌与非豆科植物的共生结瘤作用
共生固氮菌是一个非分类学意义上的菌群，有着
图2　FeMo-辅基的化学结构[12]
生命科学 第25卷116
较多的种类和多样性 [24]，而且近年来也不断有新的
共生固氮菌被发现 [25-26]，这些对于扩大共生固氮菌的
研究范围有着积极的意义。除豆科植物与根瘤菌之
间能够通过共生固氮外，已发现 Frankia菌能够与
多种非豆科植物 (主要为木本双子叶植物 )共生 [27-29]，
形成根瘤进行固氮，并具有较广的分布和较宽的宿
主种类 [30]。因其共生的为非豆科植物，引起许多研
究者的关注，试图在相关研究中获得突破，使其能
够与禾本科作物共生，形成根瘤进行固氮。
近来的研究显示，与根瘤菌相似，Frankia菌
也需要经过一系列的分子应答才能与宿主植物形成
根瘤，但是其与根瘤菌的根瘤形成有诸多相异之处。
迄今为止，尚未发现nod基因在Frankia菌中的存在。
其耐氧保护机制也与根瘤菌不同，在根瘤菌中主要
依赖于豆科植物合成的豆血红蛋白，而在 Frankia
菌中大量存在藿烷类 (hopanoid)物质，可能与其耐
氧保护有关。此外，其在侵染植物时 Frankia菌需
要水解细胞壁，进入植物体内形成根瘤。在早期感
染中渗透因子 (diffusible factors, DFs)发挥着较为关
键的作用 [31]。这些都与根瘤菌表现出了明显的不同。
在一些情况下，Frankia菌只是定植于植物根部，
而不形成根瘤，说明 Frankia菌与其宿主共生方式
有着多样性。而另有研究显示，与豆科植物与根瘤
菌之间相互作用类似，Frankia菌也受到植物根部
沁出物质的调节 [32]。这些研究为更好了解生物固氮
的多样性，为固氮转移提供借鉴，也在农业生产中
有了一定的应用。
4　固氮转移研究
4.1　固氮转移研究思路
固氮的最终目的是通过生物技术使不具有固氮
功能的作物获得固氮能力。根据现有对固氮过程的
了解，主要思路有如下几个 [18]：一是转移固氮基因
到作物中，通过遗传改造使其获得自主固氮能力，
该方法被认为是最有价值和应用前景的途径；二是
通过化学或其他方法诱导植物结瘤，使植物与根瘤
菌或 Frankia菌共生，获得固氮能力；三是转移固
氮基因到现有植物的共生菌中，使其共生菌获得固
氮能力，进而与植物共生，提供氮素。为了实现禾
本科作物的固氮，许多研究者做出了大量的努力。
4.2　固氮转移研究进展
在诱导结瘤方面，Al-mallah等 [33]研究显示，
利用水解酶处理水稻根细胞壁后，根瘤菌可侵染并
与水稻形成根瘤。该研究也为禾本科植物诱导结瘤
方面提供了新的思路，但由于植株需要水解酶处理，
其实用性较差。共生固氮菌也可以通过植株表皮伤
口进入植物体内，形成具有固氮活性的根瘤 [34]，此
发现提示研究者可通过新的方法诱导非豆科植物结
瘤。除细胞分裂素对根瘤菌诱导形成根瘤有着重要
的作用外 [35]，国内外研究表明，添加人工合成的植
物激素如 2, 4-D等可以诱导促进烟草 [36]和水稻 [37]
根部产生根瘤状结构，并具有一定的固氮活性。其
他植物激素可能也具有类似的作用 [38]，但是诱导产
生的根瘤样组织存在着固氮活性较低的问题。诱导
结瘤的进一步研究也需根瘤菌与宿主植物相互作用
的更为深入的研究作为理论支持。
在改造植物共生菌方面，有研究者将 Frankia
菌和 Streptomyces菌的原生质体融合，形成的融合
子具有两种菌的特征，并且具有较为稳定的结瘤固
氮能力 [39]。而我国也有研究者进行了类似的研究 [40]，
为探索原生质体融合改造菌株，从而获得能够与植
物共生并具有固氮能力的新型菌株提供了借鉴。由
于植物共生菌也属于原核生物，通过基因工程技术
将固氮基因转移到植物共生菌也就具有一定的可行
性。此外，有研究显示丛枝菌根菌 (Arbuscular
mycorrhiza)在与植物共生过程中的Myc因子与 Nod
因子有着相似的结构，而该菌与 70%~90%的陆生
图3　苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)侵染过
程示意图[19]
马贵兴，等：固氮分子机理及固氮基因转移研究进展第1期 117
植物有共生关系 [41]。该发现或许能够为固氮转移提
供新的思路，对于扩展固氮菌的宿主范围具有一定
意义。
较早的研究试图通过转基因技术将固氮酶基因
直接转入真核细胞如酵母菌中，虽然固氮酶基因能
够在酵母中保持遗传稳定性，但是由于真核、原核
基因结构及表达系统的差异以及固氮酶的氧敏感
性，这种方法并不能使酵母获得固氮能力。通过发
根农杆菌 (Agrobacterium rhizogines)和根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefacines)转染，研究者已能够通
过转基因技术将 Frankia菌基因转入木麻黄并形成
根瘤，经测定具有一定的固氮酶活性 [42-43]。这说明
该转基因体系在转移 Frankia菌固氮基因有潜在应
用价值，为利用该方法研究固氮基因转移开展了有
益的尝试，但是转移固氮基因到植物内需要转移固
氮酶及相关调控基因 [18]，难度较大，这可能也是这
方面进展较少的原因。
5　展望
为了实现非豆科尤其是禾本科植物的固氮，从
发现生物固氮开始，许多研究者付出了大量的努力，
并取得了许多重要的成果。由于固氮酶特殊的理化
性质和固氮中复杂的分子机制，固氮研究也还面临
着许多问题和挑战。现已基本阐明固氮酶、固氮电
子传递和相关基因调控的机制；但根瘤菌与宿主间
相互作用还有很多不甚明确的地方，尤其是在
Frankia菌方面，由于其较高的固氮活性和较宽的
宿主范围，可能是禾本科植物固氮研究的突破点。
有报道显示，Frankia菌在非豆科植物诱导结瘤获
得成功，但是诱导后的根瘤样组织固氮能力较弱，
也存在着生产应用操作性不强的问题。在转移固氮
基因到非豆科植物共生菌方面，虽取得了一定的成
果，但尚未有商业化的非豆科植物共生固氮菌菌剂
的报道。此外，对于基因工程菌投放到自然环境中
可能带来的问题也需要进一步的研究。直接转移固
氮基因到非豆科植物中被认为是遗传性稳定、应用
操作性较强的一种方案，但是固氮酶的氧敏感性问
题尚未解决，作为原核基因，其在真核系统中的表
达也存在着许多难题，因此，在这方面进展较为缓
慢。基于理论研究的成果，如共生固氮中分子调节
方面，研究者已经成功诱导了非豆科植物结瘤固氮，
但是，距离最终实现禾本科作物的自生固氮还有一
定的距离。基因工程技术的广泛深入应用和固氮分
子机理的研究为最终实现该目的提供了理论和技术
支持，相信在不远的将来禾本科作物的自生固氮一
定能够实现。
[参　考 文 献]
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